低溫對缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制研究

欒 濤，王帥穎，高永軍，王 振，李研寸心，徐 蔚，葉寶琴，張 曙

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650000；2.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科，湖北 武漢 431400）

腦卒中（cerebral stroke）是嚴(yán)重危害我國居民健康的疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)5 大特點(diǎn)[1]。2018 年我國腦血管病的死亡率為149.49/10 萬，造成了157 萬人死亡，是我國成人致死、致殘的首位病因[2]。據(jù)2016年全球疾病負(fù)擔(dān)研究估計(jì)，我國是全球卒中終生風(fēng)險(xiǎn)最高的國家，從25 歲起，卒中的終生風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)39.3%[1，3]。而缺血性腦卒中以80.63%的發(fā)病率，成為腦卒中主要的救治區(qū)域[4]。近年隨著人們對缺血性腦卒中的深入研究發(fā)現(xiàn)，低溫是極其具有研究價(jià)值的神經(jīng)保護(hù)方法，可抑制組織因缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞死亡與凋亡[5]，并且在缺血缺氧性腦病、創(chuàng)傷性顱腦損傷中都具有積極作用[6]。而且在急性大血管閉塞導(dǎo)致的缺血性腦卒中，可減少核心梗死體積與減輕腦水腫[7]。本文就低溫對治療缺血性腦卒中氨基酸、腦血量、新陳代謝、炎癥凋亡與信號通路的關(guān)系進(jìn)行綜述，以期為缺血性腦卒中的治療提供新思路。

1 低溫與谷氨酸聚集

谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由突觸小泡釋放與突觸后膜受體結(jié)合會(huì)提高膜對Na+、K+、Cl－的通透性，降低膜電位，細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生突觸后電位。而大腦出腦缺血嚴(yán)重時(shí)，會(huì)使能量依賴的攝取泵失效，無法將谷氨酸從突觸移到膠質(zhì)細(xì)胞中，胞內(nèi)興奮性突觸與谷氨酸泛濫。此時(shí)高水平的谷氨酸使谷氨酸受體失活，使細(xì)胞無法正常能量代謝而受到損傷[8]。另一方面，谷氨酸突觸增多導(dǎo)致大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，激活細(xì)胞促死亡信號通路。而低溫可以改善離子穩(wěn)態(tài)，阻斷或減緩鈣內(nèi)流、谷氨酸積累、甘氨酸的釋放這些興奮過程。

輕度低溫會(huì)改變神經(jīng)遞質(zhì)釋放[9]。局灶性腦缺血時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)在缺血后10～20 min 增加，60 min 達(dá)到高峰，70～90 min 下降，然后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平[10]。在亞低溫時(shí)，會(huì)使這一峰值減緩，推遲20 min 出現(xiàn)波峰[11]。而30 ℃～33 ℃的低溫會(huì)完全抑制谷氨酸釋放，減少谷氨酸增加，減少鈣動(dòng)員和ATP 消耗[12]。缺血后，破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)持續(xù)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天。亞低溫可抑制Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ和蛋白激酶C-α、β、γ 亞型移位。低溫會(huì)抑制缺血再灌注引起的Fodrin 蛋白分解，以及蛋白酶calain 的抑制[13]。盡管Ca2+能量反應(yīng)在缺血數(shù)天仍在繼續(xù)，但在這一時(shí)間窗中對Ca2+進(jìn)行干擾卻未收到療效，表明低溫的臨時(shí)治療窗口只有幾個(gè)小時(shí)。因此，這些Ca2+觸發(fā)的事件很可能是不可逆的過程，不再適用于治療性低溫。

但低溫對氨基酸的作用尚不清晰：某研究發(fā)現(xiàn)在谷氨酸匯集時(shí)使用低溫有效[14]；另一項(xiàng)研究觀察到，盡管同樣減少了興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)的外流[15]，但30 ℃比33 ℃有更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用[16]。因此，低溫對缺血神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響還處于一種模糊狀態(tài)，需要今后繼續(xù)探究。

