INSL3在女性生殖調(diào)節(jié)中的作用研究進(jìn)展

陳甜，陳卓，楊婧

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴陽 550004)

胰島素樣肽(insulin-like peptides，INSL)3、INSL4等肽激素的共同點在于其可作為分泌肽被合成，這類肽結(jié)構(gòu)包括3個肽域，即N端的B域、中間的C域和C端的A域，其中B域和A域非常保守，兩者可形成相同且相對剛性的三維骨架[1]。有證據(jù)表明，松弛素和INSL的C域大部分被切除，且無論C域是否存在，松弛素和INSL肽均保留了完整的生物活性[2-3]，主要原因為C域在肽與物種之間的差異較大，在結(jié)構(gòu)上相對靈活，不會與受體結(jié)合。除松弛素H1、松弛素H2外，還有部分INSL家族成員(如INSL3、INSL4)也與生殖生理學(xué)相關(guān)，包括睪丸下降、哺乳、妊娠和分娩等[3]。人絨毛膜促性腺激素、催產(chǎn)素以及INSL也被稱為“新激素”，主要通過促性腺激素和類固醇等系統(tǒng)調(diào)節(jié)內(nèi)部受精和妊娠相關(guān)生理功能[4]。INSL3最初在豬和小鼠中作為一種獨特的睪丸特異性基因轉(zhuǎn)錄物序列被發(fā)現(xiàn)[5]。目前哺乳動物INSL3的主要合成位點在睪丸間質(zhì)細(xì)胞[6]。INSL3通常被認(rèn)為是一種雄性特異性激素，但也在雌性哺乳動物竇卵泡的類固醇膜內(nèi)細(xì)胞及黃體中表達(dá)[7]?，F(xiàn)就INSL3在女性生殖調(diào)節(jié)中的作用予以綜述。

1 INSL3信號通路及生理功能

1.1INSL3受體 INSL3在結(jié)構(gòu)上與松弛素密切相關(guān)，其同源受體為G蛋白偶聯(lián)受體7，亦稱為松弛素家族肽受體(relaxation family peptide receptor，RXFP)2。編碼RXFP2的基因包含18個外顯子，除表達(dá)為全長功能的受體外，還可表達(dá)為多種長度的剪接變體，但這些剪接變體的生物學(xué)功能目前尚未明確[8]。RXFP2的主要特點是1個大的胞外域，其中N端包含1個低密度脂蛋白-A模塊，然后是10個富含亮氨酸的重復(fù)序列，最后是1個富含半胱氨酸的鉸鏈區(qū)連接第一個跨膜域[1]。研究表明，INSL3主要通過激素B鏈內(nèi)的殘基與RXFP2富含亮氨酸的重復(fù)序列表面的氨基酸相互作用，且這種作用具有較高的特異性與親和力，因此包含B結(jié)構(gòu)域的INSL3二聚體分子只能作為RXFP2受體拮抗劑，因為INSL3二聚體與RXFP2相互作用不會導(dǎo)致RXFP2激活[9]。體內(nèi)的INSL3與RXFP2結(jié)合可導(dǎo)致胞外域向下彎曲，從而啟動低密度脂蛋白-A、INSL3的A鏈與7跨膜區(qū)結(jié)合，調(diào)控下游信號通路[10-11]。雖然高水平松弛素H2也可在體外激活RXFP2，但在體內(nèi)松弛素生理水平幾乎不可能激活RXFP2，因此在體內(nèi)INSL3與RXFP2相互作用的特異性較高[10]。過表達(dá)RXFP2后，INSL3啟動的主要第二信使為興奮性G蛋白，而興奮性G蛋白激活可導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，進(jìn)而激活β聯(lián)蛋白并刺激磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B信號通路，進(jìn)一步激活Wnt和Notch通路的下游信號[10，12]。

研究顯示，RXFP2基因在牛卵巢內(nèi)膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞以及黃體中均有表達(dá)，但在顆粒細(xì)胞或卵丘細(xì)胞中未見明顯表達(dá)；通過刺激牛竇狀卵泡中的cAMP表達(dá)可調(diào)控INSL3，在牛黃體細(xì)胞中也可通過增加孕酮水平達(dá)到類似的效果[13]。另有研究表明，大鼠卵母細(xì)胞中的RXFP2可能以連鎖方式參與卵母細(xì)胞的成熟過程[14]。在牛子宮內(nèi)膜以及人子宮肌層中均發(fā)現(xiàn)RXFP2基因表達(dá)，但在人子宮肌層細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)cAMP對INSL3的調(diào)控作用[13]。RXFP2與RXFP1在人肌瘤組織中均有表達(dá)，且大鼠平滑肌瘤ELT-3細(xì)胞中的INSL3表達(dá)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)的Smad2磷酸化作用減弱，表明INSL3可能具有抗纖維化作用[15]。RXFP2基因也表達(dá)于大鼠子宮肌層和子宮內(nèi)膜，當(dāng)子宮血流受限時其表達(dá)增加[16]。此外，RXFP2轉(zhuǎn)錄本在早期植入前胚胎中的表達(dá)也顯著增加[16]。

