巨噬細(xì)胞在組織工程皮膚再生中的研究進(jìn)展

楊亞冬 劉興柱 李 平 張文元

目前已經(jīng)有產(chǎn)品化的組織工程皮膚在臨床上應(yīng)用，但移植后瘢痕增生明顯，造成修復(fù)不理想的情況幾乎都難以避免，尤其是大面積的瘢痕會對患者的生理和心理造成極大的影響，所以對組織工程皮膚移植過程中如何減少瘢痕形成的研究越來越受到關(guān)注[1,2]。研究人員期望通過不斷深入了解傷口愈合的生物學(xué)特點(diǎn)及關(guān)鍵的調(diào)控因素，達(dá)到人為干預(yù)調(diào)控機(jī)體再生的某些關(guān)鍵基因或因子，觸發(fā)機(jī)體再生的“開關(guān)”，使機(jī)體缺損的皮膚得到完美再生。越來越多研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在促進(jìn)心臟、胰腺、肌肉、神經(jīng)等多種組織再生中不可或缺，可見巨噬細(xì)胞與組織再生有著非常密切的聯(lián)系[3～6]。且已證實(shí)巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)傷口愈合和組織修復(fù)的關(guān)鍵角色，它在細(xì)胞纖維化和瘢痕形成過程中發(fā)揮重要作用[7]。這為組織器官再生的研究提供了新思路。本文就巨噬細(xì)胞在組織工程皮膚再生修復(fù)中發(fā)揮作用及其研究進(jìn)展做一綜述。

一、巨噬細(xì)胞極化

巨噬細(xì)胞是單核-吞噬系統(tǒng)的主要成員之一，廣泛分布在全身組織中，通過直接參與病原體清除或在無菌炎癥條件下修復(fù)組織，在維持生物體完整性方面發(fā)揮著高度多樣化的作用。在不同刺激因子誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞會改變其表型，表現(xiàn)出多樣化功能，此即為巨噬細(xì)胞極化。極化后主要可產(chǎn)生兩種亞型：經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(type-1 macrophage, M1)和替代活化巨噬細(xì)胞(type-2 macrophage, M2)，每個(gè)亞群都有自己的特點(diǎn)和功能[8]。

M1型巨噬細(xì)胞是單核細(xì)胞表面的Toll樣受體(TLR)與病原體或其產(chǎn)物結(jié)合后產(chǎn)生的信號或γ干擾素(IFN-γ)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)下分化而來的，并能通過分泌趨化因子[CC趨化因子配體2(CCL2)、CCL3、白細(xì)胞介素8(IL-8/CXCL8)等]和促炎性細(xì)胞因子[IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等]介導(dǎo)產(chǎn)生炎性反應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞是在IL-4、IL-13、集落刺激因子(CSF-1)等誘導(dǎo)下分化而成，可分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等，發(fā)揮炎癥抑制作用，參與組織損傷的修復(fù)和纖維化[9]。

在機(jī)體免疫功能正常情況下M1/M2型巨噬細(xì)胞極化保持著平衡，當(dāng)感染或炎癥嚴(yán)重時(shí)，巨噬細(xì)胞首先表現(xiàn)出M1表型，釋放促炎性細(xì)胞因子以對抗刺激，通過氧依賴性以及氧非依賴性殺菌系統(tǒng)發(fā)揮清除病原體作用，前者包括反應(yīng)性氧中間物(ROIs)和反應(yīng)性氮中間物(RNIs)，后者如溶菌酶、乳鐵蛋白等殺傷系統(tǒng)。但是，如果M1型持續(xù)下去，就會造成組織損傷。因此M2型巨噬細(xì)胞分泌大量的抑炎性細(xì)胞因子抑制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑、血管新生，保持體內(nèi)平衡。

二、組織再生修復(fù)與巨噬細(xì)胞關(guān)系

很多人都會有疑問：為何有些低等動物即使斷尾、斷肢都能再生出一個(gè)新的，而人類受傷后卻形成瘢痕？目前對于這個(gè)疑問大家比較認(rèn)可的觀點(diǎn)是進(jìn)化論。當(dāng)哺乳動物進(jìn)化出免疫系統(tǒng)后對損傷產(chǎn)生瘢痕反應(yīng)，肉芽組織覆蓋創(chuàng)面，達(dá)到快速愈合目的，使它們免受病原體等其他有害因素再次傷害，而這個(gè)代價(jià)就是失去了再生能力[10]。那是否意味著哺乳動物體內(nèi)仍然具有休眠的再生所需的分子和細(xì)胞通路？于是有人提出人類的再生可能“只需把開關(guān)打開”。有研究者對蠕蟲的基因組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了早期生長反應(yīng)(early growth response，EGR)這個(gè)主控基因，可以通過開啟或關(guān)閉其他基因來調(diào)控再生等許多生理過程。但是該基因在人類即使能夠開啟，也不能促進(jìn)再生，研究人員認(rèn)為基因組間的調(diào)控是多層次的，且各物種間是不同的[11]。