2 低溫對新陳代謝、腦血流及興奮性的影響

低溫對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)表現(xiàn)在減少大腦血流量、降低組織代謝率[17]，溫度每降低1 ℃，大腦耗氧量與葡萄糖代謝則下降5%。但低溫可以保存組織高能磷酸化合物，如ATP，維持內(nèi)環(huán)境pH 值。低溫還可以防止組織乳酸產(chǎn)量增加、防止組織酸中毒，來保存大腦的新陳代謝儲(chǔ)備。對正常的腦組織降溫，其腦血流量會(huì)減少；但卒中時(shí)影響較為復(fù)雜。缺血時(shí)，由于血管閉塞，血流量明顯減少；但血流量恢復(fù)時(shí)，血流會(huì)在充血后逐漸下降，并持續(xù)數(shù)小時(shí)。低溫會(huì)使充血變得遲鈍，延緩腦血流量減少[18]。

低溫通過影響ATP 濃度來影響組織代謝。因?yàn)锳TP 是維持離子梯度所必需的，當(dāng)ATP 濃度梯度受到干擾時(shí)，比如在缺血的情況下，就會(huì)發(fā)生鈣內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸水平升高。低溫還可以通過限制α-氨基-3-羥基-5-甲基-異戊唑丙酸（AMPA）受體的鈣內(nèi)流來預(yù)防組織興奮性毒性。AMPA 受體的谷氨酸受體單位——谷氨酸受體（glutamate receptors，GluR）可以限制鈣內(nèi)流，當(dāng)受體受到抑制時(shí)會(huì)導(dǎo)致過量的鈣內(nèi)流。事實(shí)上，在全腦缺血模型，低溫可以減輕缺血誘導(dǎo)的GluR2 下調(diào)。

然而，低溫并不能完全解釋對大腦的保護(hù)作用。氧氣濃度變化、葡萄糖消耗、腦血流量改變不能解釋低溫對大腦的非線性保護(hù)作用。也就是說，神經(jīng)保護(hù)的程度不是隨溫度的降低按照比例增加。此外，低溫的保護(hù)作用不能簡單用ATP 丟失或細(xì)胞外谷氨酸減少來解釋，因?yàn)锳TP 丟失和谷氨酸積累是發(fā)生在缺血的幾分鐘內(nèi)，而這些反應(yīng)發(fā)生很久后再降溫，低溫依然有效。此外，體溫過低只會(huì)延遲許多急性損傷。關(guān)于低溫究竟是提供永久性保護(hù)還是僅僅延緩了受傷過程，這一爭論在今天仍在繼續(xù)。此外，即使在缺血發(fā)作幾小時(shí)后開始降溫也是有保護(hù)作用的，這表明低溫可能對卒中相關(guān)損害的亞急性甚至慢性期的損傷過程有重要影響。

3 低溫、氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡

當(dāng)缺血的腦組織受到再灌注時(shí)，損傷的線粒體會(huì)形成活性氧物種（reactive oxygen species，ROS），這是一種緩慢的缺血，尤其是缺血后的再灌注。再灌注還通過其他途徑觸發(fā)ROS 的產(chǎn)生，如神經(jīng)元中谷氨酸激活黃嘌呤氧化酶途徑和炎性細(xì)胞中的NADPH 氧化酶系統(tǒng)。研究表明[19]，低溫可以通過減少自由基的形成，從而對大腦提供保護(hù)。ROS 會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而對缺血性腦組織造成多種破壞性后果。ROS 可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，直接損傷DNA，觸發(fā)其他細(xì)胞死亡途徑。體溫過低已被證明可以抑制所有這些過程[20]。