1.2INSL3-RXFP2通路的生理學(xué)功能 RXFP2僅在大鼠竇前卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá)，而INSL3可通過誘導(dǎo)卵母細(xì)胞產(chǎn)生生長分化因子9、刺激膜雄激素受體的產(chǎn)生等作用于竇前卵泡，從而誘導(dǎo)卵泡生長[17]。在牛竇狀卵泡中，即使不存在黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平顯著升高，也會表達(dá)RXFP2受體，而RXFP2不僅可調(diào)控INSL3的表達(dá)，還會導(dǎo)致cAMP表達(dá)增加[18]。研究表明，INSL3-RXFP2通路對竇卵泡功能的調(diào)節(jié)具有較大影響，低劑量(約0.1 ng/ml)的LH在體內(nèi)可導(dǎo)致卵泡內(nèi)膜細(xì)胞INSL3表達(dá)上調(diào)，高劑量(>1 ng/ml)LH可導(dǎo)致INSL3表達(dá)下調(diào)，而內(nèi)膜細(xì)胞分泌的INSL3表達(dá)水平的變化可誘導(dǎo)17α-羥化酶表達(dá)，17α-羥化酶則負(fù)責(zé)孕烯醇酮或孕酮中卵泡類固醇前體雄烯二酮的產(chǎn)生[19]。用INSL3或其受體RXFP2的干擾小RNA處理內(nèi)膜細(xì)胞，可導(dǎo)致依賴17α-羥化酶的雄烯二酮的產(chǎn)生途徑被完全抑制，同時雄烯二酮被生長中的竇卵泡的顆粒細(xì)胞吸收，雄烯二酮可作為卵泡刺激素活化的芳香酶產(chǎn)生雌激素(雌酮、雌二醇)的主要前體，而雌二醇可通過雌激素受體α或雌激素受體β上調(diào)內(nèi)膜細(xì)胞INSL3的表達(dá)；卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中雌激素的作用模式可能并不是經(jīng)典模式，因為在INSL3基因啟動子附近并未發(fā)現(xiàn)雌激素反應(yīng)元件，而雌二醇可能通過類固醇生成因子1成為對INSL3發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素；在INSL3-RXFP2通路中，雄烯二酮可優(yōu)先通過雌激素受體α或雌激素受體β刺激INSL3合成，而真正的雄激素(如二氫睪酮)則無刺激INSL3合成的作用[18]。用阿比特龍?zhí)幚砺雅莅l(fā)現(xiàn)，雄烯二酮本身可刺激分離的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生INSL3，主要由于阿比特龍可特異性下調(diào)17α-羥化酶的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致INSL3表達(dá)下調(diào)[20]。

此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)4、BMP5和BMP6等也可顯著抑制牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞INSL3-RXFP2通路的表達(dá)，BMP可由卵母細(xì)胞和(或)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體發(fā)揮作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]和表皮生長因子在體外均可抑制牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中的INSL3-RXFP2通路；此外，胰島素和(或)胰島素樣生長因子1可促進(jìn)牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中的INSL3合成[22]。目前的研究表明，INSL3與RXFP2作為自分泌/旁分泌系統(tǒng)共同發(fā)揮作用，在月經(jīng)周期開始時協(xié)調(diào)和放大低水平LH、雄烯二酮和雌激素的作用，從而促進(jìn)和協(xié)調(diào)月經(jīng)周期的進(jìn)行；上調(diào)卵泡BMP水平有助于抑制月經(jīng)后期INSL3-RXFP2通路的表達(dá)，從而直接抑制INSL3的表達(dá)；高劑量人絨毛膜促性腺激素可影響獼猴卵泡液INSL3水平，表明INSL3可能在卵泡內(nèi)起作用，直接調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[23]，但這些研究結(jié)果未來還需更多研究驗證。

2 INSL3在女性體內(nèi)的表達(dá)

2.1循環(huán)系統(tǒng)中的INSL3 免疫測定法顯示，健康成年男性循環(huán)系統(tǒng)中的INSL3水平通常為0.5～2.0 ng/ml，而高靈敏度熒光免疫分析法顯示，女性循環(huán)系統(tǒng)中INSL3的檢出限為10 pg/ml；在女性的嬰兒期和幼兒期，INSL3無法檢測到，只有青春期才可檢測到INSL3，在健康的育齡期女性中，最高的INSL3表達(dá)水平僅約為200 pg/ml；在整個月經(jīng)周期INSL3以階段性方式產(chǎn)生，并可代表竇卵泡生長的單個波，而女性月經(jīng)周期中這種卵泡波具有可變性，某些女性卵泡期有2個波，另一些女性的卵泡期只有1個波[24]。由于女性卵泡波存在個體差異，整個月經(jīng)周期中的INSL3平均水平并不具有代表意義。隨著更年期正常月經(jīng)周期的停止，在循環(huán)系統(tǒng)中無法檢測到INSL3表達(dá)，因此絕經(jīng)后女性的血清通常被作為INSL3免疫測定的陰性對照，表明卵巢可能是女性循環(huán)系統(tǒng)中INSL3的唯一來源[25]。

