動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)注射用氟氧頭孢鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

季文君,方 韻,戴國(guó)英,陳 莉

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104)

1988年日本鹽野義制藥株式會(huì)社研發(fā)上市的注射用氟氧頭孢鈉(flomoxef sodium)是一種新型的氧頭孢烯類廣譜抗生素，其對(duì)厭氧菌、革蘭陰性菌及革蘭陽(yáng)性菌均有很強(qiáng)的抗菌作用[1-2]。臨床上主要用于治療敏感致病菌引起的中重度感染(包括呼吸道感染、尿道感染、婦科感染、外科感染及兒科感染等)[3-4]。

細(xì)菌內(nèi)毒素是一種脂多糖物質(zhì)，存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁上，細(xì)菌死亡或自溶后會(huì)進(jìn)入機(jī)體，并刺激單核巨噬細(xì)胞生成多種細(xì)胞因子，過(guò)量會(huì)引起發(fā)熱、低血壓、多器官功能衰竭等一系列熱原反應(yīng)[5-6]。因此，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是保障注射劑用藥安全的重要參數(shù)之一。目前，內(nèi)毒素檢查方法使用的主要為凝膠法，為定性或半定量的方法，無(wú)法獲得內(nèi)毒素的準(zhǔn)確含量。近年來(lái)，隨著藥品安全性檢查和生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控的要求日益嚴(yán)格，定性或半定量的方法已經(jīng)無(wú)法滿足質(zhì)控和檢驗(yàn)的要求。因此，本試驗(yàn)參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[7]，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)和干擾預(yù)試驗(yàn)，開(kāi)發(fā)了用于氟氧頭孢鈉的內(nèi)毒素定量檢測(cè)動(dòng)態(tài)濁度法，對(duì)注射用氟氧頭孢鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定量檢測(cè)。同時(shí)，本研究對(duì)方法的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行了驗(yàn)證，探索使用該方法對(duì)注射用氟氧頭孢鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定量檢測(cè)的可行性，為產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的內(nèi)毒素含量監(jiān)控和成品的檢查提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)150601-201782，效價(jià)60 EU/支)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1605250，規(guī)格30 ml/瓶)；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1701221，規(guī)格1.25 ml/支，檢測(cè)范圍50～0.005 EU/ml)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反應(yīng)板(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1702140)；注射用氟氧頭孢鈉(日本鹽野義制藥株式會(huì)社，批號(hào)DC24、DC25、DC26，規(guī)格1 g)。

1.2 儀器

ELX808IV細(xì)菌內(nèi)毒素定量?jī)x(美國(guó)BioTek公司)；TZL-5009可調(diào)速旋渦混勻器(蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)公式計(jì)算注射用氟氧頭孢鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)。L=K/M，其中K為細(xì)菌內(nèi)毒素閾劑量，注射劑，K=5 EU/(kg·h)；M為臨床患者每千克體重每小時(shí)的最大供試品用量，成人體重按60 kg計(jì)算[7]。注射用氟氧頭孢鈉臨床每次最大用量為2 g，靜脈滴注30～60 min。據(jù)此計(jì)算，本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。見(jiàn)公式1。

公式(1)

但是經(jīng)查閱日本藥局方第17版規(guī)定，注射用氟氧頭孢鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.025 EU/mg[8]。因此，為了用藥安全，本研究選用較為嚴(yán)格的0.025 EU/mg作為本品的限值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性考察

取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BET)用水1 ml對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行復(fù)溶，并進(jìn)一步稀釋，使其細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，各取0.1 ml加入到無(wú)熱原反應(yīng)板中，再加入0.1 ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑，混合均勻后立刻放入到細(xì)菌內(nèi)毒素定量?jī)x中進(jìn)行檢測(cè)，每一濃度平行做3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)用BET水作陰性對(duì)照，平行2個(gè)復(fù)孔。根據(jù)表1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程logT=6.00-0.258logC，相關(guān)系數(shù)r=0.999>0.980，各平行孔的變異系數(shù)(CV)均<10%，陰性對(duì)照(NC)的反應(yīng)時(shí)間大于規(guī)定檢測(cè)時(shí)間，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性 n=3

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)的確定

在試驗(yàn)中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)就是供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)，通常用MVD=cL/λ公式來(lái)計(jì)算，其中c為供試品溶液的濃度[7]，取1瓶注射用氟氧頭孢鈉(1 g)用10 ml BET水復(fù)溶，c初始為100 mg/ml；L為供試品注射用氟氧頭孢鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，L=0.025 EU/mg；λ為動(dòng)態(tài)濁度法中標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度0.01 EU/ml。經(jīng)計(jì)算，MVD為250倍。見(jiàn)公式2。

公式(2)

2.4 供試品干擾預(yù)試驗(yàn)