缺血性腦卒中會(huì)發(fā)生大量細(xì)胞凋亡[21]。一般有兩條主要的凋亡途徑，基于線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑，以及外源性途徑或受體介導(dǎo)的途徑。內(nèi)源性途徑是由線粒體釋放細(xì)胞色素c，然后激活凋亡小體導(dǎo)致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteinyl aspartate specific，caspase-9）加工而觸發(fā)的。激活的caspase-9 然后激活caspase-3，這是一種導(dǎo)致DNA核小體間切割的效應(yīng)。線粒體細(xì)胞色素c 的釋放可受凋亡蛋白家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）促凋亡或抗凋亡成員的調(diào)節(jié)。受體介導(dǎo)的途徑首先在免疫細(xì)胞中被描述為一種限制炎癥反應(yīng)的手段。促凋亡配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合導(dǎo)致caspase-8 的募集和激活，最終導(dǎo)致caspase-3 的激活。外源性凋亡途徑包括Fas/FasL 和TNFR/TNF。

低溫可抑制細(xì)胞凋亡的幾個(gè)方面[22]，可以增加內(nèi)源性抗凋亡蛋白Bcl-2[23]的產(chǎn)生，減少DNA 片段化，抑制細(xì)胞色素c 的釋放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶[24]的激活。關(guān)于受體介導(dǎo)的通路和細(xì)胞凋亡在缺血中的研究較少。然而，一些研究表明[25-28]，F(xiàn)as 是檢測神經(jīng)細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，可間接反映血腦屏障的功能，低溫可以抑制Fas 和caspase-8 的激活，能減少重癥顱腦損傷患者神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量。

4 低溫對炎癥的影響

腦缺血相關(guān)的炎癥反應(yīng)會(huì)加劇組織損傷[29]。壞死組織和ROS 刺激免疫細(xì)胞，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)，從而導(dǎo)致外周白細(xì)胞浸潤。外周白細(xì)胞和激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種損傷因子，如一氧化氮、炎性細(xì)胞因子、趨化因子、超氧化物和其他蛋白酶，從而進(jìn)一步加劇缺血性損傷。低溫可通過降低組織中性粒細(xì)胞數(shù)量和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活而具有抗炎作用[30，31]。低溫會(huì)阻止組織白細(xì)胞與血管內(nèi)皮結(jié)合和下調(diào)內(nèi)皮粘附分子、細(xì)胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）來減少組織白細(xì)胞，從而阻止它們滲透到大腦。此外，亞低溫還可通過抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子——核因子（nuclear factor kappa B，NFκB）的激活而減少各種炎癥介質(zhì)[32]，如一氧化氮和細(xì)胞因子[33，34]。然而，由于炎癥是由壞死組織的存在引發(fā)的，因此有另一種理論，低溫可能是改變了壞死上游的因素，使炎癥反應(yīng)與組織損傷的程度成正比。但在沒有細(xì)胞死亡的腦部炎癥模型中也觀察到了低溫的這些抗炎作用，這表明低溫對免疫反應(yīng)有直接影響[35，36]。在人體，IL-6能穿透血腦屏障在下丘腦合成PEG2，從而改變身體的溫度設(shè)定點(diǎn)，低溫可以抑制腦損傷后細(xì)胞IL-6免疫因子的分泌[37，38]，降低組織損傷后免疫與炎癥反應(yīng)，以減輕受傷區(qū)域的組織損傷與感染。

5 低溫與血腦屏障

人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一層血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB），由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞組成，這層血腦屏障能夠阻止血液中有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織[39，40]。腦缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致腦組織繼發(fā)性損傷，包括水腫和出血，這是血腦屏障破壞的后果。腦卒中時(shí)血腦屏障破壞是由神經(jīng)血管單位的結(jié)構(gòu)和功能受損引起的，包括緊密連接蛋白、運(yùn)輸?shù)鞍?、基底膜、?nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和神經(jīng)元[41]。腦缺血、創(chuàng)傷和腦出血的模型表明，亞低溫可以保護(hù)血腦屏障，防止水腫形成[42，43]。具體的是低溫阻止了負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶的激活，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[44]。激活的MMPs 可以降解組成血腦屏障的幾種緊密連接蛋白，導(dǎo)致水腫形成和腦出血。低溫降低了基質(zhì)金屬蛋白酶的蛋白水解活性，進(jìn)而降低了血管基膜蛋白[45]和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚集素和層粘連蛋白的降解。除了抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，低溫還會(huì)增加內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)，如金屬蛋白酶抑制劑TIMP2[46]。