循環(huán)系統(tǒng)中的INSL3表達(dá)變化可反映健康年輕女性的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞功能。一項針對約1 000例不孕女性的橫斷面研究顯示，診斷為多囊卵巢綜合征的患者循環(huán)系統(tǒng)中的INSL3水平顯著升高，而通過竇卵泡計數(shù)和抗米勒管激素水平判定的卵巢儲備功能低下患者的INSL3水平顯著降低，且INSL3水平與竇卵泡計數(shù)呈顯著正相關(guān)[26]。有研究者通過測量不同大小牛竇卵泡內(nèi)膜組織中的INSL3信使RNA水平發(fā)現(xiàn)，直至排卵前階段，其表達(dá)水平均穩(wěn)定增加[27]。

2.2卵巢中的INSL3 原位RNA雜交實驗和免疫組織化學(xué)檢測法在奶牛、人類和狨猴的卵巢中均發(fā)現(xiàn) INSL3表達(dá)，但在顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞或卵母細(xì)胞中卻未檢測到INSL3表達(dá)[28]。用兩種不同的INSL3抗體對牛卵巢進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在健康生長的竇卵泡中INSL3的表達(dá)水平最高，且INSL3缺失可能是卵泡閉鎖最早的標(biāo)志物之一，甚至早于任何類固醇生成酶缺失[17，28]。此外，黃體中也存在INSL3信使RNA，在牛黃體期早期INSL3信使RNA表達(dá)較低，但隨著黃體的生長INSL3信使RNA的表達(dá)逐漸增加，而隨著黃體的溶解INSL3信使RNA的表達(dá)逐漸降低；在狨猴妊娠期間，其黃體中的INSL3表達(dá)較穩(wěn)定，妊娠牛黃體中的INSL3信使RNA表達(dá)與狨猴妊娠期類似；在小鼠卵巢中，單個視野內(nèi)的黃體INSL3染色不均勻，表明INSL3表達(dá)可能是一個動態(tài)模式，而這種動態(tài)表達(dá)是否有助于將INSL3分泌至循環(huán)系統(tǒng)目前尚不清楚[7]。

INSL3不僅可分泌至血液，還可積聚在竇卵泡液中。檢測獼猴和奶牛的卵泡液發(fā)現(xiàn)，與血液相比，卵泡液中的INSL3水平顯著升高，獼猴卵泡液中的INSL3濃度約為1 ng/ml，而牛卵泡液中的INSL3濃度高達(dá)400 ng/ml[18]。在獼猴體內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)排卵可導(dǎo)致竇卵泡中的INSL3水平降低，但在牛體內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素并未發(fā)現(xiàn)INSL3水平與卵泡大小或類固醇水平的關(guān)系。

2.3妊娠期及胎兒體內(nèi)的INSL3 有研究者通過比較受孕第17天的綿羊與非受孕綿羊的血清發(fā)現(xiàn)，INSL3可能成為妊娠早期的生物標(biāo)志物；此外，懷有雌性胚胎的奶牛和豬妊娠中期血液中的INSL3水平與發(fā)情期的INSL3水平相似[29]。此外，在人子宮內(nèi)膜上皮和胎盤中也檢測到低強(qiáng)度的INSL3免疫組織化學(xué)染色，特別是合體滋養(yǎng)層細(xì)胞[30]。在妊娠期間，男性胎兒也可產(chǎn)生INSL3，在妊娠早期至中期的過渡期間胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量INSL3，且INSL3與胎兒睪丸下降的第一個經(jīng)腹階段有關(guān)，其可激活胎兒韌帶上的RXFP2[31]。因此，羊水中的INSL3水平可作為睪丸發(fā)育良好的生物標(biāo)志物[31-32]。在母牛體內(nèi)，雄性胚胎內(nèi)的INSL3可穿過胎膜和胎盤，因此在母牛外周血清中可檢測到INSL3表達(dá)，表明INSL3作為一種性別特異性激素，可影響胎盤和母牛的生理或病理狀態(tài)，且與類固醇不同，INSL3由男性胎兒特異性的產(chǎn)生，而女性胎兒在整個妊娠期間均未出現(xiàn)INSL3合成[31]。

3 小 結(jié)

在卵巢竇卵泡內(nèi)，INSL3-RXFP2通路可通過刺激17α-羥化酶的表達(dá)促進(jìn)雄烯二酮的產(chǎn)生。作為一種生物標(biāo)志物，INSL3亦可在監(jiān)測健康竇卵泡的生長方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。INSL3是一種由卵巢產(chǎn)生的激素，在青春期至更年期循環(huán)系統(tǒng)中的INSL3水平為100～200 pg/ml，在此區(qū)間INSL3可很好地刺激遠(yuǎn)端組織中的RXFP2。因此，INSL3或其同源受體激動劑均可作為更年期激素替代的新策略。此外，INSL3還可參與多囊卵巢綜合征的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚未明確。目前關(guān)于INSL3在女性生殖調(diào)節(jié)中的作用研究仍處于初級階段，未來還應(yīng)深入研究INSL3在女性生殖調(diào)節(jié)中的作用，為以INSL3為靶點的女性生殖疾病藥物的研發(fā)提供幫助。