取批號(hào)為CD24的氟氧頭孢鈉作為干擾預(yù)試驗(yàn)的供試品，用10 ml BET水復(fù)溶，再根據(jù)MVD的結(jié)果，用BET水依次稀釋5(20 mg/ml)、25(4 mg/ml)，50(2 mg/ml)和250倍(0.4 mg/ml)，作為供試品溶液的4個(gè)梯度，同時(shí)制備含上述供試品濃度并含內(nèi)毒素濃度(λm)0.25 EU/ml的溶液作為供試品回收溶液，分別取上述供試品溶液、供試品回收溶液、陰性對(duì)照溶液和系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，每一濃度平行2個(gè)復(fù)孔。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算供試品回收溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，并確定內(nèi)毒素的回收率。

表2結(jié)果顯示，供試品溶液濃度為20 mg/ml時(shí)，回收率低于50%，存在干擾作用；供試品溶液濃度為4、2和0.4 mg/ml時(shí)，內(nèi)毒素回收率分別是90%、91%和105%，均在50%～200%范圍內(nèi)。本研究選擇內(nèi)毒素的回收率最接近100%的0.4 mg/ml作為檢測(cè)濃度，此時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾較小。

表2 干擾預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

取批號(hào)為CD24的供試品，用10 ml BET水復(fù)溶后，稀釋250倍制備成濃度為0.4 mg/ml的供試品溶液，同時(shí)制備含有不同濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品回收溶液,使其中標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素終濃度分別為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，氟氧頭孢鈉含量為0.4 mg/ml。測(cè)定2個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率以及CV。

結(jié)果顯示，含不同濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的0.4 mg/ml注射用氟氧頭孢鈉供試品的內(nèi)毒素回收率在87%～120%，均在50%～200%范圍內(nèi)，且CV均<10%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性，見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)態(tài)濁度法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

2.6 精密度驗(yàn)證

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線中4個(gè)濃度(1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml)的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用建立的動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)濃度3次檢驗(yàn)結(jié)果的CV。

結(jié)果顯示，CV均<10%，表明該方法的精密性較好，見(jiàn)表4。

表4 動(dòng)態(tài)濁度法的精密性驗(yàn)證

2.7 供試品的動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)

使用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，另取BET水作為陰性對(duì)照。取3批氟氧頭孢鈉供試品(DC24、DC25、DC26)，按照上述干擾預(yù)試驗(yàn)項(xiàng)下的方法制備濃度為0.4 mg/ml的供試品溶液及供試品回收溶液，用建立的方法檢測(cè)，每一濃度平行2個(gè)復(fù)孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液的內(nèi)毒素含量，以及供試品回收溶液中內(nèi)毒素的回收率。

結(jié)果顯示，對(duì)3批注射用氟氧頭孢鈉進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，供試品回收溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率均接近100%，供試品溶液均未檢出內(nèi)毒素，結(jié)果符合規(guī)定，見(jiàn)表5。

表5 樣品動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

注射用氟氧頭孢鈉具有抗菌效果好、抗菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有較強(qiáng)的抗菌活性，在臨床上主要用于呼吸系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染[9-10]。作為注射劑型，控制其細(xì)菌內(nèi)毒素的含量對(duì)于用藥安全有重要意義。

已有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，可以采用鱟試劑凝膠法檢測(cè)注射用氟氧頭孢鈉中的細(xì)菌內(nèi)毒素，但傳統(tǒng)的凝膠法只能進(jìn)行定性。動(dòng)態(tài)濁度法也是常見(jiàn)的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法，相較于凝膠法具有操作簡(jiǎn)便、可定量檢測(cè)、檢測(cè)范圍寬、準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。因此，本研究期望通過(guò)建立動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)注射用氟氧頭孢鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，從而更好地對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)控。

本研究首先考察了氟氧頭孢鈉本身對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。結(jié)果顯示，高濃度的氟氧頭孢鈉(20 mg/ml)確實(shí)對(duì)動(dòng)態(tài)濁度法的檢測(cè)存在干擾，但是隨著樣品含量的逐漸降低，干擾作用也逐漸減??；當(dāng)樣品終濃度在0.4 mg/ml時(shí)，采用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定注射用氟氧頭孢鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，回收率最接近100%，對(duì)內(nèi)毒素測(cè)定的干擾較小。因此，本文最終選擇0.4 mg/ml的氟氧頭孢鈉作為最終檢測(cè)濃度。隨后我們對(duì)該方法的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示其具有較高的準(zhǔn)確性和精密度。采用該方法對(duì)3批注射用氟氧頭孢鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)毒素含量均小于檢測(cè)限，檢查結(jié)果符合規(guī)定。

由此可見(jiàn)，動(dòng)態(tài)濁度法可以用于注射用氟氧頭孢鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的定量測(cè)定，且該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以更好地滿足產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量控制要求。