人乳頭瘤病毒分子生物學檢驗技術的研究進展

劉小蓮

賀州廣濟醫(yī)院 廣西 賀州 542800

人乳頭瘤病毒（HPV）是一類多空病毒科、乳頭瘤空泡病毒A屬20面體DNA病毒，HPV基因組中含有8000bp雙鏈環(huán)狀DNA。所有的開放閱讀框（ORFs）全部是一條DNA鏈編碼，可劃分成3個區(qū)域：非編碼上游調(diào)控區(qū)（URR），早期轉(zhuǎn)錄基因主要包括E6、E7、E1、E2、E4、E5，晚期轉(zhuǎn)錄基因L1、L2[1]。早期轉(zhuǎn)錄基因和DNA復制相關，晚期轉(zhuǎn)錄基因編碼衣殼蛋白可促使病毒DNA步入細胞。HPV是造成人體皮膚黏膜鱗狀上皮增殖，病毒步入皮膚黏膜后，主要潛伏在表皮內(nèi)基底細胞內(nèi)，等條件成熟后就會發(fā)病[2]。為盡早確診宮頸疾病，已有很多建立在分子生物學方式的HPV檢測技術問世。本研究總結分析人乳頭瘤病毒分子生物學檢驗技術的進展。

1 HPV與子宮頸癌關聯(lián)

子宮頸癌是女性的惡性腫瘤，全球范圍中每年發(fā)病人數(shù)較多，我國占1/4，尤其是農(nóng)村偏遠其余。臨床急需開發(fā)一類應用便捷，費用低廉的診斷技術。當下，醫(yī)學界依然認為宮頸癌的發(fā)病和高危型HPV感染有一定關系[3]。子宮癌的發(fā)生、發(fā)展過程比較緩慢，即開始是宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN），且以CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期漸進過程呈現(xiàn)，還會可逆性緩緩消退，經(jīng)歷時間較短長。所以，美國癌癥協(xié)會（ACS）、美國陰道鏡與宮頸病理學會（ASCCP）、與美國臨床病理學協(xié)會（ASCP）結合早期檢查HPV，為子宮癌的預防開辟路徑[4]。

高危型HPV持續(xù)性感染只有HPV含量達到一定水平，方會造成細胞學變化、癌前病變。但是，很多感染HPV的女性并未發(fā)展為CINⅡ-Ⅲ期，而是在自身免疫的調(diào)節(jié)作用下清除HPV。我國人群中，HPV感染型別地區(qū)差異甚大，北京地區(qū)會感染HPV 16、58、33、43、56型，浙江地區(qū)的感染主要是HPV 52、16、58、68型，云南區(qū)域主要感染HPV 16、56、58、33、52型[5]。

2 HPV檢測技術

HPV無法在體外培養(yǎng)，當前的檢測技術主要是以分子生物學法。

2.1 建立在信號擴增技術測定HPV

雜交捕獲技術是建立在信號擴增上有效的HPV技術，臨床目前所用的HC-Ⅱ HPV DNA測定試劑盒為此技術的典型代表。用微孔板體外開展核酸雜交，借助化學發(fā)光信號放大方式定性測定樣品中多種高危型的HPV DNA[6]。這種方式全長RNA探針，不會因病毒產(chǎn)生變異對檢測數(shù)據(jù)造成影響，基因不需要擴增，試驗條件不需要特殊，操作簡單，實驗污染概率會降低。世界諸多實驗室研究得出：高危型陽性閾值為1pg /mL，對宮頸病變引起的敏感性進行篩查后高達93.6%。HC-Ⅱ HPV DNA為最早應用美國食品、藥品監(jiān)督管理局（FDA）所證的HPV測定產(chǎn)品，試劑價格昂貴，測定成本高。

高危型HPV DNA測定試劑盒（HPV HR）用酶切信號放大法，定性對14種高危型進行檢測。這種試劑盒的不足之處為無法明確具體型號；對HPV 67、70會產(chǎn)生交叉反應，引起假陽性。試劑費用較高，測定成本略高[7]。Cervista HPV 16 /18測定原理與Cervista HPV HR接近，其所測定的基因型HPV16、HPV 18、70%子宮癌發(fā)生相關。這些產(chǎn)品均是建立在信號放大的基礎上定性測定HPV DNA，因不會影響基因擴增，一定程度規(guī)避假陽性。

