木蝴蝶活性成分質(zhì)量控制研究進展*

程新杰，卞廣利，李德強，閆凱，徐艷梅，高燕霞

(1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，石家莊 050000)

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶屬木蝴蝶Oroxylumindicum(L.)Vent的干燥成熟種子，又稱千層紙、玉蝴蝶等，其廣泛地分布于亞洲國家[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，木蝴蝶具有抗氧化、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌、降糖、抗誘變等多種生物活性[2-6]；植物化學研究表明，其主要成分為黃酮類化合物，是其發(fā)揮生物活性的主要成分[6-7]。然而，木蝴蝶化學成分復雜、活性物質(zhì)含量較低，且共存大量的干擾物質(zhì)[8]。因木蝴蝶分布廣泛、來源復雜，生長環(huán)境、產(chǎn)地氣候、采收時期及儲藏方法等不盡相同，其活性成分必然存在很大差異，使木蝴蝶活性成分的全面質(zhì)量控制成為研究難點和熱點。近年來，隨著科技的進步及對天然藥物研究的重視，出現(xiàn)許多新興分析技術(shù)，使中藥活性成分的質(zhì)量控制得到了長足的發(fā)展，對天然藥物的研究也越來越深入。本文查閱近年來國內(nèi)外木蝴蝶的研究文獻，對木蝴蝶活性成分的質(zhì)量控制做一綜述，以期為木蝴蝶的開發(fā)和臨床應用提供參考。

1 木蝴蝶活性成分

植物活性成分指構(gòu)成植物體內(nèi)的物質(zhì)，除水分、蛋白質(zhì)、脂肪酸等必要物質(zhì)外，還包括其次生代謝產(chǎn)物，如萜類、黃酮類、生物堿、甾體類等。現(xiàn)代研究表明，木蝴蝶中含有多種活性成分，其中黃酮類化合物是其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等廣泛的生物活性。目前，已知木蝴蝶中黃酮類化合物有木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、黃芩苷、白楊素、千層紙素A、木蝴蝶定、粗毛豚草素、白楊素-7-O-β-D-龍膽二糖苷、5，6-二羥基-7-甲氧基黃酮等30余種。其中，木蝴蝶苷B是木蝴蝶藥材中的特有成分，目前在其他藥材中尚未發(fā)現(xiàn)。木蝴蝶苷C和木蝴蝶苷D[9]、orlumin A[10]、oroxylumosides A和B[11]是近年來從木蝴蝶植物中最新分離得到的黃酮類化合物。木蝴蝶中除了含有黃酮類化合物外，還含有具有多種藥效作用的其他類成分，如紅景天苷、麥角甾苷、洋丁香苷等對羥基苯乙醇化合物，連翹環(huán)己醇、異連翹環(huán)己醇、5，6-二氫化-7-羥基-棘木苷等環(huán)己醇類化合物，2'，3'-二氫-2'-甲基-2'-十二烷基-2，3-呋喃妥因紫檀堿、2'，3'-二氫-2'-庚基-2，3-呋喃-8-羥基紫檀堿、2'，3'-二氫-2'-己基-2，3-呋喃-8-羥基紫檀堿等紫檀堿類化合物，丁基羥基甲苯、苯乙酮、2，3，6-三甲基吡啶等揮發(fā)性成分，油酸、棕櫚酸、硬脂酸等有機酸類化合物[12-14]；VIEN等[15]從木蝴蝶莖皮中分離出Oroxindols A 和B兩種新型癸二烷二萜化合物。在上述活性成分中，含量較高且研究較多的一類化合物是黃酮類化合物。

2 質(zhì)量控制研究

《中華人民共和國藥典》2020版采用高效液相色譜法，以單成分木蝴蝶苷B作為含量測定的指標用于木蝴蝶的質(zhì)量控制。除此之外，指紋圖譜技術(shù)、液相色譜(LC)及液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)、一測多評技術(shù)等也被廣泛應用于木蝴蝶的質(zhì)量控制。

2.1LC法 LC法簡單、準確、靈敏、精密度高、重復性好、自動化程度高，已被廣泛地應用于木蝴蝶的分析檢測。

SINHA等[16]通過HPLC指紋分析結(jié)合單標記物多組分定量分析(quantitative analysis of multi-components by a single marker，QAMS)，以黃芩素為內(nèi)標，同時測定了木蝴蝶中野黃芩苷、高車前素、黃芩素和Biochanina-A四種化合物的含量。實驗結(jié)果顯示，QAMS法與傳統(tǒng)的外標法(external standard method，ESM)之間差異無統(tǒng)計學意義，這表明，在沒有多種對照品的情況下，QAMS法是一種可用于測定多種成分含量的一致且簡便的方法。此外，該方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、回收率和重復性也得到了很好的驗證，可有效地應用于木蝴蝶的質(zhì)量評估。

