唾液外泌體與口腔疾病相關(guān)研究進(jìn)展

孫巖， 程磊， 彭顯

1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓科，四川 成都（610041）； 2. 口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）

液體活檢是近年來新興的一種非侵入性檢測方法，通過檢測生物液體中的生物標(biāo)志物，檢測疾病的發(fā)生及發(fā)展［1］。液體活檢開始主要涉及血液，近年來研究者將目光逐漸集中于其他生物液體，如唾液、尿液、腦脊液、乳汁等。相較于其它體液，唾液具有易收集、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、無創(chuàng)、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)。但唾液成分容易受收集方法、唾液流速、晝夜規(guī)律等的影響，因此當(dāng)進(jìn)行全唾液分析時(shí)存在易被污染、變性和部分蛋白酶（如淀粉酶）干擾導(dǎo)致其它蛋白質(zhì)降解等缺點(diǎn)，而采用唾液外泌體分析則能有效克服以上難題［2-3］。唾液外泌體是指存在于唾液中的直徑在30～150 nm 的細(xì)胞外囊泡，電鏡下觀察唾液外泌體可見其為雙層膜包裹的球形囊泡，唾液外泌體內(nèi)含多種“生物活性物質(zhì)”（如蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)、DNA、RNA等），與細(xì)胞間交流、免疫傳遞、血管生成、促進(jìn)凝血等生理功能密切相關(guān)［4］。近年來，唾液外泌體中多可檢測到上皮細(xì)胞及粒細(xì)胞的標(biāo)志物，提示唾液外泌體可能主要來自上皮細(xì)胞和粒細(xì)胞［5］。唾液外泌體性質(zhì)穩(wěn)定，長期儲(chǔ)存仍可保持其膜的完整性。提純后的唾液外泌體存儲(chǔ)于4 ℃條件下，28 d 內(nèi)仍可保持蛋白等內(nèi)容物的穩(wěn)定性，利于開展相關(guān)研究［6］。唾液外泌體具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的能力，從而影響受體細(xì)胞或分泌細(xì)胞的生理和病理功能?；谏鲜鎏匦?，開發(fā)唾液外泌體作為疾病診斷的生物標(biāo)志物的潛力具有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)唾液外泌體除與口腔疾病，如口腔癌［7］、牙周炎［8］、口腔扁平苔蘚［9］、干燥綜合征［10］等有關(guān)外，還同遠(yuǎn)處部位腫瘤如胰腺癌［11］、肺癌［12］等及系統(tǒng)性疾病如帕金森綜合征［13］、炎癥性腸病［14］等密切相關(guān)。本文就唾液外泌體與口腔疾病、遠(yuǎn)處部位腫瘤及系統(tǒng)性疾病的密切聯(lián)系作一綜述。

1 唾液外泌體與口腔癌

細(xì)胞外囊泡可以穿過上皮屏障，有助于將全身性來源的RNA、蛋白質(zhì)等從血液或組織轉(zhuǎn)移到唾液中。唾液外泌體很可能提供局部和全身性疾病和病癥的證據(jù)，因此，唾液外泌體分子水平濃度的任何改變都有可能作為生物標(biāo)志物預(yù)測或監(jiān)測各種疾病。近年來，唾液外泌體相關(guān)研究主要集中于口腔癌的早期檢測。

1.1 唾液外泌體與口腔癌早期診斷生物標(biāo)志物

同健康人相比，口腔癌患者唾液外泌體的數(shù)量及尺寸明顯升高，可通過簡化細(xì)胞間交流以促進(jìn)腫瘤的生長［7］。研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者唾液外泌體的CD63 含量升高，CD9 及CD81 明顯降低，而CD9 及CD81 參與細(xì)胞粘附及運(yùn)動(dòng)的功能調(diào)節(jié)，其表達(dá)降低有助于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這也提示了唾液外泌體可作為疾病的潛在生物標(biāo)志物［15］。

He 等［16］發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者腫瘤組織中的miR?24?3p 明顯增高，同時(shí)OSCC 患者唾液外泌體中的miR?24?3p 水平也明顯高于健康人，提示唾液外泌體中的miR?24?3p 可能來自于腫瘤細(xì)胞。而過量表達(dá)的miR?24?3p 通過作用于period1（PER1）基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，唾液外泌體miR?24?3p 可作為診斷OSCC 的生物標(biāo)志物。有學(xué)者通過比較OSCC 患者和健康人唾液外泌體的Alix 水平，發(fā)現(xiàn)OSCC 患者組唾液外泌體內(nèi)Alix 水平明顯升高，可作為診斷OSCC 的生物標(biāo)志物［17］。

除此之外，OSCC 患者唾液外泌體中miR?412?3p 和miR?512?3p 含量明顯升高，miR?302b?3p 和miR?517b?3p 選擇性富集于OSCC 患者的唾液外泌體中，這4 種miRNA 有作為診斷OSCC 生物標(biāo)志物的潛力［18］。