低溫還能夠通過維持大腦的水分平衡來減少水腫[47]。水通道蛋白是一個(gè)控制細(xì)胞膜上水流動(dòng)的水通道蛋白家族。其4 號壓型是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管系統(tǒng)的主要水通道蛋白類型，它在星形膠質(zhì)細(xì)胞的足底膜中發(fā)現(xiàn)。在腦出血和心臟驟停模型中[48]，亞低溫通過抑制水通道蛋白4 的表達(dá)來減少了腦水腫的形成，抑制破壞性蛋白酶的活化阻止水道的開放，以此防止腦水腫和腦出血。

通過保護(hù)血腦屏障的完整性，低溫可以限制腦水腫并增加顱內(nèi)壓。然而，低溫并不是總會(huì)保護(hù)血腦屏障。對蛋白酶誘導(dǎo)腦出血導(dǎo)致血腦屏障降解的模型表明，低溫對功能結(jié)果的影響是不一致的。在腦缺血模型，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室證明低溫的神經(jīng)保護(hù)作用。但在腦出血模型中，有的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)低溫可改善神經(jīng)功能，而另一些實(shí)驗(yàn)室報(bào)告神經(jīng)功能結(jié)果沒有改善，甚至略有惡化[49]。需要注意的是，低溫可以通過減少纖維蛋白原的生成和影響凝血酶的生成來抑制凝血。因此在這種情況下，低溫反而會(huì)增加出血的機(jī)會(huì)[50]。因此，由于低溫能導(dǎo)致出血擴(kuò)大，使得在出血性腦卒中的療效較差。

6 PI3K/Akt 信號通路

PI3K/Akt 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管生成、葡萄糖代謝中起著至關(guān)重要的作用，是細(xì)胞增殖和凋亡中不可缺少的通路，在細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[51]。PI3K/Akt 信號通路可調(diào)節(jié)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)細(xì)胞生長，是促進(jìn)缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，I/R）中神經(jīng)元存活的關(guān)鍵，被稱為再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑之一[52]。

PI3K/Akt 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、存活、分化、增殖和代謝方面起著重要作用。除了調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的發(fā)育，PI3K/Akt 通路也是促進(jìn)I/R損傷神經(jīng)元存活的關(guān)鍵，是挽救缺血再灌注損傷的經(jīng)典通路。研究表明[53]，PI3K/Akt 通路通過打開mitoKATP 通道而激活，從而減少I/R 損傷，輻射線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，包括Bcl-2、Bax 和GSK-3β，最終減輕I/R 損傷。

6.1 缺血后PI3K/Akt 信號通路 缺血后神經(jīng)元的是否存活由細(xì)胞存活信號通路之間的平衡決定。Akt激酶也稱為蛋白激酶，B-PKB 信號通路的激活可提高細(xì)胞存活率。在Akt 激活過程中，膜結(jié)合受體酪氨酸激酶RTK 被磷酸化，并被生長因子激活，包括胰島素樣生長因子和腦源性生長因子。RTK 激活PI3K，由磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸PIP2 合成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸PIP3。Akt 被招募到膜上，并被Ser473 和Thr308 的磷酸化激活。Thr308 磷酸化需要磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）。PDK1 可能間接磷酸化Ser473 上的Akt。10 號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）通過將PIP3 去磷酸化為PIP2來使Akt 失活，激活的Akt 通過磷酸化從而使其大部分底物失活來促進(jìn)細(xì)胞存活，如叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHR、Bcl-2 相關(guān)死亡蛋白Bad 和糖原合成酶3β（Glyco gen synthase kinase-3β，GSK3β）。BAD 和FKHR 是胞質(zhì)的，通常被Akt 磷酸化。Bad 的去磷酸化導(dǎo)致其移位到線粒體，觸發(fā)細(xì)胞色素釋放。然后細(xì)胞色素c 激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。去磷酸化的FKHR 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)Bcl-2 相互作用的細(xì)胞死亡介質(zhì)（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）和Fas 配體的過度表達(dá)。BIM 導(dǎo)致細(xì)胞色素c 的釋放，而Fas 配體激活caspase-8和caspase-3 的活性。Akt 也下調(diào)GSK3，通過在Ser9磷酸化它的活性，GSK3 去磷酸化導(dǎo)致其激活。

