開胸順氣丸中檳榔的HPLC含量測定及鑒別方法

于姍姍，齊 紅，李 敏，張秋紅

(濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，濟(jì)南 250102)

開胸順氣丸為傳統(tǒng)中藥制劑，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)首次收載于《中國藥典》1963年版一部，歷版《中國藥典》均有收載，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版一部。開胸順氣丸由檳榔、炒牽牛子、陳皮、木香、姜厚樸、醋三棱、醋莪術(shù)、豬牙皂8味中藥組成，具有消積化滯、行氣止痛的功效，臨床常用于氣郁食滯所致的胸脅脹滿、胃脘疼痛、噯氣嘔惡、食少納呆等。《中國藥典》2020年版一部的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：采用顯微鑒別法對處方中醋莪術(shù)、檳榔、炒牽牛子、陳皮、豬牙皂、姜厚樸和醋三棱進(jìn)行了鑒別，采用薄層色譜鑒別法對處方中檳榔、姜厚樸、炒牽牛子、陳皮、木香進(jìn)行了鑒別，采用丸劑項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定對劑型進(jìn)行了檢查，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對姜厚樸進(jìn)行了含量測定[1-2]。目前，關(guān)于開胸順氣丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較多[3-5]，但是關(guān)于開胸順氣丸中檳榔的含量測定則研究較少。

檳榔具有消積、行氣之功效，占開胸順氣丸處方量的24.5%，為該方的主藥之一。研究表明[6]，若服用不當(dāng)，檳榔具有口腔毒性、肝毒性、腎毒性、生殖毒性，繼而可引發(fā)口腔癌、肝癌等。檳榔的主要活性成分及毒性成分均為生物堿類，含量為0.3%～0.7%，主要包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿，其中又以檳榔堿為主[7]。

《中國藥典》2020年版一部中僅僅用薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)鑒別開胸順氣丸中的檳榔，無檳榔的含量測定方法。本研究建立開胸順氣丸中檳榔堿的HPLC含量測定方法和檳榔的HPLC鑒別方法，為提高開胸順氣丸中檳榔的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀，包括LC-20AT泵、SPD-M20A紫外檢測器、CTO-10AS VP柱溫箱、SIL-20A自動進(jìn)樣器(日本島津公司)；AE-240電子分析天平、AE-100電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-600GDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

開胸順氣丸(山東新大陸制藥有限公司，批號1908093；山東孔圣堂制藥有限公司，批號1904065；山東華洋制藥有限公司，批號200301X；北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號20083328；仲景宛西制藥股份有限公司，批號191201)；檳榔對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號120915-201813)，氫溴酸檳榔堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111684-202003，按99.8%計(jì))，去甲檳榔堿對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號B26396，按98%計(jì))；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測定

2.1.1色譜條件

十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.01%磷酸溶液(每1000 ml含2.5 g十二烷基硫酸鈉，32∶68)；檢測波長為215 nm。理論板數(shù)按檳榔堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 取氫溴酸檳榔堿對照品、去甲檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含氫溴酸檳榔堿約12 μg、去甲檳榔堿約 2 μg 的混合對照品溶液，即得(檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，過五號篩，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 按開胸順氣丸處方比例制備不含檳榔的陰性樣品,按“2.1.2.2”項(xiàng)下的方法制備陰性對照溶液。

2.1.3專屬性試驗(yàn)

在擬定的色譜條件下，分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。色譜圖見圖1。

A：對照品；B：供試品；C：陰性對照圖1 HPLC色譜圖

結(jié)果顯示，陰性對照溶液與對照品溶液、供試品溶液在相應(yīng)位置上無相同保留時間的色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.1.4線性關(guān)系考察

取氫溴酸檳榔堿對照品、去甲檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含氫溴酸檳榔堿116.415 μg、去甲檳榔堿17.68 μg的混合對照品溶液。取5、7、10、15、20 μl分別注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、檢出限及定量限結(jié)果

去甲檳榔堿在8.84～35.36 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，氫溴酸檳榔堿在58.21～232.84 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的檢出限及定量限均符合本次試驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度的要求。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一樣品(批號1908093)各6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的含量，計(jì)算RSD(n=6)。結(jié)果：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的平均含量分別為0.14 mg/g、1.08 mg/g，RSD分別為1.7%(n=6)、1.5%(n=6)。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.5”項(xiàng)下第1份供試品溶液適量，分別放置2、4、6、8、10、12 h后進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD(n=6)。結(jié)果：去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的RSD分別為2.0%(n=6)、1.9%(n=6)。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7加樣回收試驗(yàn)