目前對于再生的“觸動開關(guān)”的研究只是觸及了皮毛，對于這個(gè)未知領(lǐng)域，各國研究人員開展了一系列研究，發(fā)現(xiàn)不同組織具有各自獨(dú)特的再生能力，但巨噬細(xì)胞基本都參與了這一過程。有研究證實(shí)了巨噬細(xì)胞參與了新生小鼠心臟再生過程中的心肌細(xì)胞增殖[3]。其修復(fù)機(jī)制是通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和參與抗炎轉(zhuǎn)化，激活巨噬細(xì)胞中TGF-β/Smad信號，調(diào)節(jié)梗死區(qū)心肌的修復(fù)和重構(gòu)[12]。有研究利用急性胰腺炎(AP)小鼠模型檢測急性炎癥到再生階段的胰腺巨噬細(xì)胞的動態(tài)變化。研究結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞在AP的促炎期占優(yōu)勢，而M2型巨噬細(xì)胞在胰腺修復(fù)/再生期占優(yōu)勢。再生早期和晚期巨噬細(xì)胞的減少分別顯著阻斷了腺泡-導(dǎo)管上皮化生或延遲炎癥消退。巨噬細(xì)胞的選擇性激活部分依賴于IL-4RA信號，胰腺巨噬細(xì)胞中ECM/AKT的激活促進(jìn)了組織再生過程中的炎癥消退[4]。

三、巨噬細(xì)胞參與皮膚損傷修復(fù)過程的研究

要研究消除瘢痕，就要先了解一下傷口修復(fù)過程中瘢痕是如何形成的。在皮膚損傷后，受損組織通過協(xié)調(diào)信號恢復(fù)，構(gòu)成皮膚損傷反應(yīng)。典型的皮膚損傷反應(yīng)可分為4個(gè)階段，即損害限制期、炎癥期、增殖期和重塑成熟期[13]。其實(shí)傷口修復(fù)是一個(gè)連續(xù)的過程，首先血小板、基質(zhì)纖維纖連蛋白聚集形成血凝塊，暫時(shí)抵御病原體入侵，接著單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、角朊細(xì)胞等細(xì)胞聚集遷移，發(fā)揮清除病原體作用，同時(shí)在局部釋放各種細(xì)胞因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)，此時(shí)的巨噬細(xì)胞以M1型為主。隨后生長因子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，形成“肉芽組織”，有大量滲出液及炎性細(xì)胞聚集，以M2型巨噬細(xì)胞為主，包括中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，因此肉芽組織具有抗感染功能。隨著肉芽組織逐漸成熟重建為纖維結(jié)締組織，即瘢痕組織，瘢痕組織會繼續(xù)重建，恢復(fù)部分功能，但與正常皮膚組織比較，還是有很大差異。與典型的急性傷口愈合過程不同，慢性傷口中M1型和M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是失調(diào)的，傷口邊緣80%是M1型巨噬細(xì)胞，這是導(dǎo)致慢性傷口持續(xù)炎癥并最終形成瘢痕的最大因素[14]。

從上述創(chuàng)面修復(fù)過程可以看出：免疫過程貫穿于創(chuàng)傷愈合的整個(gè)過程。我們是否可以通過人為地給予相應(yīng)的刺激因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞在傷口愈合早期就向促修復(fù)和抗炎的M2亞型分化，縮短炎性反應(yīng)期，使機(jī)體的創(chuàng)面發(fā)生再生修復(fù)而減少瘢痕形成。這個(gè)想法在蠑螈斷肢再生過程中得到印證。有研究通過對蠑螈斷肢再生過程用單細(xì)胞測序法檢測，發(fā)現(xiàn)蠑螈肢體再生早期就出現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞，說明M2亞型在斷肢早期出現(xiàn)構(gòu)成的特異免疫微環(huán)境很可能是蠑螈無瘢痕再生的關(guān)鍵所在[15]。對免疫信號進(jìn)行綜合性分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞浸潤是蠑螈肢體再生所必需的。當(dāng)全身巨噬細(xì)胞清除后斷肢傷口發(fā)生愈合，但斷肢無法再生，一旦巨噬細(xì)胞得到補(bǔ)充后，再截肢就能恢復(fù)殘肢的完整再生能力[16]。當(dāng)然也不能絕對的將巨噬細(xì)胞向某個(gè)亞型極化，這樣不僅不會觸發(fā)再生，可能連最基本的創(chuàng)面愈合都困難了。有研究利用BALB/c重組激活基因(Rag)-2和白細(xì)胞介素2受體γ (IL-2Rγ)雙敲除(KO)小鼠研究創(chuàng)面愈合情況，發(fā)現(xiàn)KO小鼠先天調(diào)節(jié)功能喪失時(shí)，M1型過度極化、血管生成不良和創(chuàng)面受損加重[17]。所以現(xiàn)在較多創(chuàng)面愈合研究主要集中在調(diào)控有助于M2型巨噬細(xì)胞極化的因素，減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子或表達(dá)，使M1和M2兩種亞型達(dá)到某種平衡，促進(jìn)創(chuàng)面再生修復(fù)，減少瘢痕形成[18]。