SITHISARN等[17]建立了同時測定木蝴蝶中三種主要黃酮類成分的HPLC法，色譜柱為X-terra C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流動相為0.01%磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，在285 nm處進行檢測，測定結(jié)果顯示黃芩苷、黃芩素和白楊素的線性范圍分別為1.04～104，1.08～108，1.12～112 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)均≥0.999 0，回收率在90%～101%，RSD<2%，系統(tǒng)適應性參數(shù)均符合要求，該方法快速、簡便、準確性高、重復性好，適用于木蝴蝶果實及種子中黃芩苷、黃芩素和白楊素的同時定量測定，可為木蝴蝶的全面質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)和理論基礎。

ROJSANGA等[18]通過HPLC法研究了采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的木蝴蝶植物組織三個不同生長階段(4 d、3周和9周)和原生木蝴蝶種子提取物中的三種主要黃酮類成分(黃芩苷、黃芩素和白楊素)的含量。實驗結(jié)果顯示，在三種黃酮中，黃芩苷含量最高，其次是白楊素，而黃芩素的含量最低。值得注意的是，黃芩苷和白楊素含量在組織培養(yǎng)植物根和子葉的發(fā)育過程中保持較高水平，但當真葉開始生長時，其含量下降，而黃芩素則在各個生長階段保持穩(wěn)定。此外，所建方法的線性、精密度和重復性也得到了驗證。研究結(jié)果表明，該方法簡單、快速，可用于木蝴蝶提取物中三種黃酮類化合物的定量分析，同時，這種基于不同生長階段的分析方法可為木蝴蝶的進一步開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

2.2LC-MS法 LC-MS法集色譜分離系統(tǒng)和質(zhì)譜檢測系統(tǒng)為一體，具有高通量、高靈敏度、高準確性、高選擇性及高穩(wěn)定性的特點，適用于中藥復雜體系中成分的定性定量分析。

魏欣等[19]建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(UPLC-MS/MS)法對木蝴蝶中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、高車前素、芹菜素、野黃芩素、白楊素、金絲桃苷10種主要成分同時進行測定。采用Inertsutain C18(100 mm×3.0 mm，2 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，流動相為乙腈(A)-甲醇(B)-0.5%甲酸水(C)，梯度洗脫，流速為0.5 mL·min-1，負離子多反應監(jiān)測模式。結(jié)果表明所測的10種主要成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996 6，精密度、重復性與穩(wěn)定性良好，平均加樣回收率為94.0%～104.5%，RSD≤3.21%。該方法簡單、快速、靈敏度高、專屬性強，適用于木蝴蝶的質(zhì)量控制。

何民友等[20]采用超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用方法，建立木蝴蝶配方顆粒的特征指紋圖譜，并進行含量測定。采用Agilent SB C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相分別為乙腈-0.01%甲酸和乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，流速為0.28 mL·min-1，柱溫設為30 ℃，檢測波長為276 nm，結(jié)果顯示16批木蝴蝶配方顆粒和共有模式的相似性良好，相似度大于0.90，6種成分在各自測定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率在95.6%～102.8%，該方法可用于木蝴蝶配方顆?？焖佟⑷?、有效的質(zhì)量控制。

吳茵等[21]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合Peakview數(shù)據(jù)分析平臺對木蝴蝶中黃酮類化合物進行了快速地定性分析，色譜條件為Kinetex-XB C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為0.25 mL·min-1，采用負離子檢測模式，共分離和鑒定出36個黃酮類化學成分，其中包括10種黃酮苷元及26種黃酮苷類成分，該方法快速、準確，可為木蝴蝶化學成分的鑒定提供一種新策略，同時也為木蝴蝶的進一步質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

PENG等[22]建立了HPLC和LC-ESI-qTOF-MS/MS相結(jié)合的分析方法對木蝴蝶中化學成分進行鑒定，并同時測定木蝴蝶中6種主要活性成分的含量。首先，通過LC-ESI-qTOF-MS/MS法對42個成分進行鑒定，其中包括23種黃酮苷類成分、13種黃酮類成分和6種其他化合物；然后確定了指紋圖譜中19個共有峰的17個特征成分；最后采用液相色譜-紫外檢測(LC-UV)法同時測定6種主要活性成分。使用Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)為流動相，以0.8 mL·min-1的流速進行梯度洗脫，柱溫為35 ℃，檢測波長為280 nm，在負離子模式下進行。結(jié)果顯示，6種組分的標準曲線在測試范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8，該方法快速、高效，可用于木蝴蝶的全面鑒別與質(zhì)量評價。

