胎球蛋白-A 調控糖尿病腎病足細胞損傷機制研究

戢晴 陶海英 吳海燕 丁國明

1.臺州市第一人民醫(yī)院腎內科，浙江臺州 318020；2.臺州市第一人民醫(yī)院內分泌科，浙江臺州 318020；3.臺州市第一人民醫(yī)院感染科，浙江臺州 318020；4.臺州市第一人民醫(yī)院腎內科，浙江臺州318020

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種以尿蛋白升高、腎小球濾過率下降、心血管病風險增加為特征的疾病[1,2]。DN 是糖尿病終末期腎衰竭的主要表現，具有較高的發(fā)病率和致死率[3]。足細胞是位于腎小球基底膜外側的一種高度分化的細胞，當受到免疫或非免疫介導的介質攻擊時，足細胞受損導致蛋白質丟失[4]。研究證實，胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，Fetuin-A）在蛋白酶活性的調節(jié)和炎癥因子分泌的抑制中可以發(fā)揮一定的生物學作用[5,6]。相關研究表明，Fetuin-A 高表達會導致足細胞損傷，可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體機制尚不清楚。因此，本文旨在探討Fetuin-A 調控糖尿病腎病足細胞損傷的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康SD 成年大鼠15 只[山東大學，實驗動物許可證號：SYXK（魯）2020 0022]，鼠齡6～10 周，體質量（200±10）g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，經動物倫理委員會批準（倫理審批號：WYZLL[2016]1601）。喂養(yǎng)7d，將枸櫞酸緩沖液（滁州仕諾達生物科技有限公司，貨號：SND2872）0.01mol/L 注射50mg/kg STZ 大鼠建模，連續(xù)3d。血糖＞16.7mmol/L 則建模成功，且建模成功大鼠已表現出典型糖尿病腎病表現。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 大鼠麻醉，取仰臥位，剪開腹壁，分離腹主動脈。采集主動脈血5ml，3000 轉/min 離心10min，取血清，-80℃保存?zhèn)溆茫蝗∽竽I生理鹽水沖洗，取0.5cm 厚腎皮質組織置于4%多聚甲醛（碧云天生物技術有限公司，產品編號：P0099-100ml）固定，將組織塊置于2.5%戊二醛（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：Y12820）4℃冰箱保存待檢。

1.2.2 足細胞獲取和培養(yǎng)方法 取出細胞，37℃水浴解凍，于離心管1000 轉/min 離心10min，棄去上清液。100m2的培養(yǎng)瓶，37℃孵育24h，PBS 洗滌3次，加入100U/mL 的干擾素γ（interferon，IFN-γ）的無血清細胞凍存培養(yǎng)基（RPMI）1640 培養(yǎng)液，于33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3d 換一次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察其生長變化。

1.2.3 細胞轉染 將培養(yǎng)好的細胞按5×105個每孔，接于6 孔板中，生長至75%轉染。將培養(yǎng)好的細胞分成3 組，每組8 孔，空白組不作處理，其余兩組用Fetuin-A 抑制劑和Fetuin-Apmimic 進行轉染。

1.2.4 引物序列 采用Real Time RT-PCR 技術檢測3 組細胞Sp1、RIPK1、MLKL、WT1 表達。95℃預反應30s，然后95℃ 5s、60℃ 30s、40 個循環(huán)。

1.2.5 細胞凋亡 應用胰酶消化細胞，經PBS 沖洗2 次，收集細胞。加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜。離心收集細胞，加入溴化乙錠（50μg/ml），RNase A（100μg/ml），4℃避光孵育30min。采用高通量流式細胞儀（生產廠家：德國美天旎生物技術有限公司；型號：Analyzer 16）觀察細胞凋亡。

1.2.6 腎組織Fetuin-A、TNF-α、MLKL、RIPK1 水平檢測 采用免疫組化法檢測腎組織胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，Fetuin-A）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、混合系列蛋白激酶結構域蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）、受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）水平。

1.2.7 Western blot 法檢測 測定WT1、Sp1 水平，了解蛋白表達水平WT1、Sp1 相對表達量，用β-actin做蛋白內參。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），即F檢驗，應首先做方差齊性檢驗，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組Fetuin-A 表達比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調Fetuin-A組Fetuin-A 表達較低，上調Fetuin-A 組Fetuin-A 表達較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與下調miR-125b 組比較，上調miR-125b 組miR-125b 表達較低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3 組Fetuin-A 表達比較（）