2.2 建立在模板擴增技術測定

HPV經(jīng)PCR技術來測定HPV DNA模板，檢測靈敏度較高，但這僅局限在理論上，實踐尚需進一步研究。樣本上10-100拷貝DNA即可檢出[8]。但這種方式的靈敏度、特異度受樣本運輸、保存條件來提取DNA，引物設計與PCR程序的干擾，假陽性率較高。

2.2.1 1型特異性PCR、通用引物PCR

PCR型特異性PCR所針對的是單一型號的HPV所涉及的特異性引物開展PCR擴增，每次試驗僅可檢測一類基因型，分析此基因型型號，但若測定多個HPV基因型別需設計較多的特異性PCR引物，操作程序繁雜，價格較高[9]?，F(xiàn)漸漸通用引物PCR法替代，通用引物PCR為HPV基因保守區(qū)L1區(qū)。通用引物經(jīng)設計后擴增，一次試驗會測定較多的HPV基因型。通用引物PCR擴增時會導致引物錯誤搭配，有效預防退火溫度的上升，以免出現(xiàn)假陽性。當下，最常用的3種通用引物分別是My 09/11、GP5 +/6 +、SPF10，產(chǎn)物的擴增長度分別是450 bp、150 bp、65 bp[10]。擴增產(chǎn)物的大小是影響擴增效率的主要原因，擴增產(chǎn)物片段較小，擴增效率較高。因此，設計引物時，需結合靈敏度需求來評估，擴增產(chǎn)物測定需用瓊脂糖膠電泳，靈敏度不佳，數(shù)據(jù)不易保存。

2.2.2 實時熒光定量PCR

PCR技術是在定性基礎上發(fā)展而來的核酸定量技術。雖然，目前依然難以實現(xiàn)一個PCR反應管中對多個型特異性引物進行測定，但通用引入已廣泛在實時熒光定量PCR展開測定。實時熒光定量PCR主要分成單通道、多通道[11]。前者是在反應管中應用一類熒光物示蹤，操作比較簡單，但每次依然僅能測一項基因。后者是用諸多不同激發(fā)/發(fā)射波長熒光物質(zhì)標記特異性探針示蹤，可在相同反應管中測定各基因型別。AB Analitica公司生產(chǎn)的高危型HPV分型、定量試劑盒充分運用PCR-熒光探針法引導內(nèi)參照。多通道和標本實施PCR擴增，消除取樣誤差[12]。這種方式的不足之處是操作繁雜，對部分型難以分型。Cobas HPV測定試劑盒應用實時熒光定量PCR技術與核酸雜交技術聯(lián)合對多種高危型進行檢測，實現(xiàn)HPV16、18可分型[13]。這種方式的特征是用全自動方式提取目標核酸，做好前期準備，為后續(xù)的PCR與核酸雜交提供便利條件，以免因人工操作造成誤差。其不足之處是需準備特殊儀器，花費成本較高，不利于推廣。

此方法熒光信號對產(chǎn)物進行檢測，不僅可使靈敏度提高，還可每次PCR循環(huán)對數(shù)據(jù)進行搜集，創(chuàng)建實時擴增曲線，準確掌握定域值循環(huán)數(shù)（CT），從起始數(shù)值實現(xiàn)真實的DNA定量。因PCR擴增、產(chǎn)物分析均在相對封管中開展，可充分減少污染概率。這種方式靈敏度、特異度、準確度均較高，線性范圍廣泛，操作簡單，且安全性高，無PCR后處理方式，當前已在hr-HPV DNA檢測應用。薛鵬[14]等學者用這種方式測定的HPV疣體組織中的HPV等型進行檢測，取得靈敏度、特異度、準確度均較高，簡單方便。此方式的工作原理是用應光能量傳遞技術在PCR反應體系中添加熒光探針，在全部PCR反應期間，熒光定量PCR儀即可持續(xù)不斷測定反應體系中熒光信號變化量，等其增加到對應閾值時對應的PCR循環(huán)次數(shù)會被記錄下來。實時熒光定量PCR技術在臨床與生命科學研究各領域中應用，在科研方面定量各類基因的表達分析，提高檢測準確性。