陳麗娜等[23]通過HPLC-DAD-ESI-MS技術(shù)對木蝴蝶甲醇提取物中的主要化學成分進行定性分析，使用Waters SunFire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用以下條件進行樣品分析：柱溫為40 ℃，流動相為乙腈-純水(梯度洗脫)，流速為0.5 mL·min-1，檢測波長為360 nm，負離子檢測模式。通過HPLC的分離、DAD 檢測器和電噴霧質(zhì)譜法的結(jié)構(gòu)確認以及色譜圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與參考文獻的對比，共指認了木蝴蝶苷B、2α，3β-二羥基羽扇豆醇、黃芩苷、腺苷、白楊素-7-葡萄糖酸苷、黃芩苷元、羽扇豆醇和白楊黃素等8個重要的化合物，該方法操作簡單，分析快速，可用于木蝴蝶中化學成分的鑒定，并為木蝴蝶的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

2.3氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法 GC-MS法結(jié)合GC分離和MS結(jié)構(gòu)解析，通過碎片分布進行定性定量分析，專屬性強、選擇性高、靈敏度高、檢出限低、檢測范圍廣、分析速度快，對于中藥等復雜的樣品檢測具有很大優(yōu)勢。王義梅等[14]采用GC-MS技術(shù)測定了木蝴蝶果實不同組織的揮發(fā)性成分，采用HP-5 色譜柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫，載氣流速為1 mL·min-1，質(zhì)量掃描范圍為40～800 amu。通過計算機標準質(zhì)譜圖庫(NIST2002)檢索結(jié)合參考文獻的比對，在木蝴蝶果實各組織中共測出丁基羥基甲苯、丁基-3-庚烷基-鄰苯二甲酸酯、苯乙酮、苯基乙醇、4-甲氧基苯乙酮、4'-羥基苯乙酮、6-Octadecenoic acid和檸檬酸丁酯等8種主要成分，且在各個組織中，以丁基羥基甲苯的含量最高。該方法簡單、高效，可用于木蝴蝶中揮發(fā)性成分的檢測，并為木蝴蝶資源的進一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2.4基于藥理活性的綠色質(zhì)量控制 鑒于中藥材質(zhì)量控制所需儀器設備昂貴、質(zhì)量控制指標少、有機溶劑易對環(huán)境造成污染等缺點，有必要進行基于藥理活性的“綠色”質(zhì)量控制研究。在已知木蝴蝶中的4種主要黃酮類化合物木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素和白楊素具有酶抑制活性[24-25]的前提下，YIN等[26]以這4種主要的黃酮類成分為質(zhì)量控制指標，建立了一種簡單、綠色、快速的木蝴蝶質(zhì)量控制方法。實驗以低共熔溶劑(Deep eutectic solvents，DES)氯化膽堿/1，4-丁二醇(1：3)為綠色提取液，采用組織破碎提取技術(shù)(tissue-smashing extraction，TSE)對木蝴蝶中活性成分進行超快速提取，并結(jié)合超高液相色譜-紫外檢測(UPLC-UV)方法對四種主要的黃酮類化合物進行定量分析。與常規(guī)方法相比，這種基于DES的TSE結(jié)合UPLC-UV技術(shù)大大縮短了提取時間、提高了提取效率、降低了能耗，而且減少了環(huán)境污染。此外，所建立的UPLC法具有良好的線性，準確度和精密度。因此，該技術(shù)可作為一種簡單、可靠、高效、靈敏的方法，用于木蝴蝶的綠色質(zhì)量控制。

3 結(jié)束語

現(xiàn)代藥理學研究表明，中藥木蝴蝶具有多種顯著的藥理作用，是重要的藥食兩用物質(zhì)，有望成為治療心血管疾病、糖尿病、腫瘤等的藥物或被開發(fā)為抗衰老和功能保健類藥物，其社會效與經(jīng)濟效應前景廣闊。因此，十分有必要對其質(zhì)量進行嚴格的把控。相信隨著對天然產(chǎn)物研究的不斷深入及科技的不斷革新，會出現(xiàn)更多簡便、高效、快速、準確的分析技術(shù)用于木蝴蝶的全面質(zhì)量控制研究，為木蝴蝶的進一步開發(fā)和臨床應用提供參考，同時也為開發(fā)安全高效的創(chuàng)新藥物奠定基礎。