表2 3 組Fetuin-A 表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.2 3 組足細胞增殖、凋亡比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調Fetuin-A組細胞吸光度值、凋亡率較低，上調Fetuin-A 組細胞吸光度值、凋亡率較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與下調Fetuin-A 組比較，上調Fetuin-A組細胞吸光度值、凋亡率較高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 3 組足細胞增殖、凋亡比較（）

表3 3 組足細胞增殖、凋亡比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.3 Fetuin-A 對3 組腎功能相關指標的影響

24h、48h、72h 與對照組比較，下調Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達較低，上調Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與下調Fetuin-A 組比較，上調Fetuin-A 組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達較高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 Fetuin-A 對3 組TNF-α、MLKL、RIPK1 指標的影響（）

表4 Fetuin-A 對3 組TNF-α、MLKL、RIPK1 指標的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.4 3 組細胞WT1 信號通路蛋白相對表達量比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調Fetuin-A 組WT1、Sp1 表達均較高，上調Fetuin-A 組WT1、Sp1表達均較低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與下調Fetuin-A 組比較，上調Fetuin-A 組WT1、Sp1 表達較低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5 和圖1。

表5 3 組細胞WT1 信號通路蛋白相對表達量比較（）

表5 3 組細胞WT1 信號通路蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

圖1 各組細胞相關蛋白表達

3 討論

足細胞是一種高度分化的終末細胞，在腎小球功能調節(jié)中發(fā)揮重要作用[7,8]。Fetuin-A 磷酸化后其發(fā)揮生物學特性，可誘導胰島素抵抗，抑制異位鈣沉積，在炎癥反應及脂質代謝過程中起重要作用，誘導TNF-α 等促炎因子的表達，引起機體或組織發(fā)生慢性炎癥[9-11]。TNF-α 可促進炎癥因子分泌，加劇炎癥的作用[12]。相關研究證實，Fetuin-A 能抑制TGF-β 的信號通路，誘發(fā)低度炎癥，造成足細胞損傷，促進糖尿病腎病的發(fā)展[13]。因此，本文旨在探討Fetuin-A 調控糖尿病腎病足細胞損傷機制。

胰島素可啟動胰島素信號的轉導，活化胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-1）、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-2）、PI3K蛋白激酶等多種信號分子，影響胰島素的發(fā)揮[14]。Fetuin-A 可抑制胰島素受體自身磷酸化抑制，增加足細胞分泌的負擔[15]。本研究結果顯示，足細胞凋亡數量在上調Fetuin-A 組顯著升高，下調Fetuin-A組足細胞的凋亡數量明顯減少，說明Fetuin-A 可能通過抑制機體低度炎性反應，抑制脂聯素基因表達，誘導胰島素抵抗，引起足細胞損傷和功能惡化及血管內皮生長因子過量表達等途徑參與糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。Caspase-8 的激活與否是凋亡或壞死性凋亡的關鍵，當Caspase-8 激活受抑制時，RIPK1 去泛素化從而招募RIPK3、RIPK1/RIPK3 復合體招募并磷酸化MLKL，最終MLKL 孔通過允許離子流入、細胞膨脹和膜溶解導致壞死性細胞死亡并誘發(fā)炎性反應，因此RIPK1 與RIPK3 形成復合體以及MLKL 的磷酸化是壞死性凋亡的特異標志。研究發(fā)現，壞死性凋亡為糖尿病腎損傷的一種重要細胞死亡模式，不依賴Caspase 激活且具有典型壞死樣形態(tài)，其通過RIPK1/MLKL 途徑進行調節(jié)。壞死性凋亡是細胞程序性死亡的一種新形式，其途徑主要由TNF-α 激活，RIPK1 去泛素化從而招募受體相互作用蛋白激酶RIPK3，二者磷酸化MLKL，導致壞死性細胞死亡[16,17]。

足細胞數量能反映足細胞丟失和增殖之間的平衡狀態(tài)[18]。WT1 表達于足細胞核，反映足細胞數量及損傷程度，是足細胞的特異性標志[19]。Sp1 是一個通用的轉錄因子，在發(fā)育、細胞增殖、凋亡中發(fā)揮關鍵的調控作用[20]。本研究結果顯示，上調Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達水平均升高，WT1、Sp1 表達水平則降低，說明Fetuin-A 過表達影響TNF-α、MLKL、RIPK1 表達水平，而三者水平升高是足細胞減少的重要原因，從而說明Fetuin-A 可以通過引起足細胞損傷，促進糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，Fetuin-A 靶向作用于Sp1 使足細胞損傷和功能失常。