2.2.3 RT-PCR

羅保斌[15]等學者用RT-PCR法測定HPV E6 /E7 mRNA，盡早會發(fā)現(xiàn)HPV感染。APTIMA HPV基因分型為利用RT-PCR技術對14類高危型HPV進行檢測。但這種方法同樣有弊端，難以對具體型別進行確定。

建立在模板擴增技術檢測出的靈敏度較高，會檢測出10-100拷貝HPV DNA，這類低含量的病毒感染需借助自身免疫力，以免引起臨床對應病變。只有當HPV含量到達一定水平方會造成細胞學變化，引起癌前病變。靈敏度較高的測定方式在臨床容易造成假陽性數(shù)據(jù)，避免其引起心理上的恐慌。宮頸產(chǎn)生高度病變時，整合病毒事易產(chǎn)生目標片段變異，應用模板擴增技術來測定，容易漏診。模板擴增技術有一定局限性，如：有一定的假陽性占比，還存在交叉污染問題，操作復雜，應用局限性大。

3 HPV-DNA檢測臨床應用

3.1 宮頸癌與癌前病變篩查

有研究[16]經(jīng)對HPV16、18、31、33開展PCR檢測，同時對宮頸涂片、活檢標本進行分析，病歷診斷數(shù)據(jù)與HPV感染狀況開展相關性分析。數(shù)據(jù)說明HPV陽性率和高度鱗狀上方皮內(nèi)病變（HSIL）組織細胞病理診斷呈相關性。還得出HPV測定數(shù)據(jù)陽性ASCUS和組織學異常對應，但HPV陰性者不同。所以，說明高危HPV-DNA檢測在宮頸癌初篩中可充當巴氏涂片有利對診斷進行輔助。

有研究[17]通過對比HPV-DNA測定、細胞學、陰道鏡檢查在高度宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ、CINⅢ）、癌變患者初篩中的效用，表示對中年婦女開展高危HPV-DNA測定，結果呈陰性時，宮頸癌預防性篩查時間可得到延長。

有研究[18]用HC-Ⅱ技術測定高危HPV型別，預測巴氏涂片上反復產(chǎn)生ASCUS、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LGSIL）者有CINⅡ、CINⅡ可能性。這說明高危HPV陽性數(shù)據(jù)和CINⅡ、CINⅢ是高度相關性。

3.2 宮頸病變治療后癌前預報

有研究[19]對收治的75例CINⅡ、CINⅢ患者開展前瞻性研究，為患者開展錐切術后有選擇的決定是否開展子宮切除。手術在開展前與切除子宮時均需開展HC-Ⅱ系統(tǒng)開展高危HPV-DNA測定。發(fā)現(xiàn)子宮切除術前采用宮頸拭子取得的細胞中，其HPV-DNA狀況和子宮切除術殘余病變對用。說明開展錐切術后開展HPV-DNA監(jiān)測對殘余的宮頸上皮內(nèi)瘤變有預測效果，靈敏度與陰性預告值均較高。

有研究[20]經(jīng)對CINⅡ、CINⅢ患者處理后開展高危HPV-DNA檢測，發(fā)現(xiàn)處理后半年時所測的高危HPV陽性率比細胞學異常數(shù)據(jù)預測價值更高。特異性接近時，靈敏度為90%、62%。

4 展望

綜上所述，HPV DNA測定與分型技術的高速發(fā)展下，宮頸癌、癌前可進行預防與篩查，在診斷與預后上發(fā)揮作用顯著。宮頸癌高發(fā)區(qū)域，HPV測定聯(lián)合細胞學測定檢查宮頸癌價值較高。較之發(fā)達國家，我國宮頸癌防治中的不足是性能不佳，價格較低，容易普及，盡早開展篩查，選擇質(zhì)量高的診斷試劑，不斷改進不足之處，實現(xiàn)檢測技術的創(chuàng)新。