四、組織工程皮膚對巨噬細(xì)胞極化的影響研究

組織工程皮膚構(gòu)建主要有三大要素：種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞因子。細(xì)胞因子對巨噬細(xì)胞極化會產(chǎn)生直接的影響，其他兩個(gè)因素是否會對巨噬細(xì)胞極化發(fā)生影響是研究的重點(diǎn)。

1.種子細(xì)胞對巨噬細(xì)胞極化的影響研究：在組織工程皮膚中用得最多的種子細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cell, BMSC)、真皮間充質(zhì)干細(xì)胞等，當(dāng)然還有其他干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多分化潛能的干細(xì)胞，還具有良好的增殖能力及免疫調(diào)節(jié)作用，可通過影響巨噬細(xì)胞的極化，來影響局部組織的炎性反應(yīng)過程。有研究者采用脂多糖刺激體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IL-10和TNF-α，然后在培養(yǎng)體系中加入BMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入BMSCs后減少了炎性細(xì)胞因子的分泌，提示可能具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化的作用[19]。也有報(bào)道從動物模型層面對這個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證，鄭遠(yuǎn)華等研究發(fā)現(xiàn)，通過將BMSC經(jīng)過尾靜脈注射給膿毒癥大鼠模型，可抑制腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化，從而減輕膿毒癥大鼠的炎性反應(yīng)[20]。為了更好地修復(fù)皮膚創(chuàng)面，研究人員開始致力于調(diào)控?fù)p傷皮膚局部環(huán)境，使失衡的免疫應(yīng)答重新達(dá)到平衡。Yang等[21]通過姜黃素影響B(tài)MSCs的增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等功能來調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)的微環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)再生。

2.支架材料對巨噬細(xì)胞極化的影響研究：組織工程皮膚中采用的生物材料可能會對巨噬細(xì)胞的表型調(diào)控產(chǎn)生影響。越來越多的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對生物材料的理化性質(zhì)高度敏感，隨著生物材料研究的發(fā)展，研究人員已經(jīng)能很好地控制材料的表面性質(zhì)，以介導(dǎo)人體的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)組織的炎癥和修復(fù)再生[22]。海藻酸鈉、明膠及膠原已經(jīng)被大量研究證實(shí)可用來治療組織損傷，較多研究采用將纖維蛋白膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合，制作活性敷料膜，移植修復(fù)皮膚缺損動物模型，獲得較好療效。大家認(rèn)可的機(jī)制是生物材料可以募集CXCR4+細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并增加血管生成[23]。據(jù)報(bào)道生物活性玻璃/海藻酸鈉水凝膠可使巨噬細(xì)胞在體內(nèi)外向M2表型極化，上調(diào)抗炎基因的表達(dá)。M2型極化后的巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步招募成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)合成和內(nèi)皮細(xì)胞的體內(nèi)外血管化[24]。根據(jù)生物材料理化性能用作細(xì)胞支架或藥物遞送系統(tǒng)對巨噬細(xì)胞表型進(jìn)行調(diào)控，也許能夠成為一種促進(jìn)組織再生的治療策略。

五、展 望

綜上所述，皮膚替代品的出現(xiàn)極大緩解了臨床上皮膚缺損治療的難題，加速了傷口愈合，但它們在促進(jìn)創(chuàng)面再生、減少或抑制瘢痕形成方面還有待于更進(jìn)一步的優(yōu)化和研究。干細(xì)胞、生長因子以及生物材料的開發(fā)為皮膚再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了巨大的前景。再生療法的療效很大程度上受宿主免疫系統(tǒng)的影響，而宿主免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)和再生過程中起著重要的作用。因此，了解巨噬細(xì)胞如何影響組織愈合對開發(fā)有效的再生策略至關(guān)重要。雖然已經(jīng)有研究通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向有利于再生的M2型極化以促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，但是效果并沒有達(dá)到預(yù)期，所以在未來需要不斷開展深入研究，掌握調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的協(xié)同發(fā)揮作用的方法促進(jìn)組織再生，使組織工程皮膚移植治療在臨床上的應(yīng)用更加廣泛，減少或消滅瘢痕的形成。