研究發(fā)現(xiàn)口腔癌患者唾液外泌體具有特異性紅外光譜特性［19］，可通過檢測蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸構(gòu)象的細(xì)微變化同健康人的唾液外泌體相區(qū)別。這種方法可進(jìn)一步研究，同檢測唾液外泌體的生物標(biāo)志物技術(shù)相結(jié)合，有利于診斷早期階段的口腔癌或口腔病變的潛在惡性轉(zhuǎn)化。

1.2 外泌體參與口腔癌發(fā)生發(fā)展

越來越多證據(jù)表明，外泌體參與腫瘤細(xì)胞惡性行為的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。如唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）細(xì)胞來源的外泌體，可以增強(qiáng)SACC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。Xu 等［20］發(fā)現(xiàn)SACC?83 細(xì)胞來源的外泌體與人牙周膜成纖維細(xì)胞相互作用后，促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)生長因子，從而增強(qiáng)SACC?83 細(xì)胞的侵襲能力。此外，學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡相關(guān)的免疫抑制是腫瘤逃避的重要機(jī)制之一，并與口腔癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如OSCC 細(xì)胞來源外泌體內(nèi)的miR?29a?3p 及CMTM6 可通過增強(qiáng)M2 亞型巨噬細(xì)胞極化以促進(jìn)OSCC 細(xì)胞的增殖和侵襲［21?22］。外泌體還可通過轉(zhuǎn)移致瘤性miRNA 來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中抑癌基因的表達(dá)，使無侵襲性的受體細(xì)胞擁有潛在的侵襲性。腫瘤微環(huán)境中來自腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞的外泌體一方面可通過抑制患者識(shí)別和攻擊癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)來促進(jìn)口腔或唾液腺癌的進(jìn)展；另一方面，腫瘤來源的外泌體可能是一種新的腫瘤抗原的來源，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌癥的免疫。

2 唾液外泌體與其它口腔疾病

2.1 牙周炎

目前牙周炎的診斷多依賴于臨床及影像學(xué)檢查而缺少根本性炎癥反應(yīng)的評(píng)估，因此研究者近年來不斷研究相關(guān)領(lǐng)域。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，相較于健康人，牙周炎患者唾液外泌體內(nèi)富含免疫相關(guān)蛋白，可能參與牙周炎發(fā)展過程中的免疫反應(yīng)［8］。Yu 等［23］通過qRT?PCR 檢測發(fā)現(xiàn)牙周炎患者唾液外泌體中的的程序性細(xì)胞死亡配體?1（pro?grammed cell death?ligand 1，PD?L1）mRNA 水平明顯高于健康人組，同時(shí)不同階段的牙周炎患者其PD?L1 mRNA 含量存在明顯差異。高水平的唾液外泌體PD?L1 與重度牙周炎相關(guān)，一方面反映了機(jī)體對(duì)炎癥組織破壞作用的抑制，另一方面反映了疾病的進(jìn)展。因此PD?L1 mRNA 可用于鑒別牙周炎患者及判斷其嚴(yán)重程度。Han 等［24］通過分析健康人、牙齦炎和牙周炎患者的唾液和唾液外泌體，成功發(fā)現(xiàn)唾液外泌體內(nèi)microRNA 的含量存在巨大差異而全唾液中卻無此差異。牙周炎患者唾液外泌體中hsa?miR?140?5p、hsa?miR?146a?5p 和hsa?miR?628?5p 較健康組明顯升高，可作為診斷牙周炎高精度的潛在生物標(biāo)志物。

同時(shí)，Tobón?Arroyave 等［25］發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，牙周炎患者唾液外泌體的CD9 和CD81 含量明顯降低。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)證明，這兩種生物標(biāo)志物的含量同牙周炎的階段及進(jìn)展速度成明顯負(fù)相關(guān)。唾液外泌體CD9、CD81 濃度降低可能在牙周病的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。Nik 等［26］通過比較慢性牙周炎和健康人唾液外泌體內(nèi)的miRNA，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎組唾液外泌體內(nèi)的hsa?miR?125a?3p 含量顯著升高，有作為慢性牙周炎生物標(biāo)志物的潛力。此外，牙周炎患者唾液外泌體DNA 的甲基化水平明顯高于健康組，也可作為診斷牙周炎的潛在生物標(biāo)志物［27］。眾多研究顯示，相較于全唾液，唾液外泌體更能作為診斷牙周炎的生物標(biāo)志物及反映牙周炎的進(jìn)展情況。