6.2 缺氧后PI3K/Akt 信號通路 缺氧誘導(dǎo)因子-1α hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是通過PI3K/Akt 途徑調(diào)節(jié)的，該通路受血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子和表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素-1β 等生長因子的激活。通過RTK 激活PI3K/Akt 通路可增強(qiáng)HIF-1α 的表達(dá)，使缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）亞基中間的ODD532 賴氨酸乙?；Ｓ捎谌毖鯒l件下ARD1mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，HIF-1 乙?；浇档停瑢?dǎo)致HIF-1 表達(dá)增加。HIF-1α 作為一種磷酸蛋白，可以通過自身的磷酸化過程調(diào)節(jié)合成和降解。然而，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α 磷酸化增強(qiáng)HIF-1 的轉(zhuǎn)錄活性。

PI3K 被多種基因激活后，激活A(yù)kt 與細(xì)胞膜結(jié)合。蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化有助于Akt 從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，并進(jìn)一步介導(dǎo)酶的生物學(xué)效應(yīng)，包括參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡抑制、細(xì)胞遷移、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞癌變等生物學(xué)效應(yīng)。HIF-1 作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵下游蛋白，與環(huán)境中的氧濃度密切相關(guān)。在常氧條件下，維持穩(wěn)定的HIF-1 蛋白水平是至關(guān)重要的；然而，在低氧條件下，HIF-1 蛋白水平會(huì)迅速升高。HIF-1α 與促紅細(xì)胞生成素相關(guān)的急性缺氧反應(yīng)有關(guān)，而HIF-2α 與慢性缺氧反應(yīng)有關(guān)。此外，PI3K/Akt 還可以減少糖原的合成，增加糖酵解。通過磷酸化糖原合成酶激酶的N 端絲氨酸來抑制其β 活性，增加細(xì)胞周期蛋白D1 的積聚，通過PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt 信號通路與多種酶生物學(xué)效應(yīng)和糖代謝密切相關(guān)。

PI3K/Akt 通路是細(xì)胞周期過程中重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路。它與細(xì)胞靜止、增殖、癌癥和長壽有關(guān)。PI3K 激活磷酸化并進(jìn)一步激活A(yù)kt，Akt 定位于細(xì)胞膜。激活后的Akt 具有多種生物學(xué)功能，包括激活CAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、抑制p27、將叉頭盒蛋白FOXO 定位于細(xì)胞質(zhì)。PI3K/Akt 通路可被多種生物分子增強(qiáng)，包括表皮生長因子、胰島素樣生長因子、胰島素和鈣調(diào)蛋白。相反，這個(gè)途徑被磷酸酶和緊張素同源物PTEN，糖原合成酶激酶3β 和轉(zhuǎn)錄因子HB9 拮抗。

7 總結(jié)

對于缺血性腦卒中，低溫可能是目前最有效的治療方法，但需要今后更多的隨機(jī)對照試驗(yàn)，從內(nèi)環(huán)境代謝、炎癥、凋亡、信號通路等方面來探究低溫的啟動(dòng)時(shí)機(jī)、目標(biāo)溫度、持續(xù)時(shí)間、復(fù)溫速度與并發(fā)癥的預(yù)防。自2015 年起，已有11 個(gè)臨床中心開展低溫對重型顱腦損傷的的前瞻性隨機(jī)研究，希望在不久的將來，能夠更清楚揭示低溫對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。