取已知去甲檳榔堿含量(0.14 mg/g)和氫溴酸檳榔堿含量(1.08 mg/g)的開胸順氣丸(批號1908093)各6份，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，加入含去甲檳榔堿1.768 μg/ml、氫溴酸檳榔堿11.642 μg/ml的混合對照品溶液25 ml,再精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，注入液相色譜儀，測定去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿的峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2、表3。

表2 去甲檳榔堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 氫溴酸檳榔堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果：去甲檳榔堿平均回收率為53.3%，RSD為3.1%，準(zhǔn)確度不達(dá)標(biāo)，可能原因是去甲檳榔堿的含量低，導(dǎo)致其加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果偏低。氫溴酸檳榔堿平均回收率為93.2%，RSD為1.5%，準(zhǔn)確度良好。

由此可見，建立的HPLC法適用于開胸順氣丸中檳榔的氫溴酸檳榔堿含量測定。根據(jù)《中國藥典》2020年版一部檳榔項(xiàng)下對檳榔堿的規(guī)定為：含檳榔堿(C8H13NO2)不得少于0.20%，按飲片中檳榔堿最低含量折算，開胸順氣丸中含量應(yīng)為0.25 mg/g，再按轉(zhuǎn)移率為80%計(jì)算，暫定為本品每1 g含檳榔以檳榔堿(C8H13NO2)計(jì)，應(yīng)不得少于0.20 mg。

2.1.8樣品含量測定

稱取5批樣品粉末各約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別測定氫溴酸檳榔堿的含量。結(jié)果：5批供試品的氫溴酸檳榔堿平均含量為0.26～0.71 mg/g，均符合暫定的限度規(guī)定。

2.2 HPLC鑒別

按照《中國藥典》2020年版一部中的方法，對開胸順氣丸中檳榔進(jìn)行TCL鑒別。結(jié)果：斑點(diǎn)顯色不明顯，重現(xiàn)性差。見圖2。

1:檳榔對照藥材;2～6:供試品溶液圖2 TLC鑒別

在建立HPLC法測定檳榔中去甲檳榔堿和氫溴酸檳榔堿的過程中發(fā)現(xiàn)，供試品與去甲檳榔堿、氫溴酸檳榔堿在相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，并且陰性對照無干擾，表明建立的HPLC法適用于檳榔中去甲檳榔堿和氫溴酸檳榔堿的HPLC鑒別。

3 討論

3.1 HPLC含量測定

3.1.1測定成分的選擇

楊雅蛟等[8]采用HPLC法同時測定了四磨湯中4種檳榔生物堿的含量，胡璇等[9]采用HPLC法同時測定了檳榔藥材及其不同炮制品中4種生物堿的含量，屈文佳等[10]用HPLC法同時測定檳榔中4種生物堿的含量。筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，開胸順氣丸中檳榔次堿和去甲檳榔次堿的含量低，在本研究的色譜條件下低于檢出限，故僅對含量較高的去甲檳榔堿和檳榔堿的含量測定方法進(jìn)行了考察。研究過程中發(fā)現(xiàn)，去甲檳榔堿的回收率較低，僅為51.4%～55.3%，低于《中國藥典》2020年版四部“9101分析

方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中“回收率限度85%～110%”的規(guī)定，故建立的HPLC法僅可用于測定開胸順氣丸中檳榔堿的含量。

3.1.2提取溶劑的選擇

供試品的制備中，首先采用的提取溶劑為50%乙腈-0.5%磷酸溶液(50∶1)50 ml，毒性較大，配制相對繁瑣，研究過程中，改用甲醇為溶劑進(jìn)行提取，含量差異不明顯，故以甲醇為提取溶劑。

3.1.3色譜系統(tǒng)的選擇

胡璇等[9]在測定檳榔生物堿的過程中，考察了不同類型色譜柱的分離效果，最終選用了陽離子色譜柱。本研究選用了最常用的C18色譜柱及乙腈-磷酸-十二烷基硫酸鈉的流動相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)能得到較好的分離效果及色譜峰形，且較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

3.2 HPLC鑒別

因檳榔的TCL鑒別、提取方法復(fù)雜，顯色后只有一個斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)顯色不明顯，重現(xiàn)性差。本研究選用HPLC法對開胸順氣丸中的檳榔進(jìn)行鑒別，重現(xiàn)性好，成分控制更為合理，能同時控制去甲檳榔堿和檳榔堿。

綜上所述，建立的開胸順氣丸中檳榔堿HPLC含量測定方法和檳榔HPLC鑒別方法，能有效控制開胸順氣丸中檳榔的質(zhì)量，為其安全使用提供更好的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。