2.2 口腔扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化、干燥綜合征

口腔扁平苔蘚，一種病因不明的慢性炎癥性口腔黏膜疾病，同樣與唾液外泌體密切相關(guān)。研究者通過miRNA 微陣列芯片分析和qPCR 技術(shù)比較口腔扁平苔蘚患者和健康對(duì)照組唾液外泌體的miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)口腔扁平苔蘚患者唾液外泌體中miR?4484 的含量顯著上調(diào)，可作為口腔扁平苔蘚潛在的生物標(biāo)志物［9］。Zhou 等［28］發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNA ADAMTS9?AS2 可通過抑制AKT 信號(hào)通路抑制口腔黏膜下纖維化的進(jìn)展，且相較于口腔黏膜下纖維化及正常黏膜組織，其在OSCC 組織中表達(dá)下調(diào)，可作為診斷OSCC 的潛在生物標(biāo)志物。此外，唾液外泌體還與干燥綜合征密切相關(guān)，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探索［10］。

3 唾液外泌體與其它疾病

3.1 遠(yuǎn)處部位腫瘤

唾液外泌體不僅同口腔疾病密切相關(guān)，還同遠(yuǎn)處部位的腫瘤有關(guān)。如胰腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等遠(yuǎn)處腫瘤發(fā)生后，可從患者唾液內(nèi)檢測出特異性的生物標(biāo)志物。Lau 等［11］通過設(shè)計(jì)小鼠胰腺癌模型，發(fā)現(xiàn)了腫瘤外泌體與特異性唾液外泌體的聯(lián)系：腫瘤外泌體可通過血液循環(huán)到達(dá)唾液腺從而誘導(dǎo)具有特異性生物標(biāo)志物的唾液外泌體的合成，且抑制遠(yuǎn)端腫瘤部位外泌體的產(chǎn)生后可減少唾液特異性生物標(biāo)志物的生成。Sun 等［12］比較了肺癌患者和健康受試者唾液外泌體的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)癌癥患者和健康受試者之間存在近40%的差異，且肺癌患者特有的唾液外泌體蛋白質(zhì)中約30%與腫瘤的轉(zhuǎn)移、增殖密切相關(guān)。Machida等［29］通過比較胰膽系統(tǒng)腫瘤患者和健康對(duì)照組唾液外泌體中miRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者唾液外泌體中的miR?1246 和miR?4644 含量明顯增高，可作為胰膽系統(tǒng)腫瘤的生物標(biāo)志物以早期檢測腫瘤的發(fā)生。

3.2 系統(tǒng)性疾病

除遠(yuǎn)處部位的腫瘤性疾病外，唾液外泌體還與多種系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。如帕金森患者的唾液外泌體的數(shù)量及其內(nèi)的磷酸化α?突觸核蛋白、磷酸化α?突觸核蛋白/總α?突觸核蛋白比例較正常人明顯升高，可作為帕金森病的生物標(biāo)志物［13］。Cressatti 等［30］首次發(fā)現(xiàn)人體唾液來源的胞外囊泡中含有血紅素氧合酶?1 ，具有作為多種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的生物標(biāo)志物的潛力。近年來有學(xué)者通過使用液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀，比較炎癥性腸病患者和健康對(duì)照組唾液外泌體的蛋白構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)蛋白酶體亞基α7（proteasome subunit alpha type 7，PSMA7）蛋白在炎癥性腸病患者與健康對(duì)照組之間存在明顯差異，可作為炎癥性腸病的生物標(biāo)志物［14］。

唾液外泌體除與口腔及系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)可作為檢測疾病的生物標(biāo)志物外，還因其具有生物相容性好、脂質(zhì)雙分子層膜避免內(nèi)容物降解、易通過血腦屏障等各種生物屏障等的優(yōu)點(diǎn)，具有作為藥物載體的治療應(yīng)用前景［31］。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了唾液外泌體新的治療應(yīng)用方向：可用于治療糖尿病患者的口干癥和唾液腺功能障礙，及作為先天性免疫防御物質(zhì)防止部分病毒的感染等［32?33］。雖然唾液外泌體具有良好的治療前景，但目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，仍需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

唾液外泌體不僅是疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的來源，而且是一種創(chuàng)新的治療策略。然而，在臨床應(yīng)用之前必須解決許多挑戰(zhàn)，研究高效精確的外泌體分離和鑒定方法對(duì)提高外泌體的數(shù)量、質(zhì)量和下游分析是必要的。目前唾液外泌體常用的提取方法有兩種，分別為金標(biāo)準(zhǔn)的超速離心法及ExoQuick?TCTM（EQ）試劑盒提取法［34］。相較其它方法，超速離心法可獲得體積較為均一的囊泡，且雜質(zhì)最少［34?35］。而EQ 試劑盒則可從小體積的唾液中獲得外泌體。但目前常用的外泌體提取方法不能將其同病毒有效的分離，可能導(dǎo)致對(duì)結(jié)論的影響。因此研究如何提取高純度及有生物學(xué)活性的外泌體將有助于推動(dòng)外泌體領(lǐng)域的發(fā)展。此外，唾液外泌體功能、潛在機(jī)制的不斷研究將加深對(duì)唾液外泌體與口腔疾病、遠(yuǎn)處部位腫瘤及系統(tǒng)性疾病之間作用的理解，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。

【Author contributions】Sun Y wrote the article. Peng X，Cheng L reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.