隱孢子蟲入侵相關(guān)蛋白分子研究進(jìn)展

孫露露，謝褔杰，李娟鋒，邊嘯坤，王榮軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046)

隱孢子蟲屬是頂復(fù)門的一員，該門還包括其他被廣泛認(rèn)知的屬，如瘧原蟲屬(Plasmodium)和弓形蟲屬(Toxoplasma)等[1]。隱孢子蟲感染可引起隱孢子蟲病[2]，隱孢子蟲屬內(nèi)具有廣泛的遺傳多態(tài)性，目前已鑒定出43個(gè)隱孢子蟲有效蟲種和60多個(gè)隱孢子蟲基因型[3]。宿主攝入隱孢子蟲卵囊后，在胰酶和/或膽汁鹽等消化液作用下進(jìn)行脫囊并釋放出感染性子孢子，子孢子在宿主腸上皮細(xì)胞進(jìn)行滑行運(yùn)動(dòng)，并借助由微線體(micronemes)、棒狀體(rhoptries)和致密顆粒(dense granules)等分泌細(xì)胞器組成的頂端復(fù)合體入侵宿主細(xì)胞[4]。入侵的子孢子在宿主細(xì)胞膜下形成納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)，進(jìn)而發(fā)育為滋養(yǎng)體(trophozoite)并進(jìn)入裂殖生殖階段[5]。研究顯示，這些分泌細(xì)胞器會(huì)分泌大量的入侵相關(guān)蛋白分子，例如糖蛋白(glycoprotein)、黏蛋白(mucoprotein)等，試驗(yàn)證明多種入侵相關(guān)蛋白分子可介導(dǎo)蟲體入侵過程[6-8]。針對隱孢子蟲頂端復(fù)合體蛋白的特異性抗體和抑制劑可以阻斷宿主細(xì)胞的入侵，目前多數(shù)研究均集中于鑒定入侵階段分泌的相關(guān)蛋白分子[9]。

目前國內(nèi)外對隱孢子蟲入侵機(jī)制、致病機(jī)制以及宿主防御隱孢子蟲感染的免疫調(diào)控機(jī)制的研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍需大量深入的研究，以滿足開發(fā)設(shè)計(jì)抗隱孢子蟲藥物和疫苗之所需[10]。本文主要根據(jù)寄生蟲學(xué)者對以下5種隱孢子蟲入侵相關(guān)蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究做一綜述。

1 磷脂酶A2

磷脂酶(phospholipase)是一種以多種形式存在并能夠水解甘油磷脂酯鍵的酶，根據(jù)水解位點(diǎn)不同可將磷脂酶分為磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)、磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)、磷脂酶B(phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)和磷脂酶D(phospholipase D，PLD)[11]。磷脂酶A2家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)不同，可分為分泌型磷脂酶A2(secreted phospholipase A2，sPLA2)、非鈣依賴型磷脂酶A2(calcium-independent phospholipase A2，iPLA2)、胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)和脂肪滋養(yǎng)蛋白磷脂酶A2(patatin-like phospholipase A2，PLP)[12]。研究顯示，磷脂酶A2為頂復(fù)門原蟲發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵酶，主要與頂復(fù)門原蟲入侵有關(guān)。相關(guān)的理論多來自于弓形蟲和瘧原蟲的研究，而在隱孢子蟲上的生物學(xué)功能研究相對較少[13]。

Pollok R C等[14]通過用特異性分泌型磷脂酶A2抑制劑和抗分泌型磷脂酶A2抗體來檢測微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)來源的分泌型磷脂酶A2在促進(jìn)微小隱孢子蟲入侵人腸上皮細(xì)胞中的潛在作用。首先利用微小隱孢子蟲體外感染人腸上皮細(xì)胞系試驗(yàn)，確定微小隱孢子蟲來源的分泌型磷脂酶A2活性與幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)的磷脂酶A2活性相同，這一結(jié)果表明，在微小隱孢子蟲入侵階段存在分泌型磷脂酶A2，并推測其可能在人腸上皮細(xì)胞的入侵過程中發(fā)揮重要作用。其次用分泌型磷脂酶A2抑制劑(對溴代苯甲?；?預(yù)處理微小隱孢子蟲子孢子后感染腸上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示腸上皮細(xì)胞的感染被顯著抑制，與未感染組相比，對溴代苯甲?；鍖δc上皮細(xì)胞沒有抑制作用，這一結(jié)果表明，抑制劑是作用于微小隱孢子蟲而不是腸上皮細(xì)胞；同時(shí)利用蜂毒分泌型磷脂酶A2多克隆抗體阻斷微小隱孢子蟲感染腸上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示微小隱孢子蟲對腸上皮細(xì)胞的感染也被顯著抑制，以上結(jié)果表明分泌型磷脂酶A2抑制劑和分泌型磷脂酶A2多克隆抗體可以顯著降低蟲體的入侵率。最后用意大利蜜蜂(Apismellifera)毒液來源的分泌型磷脂酶A2對微小隱孢子蟲子孢子進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示子孢子對腸上皮細(xì)胞的入侵無顯著性差異。這一結(jié)果支持了微小隱孢子蟲來源的分泌型磷脂酶A2在入侵過程中發(fā)揮作用。Carryn S等[15]通過體外檢測微小隱孢子蟲活力和侵染性試驗(yàn)，將單克隆抗體(3E2)單獨(dú)孵育微小隱孢子蟲子孢子，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示單克隆抗體(3E2)顯著抑制子孢子的附著和入侵，將磷脂酶A2與單克隆抗體(3E2)結(jié)合后共同作用于微小隱孢子蟲子孢子，觀察結(jié)果顯示磷脂酶A2抑制子孢子的附著和入侵，表明磷脂酶A2可減少微小隱孢子蟲活力和侵染性。然而抑制效果沒有單獨(dú)使用單克隆抗體(3E2)強(qiáng)，但無論是單獨(dú)使用還是與抗隱孢子蟲的中和單克隆抗體聯(lián)合使用，磷脂酶A2都具有作為抗隱孢子蟲藥物的潛力。

2 Cp2

O'hara S P等[16]通過微小隱孢子蟲體外感染人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(HCT-8)試驗(yàn)檢測Cp2特性，根據(jù)氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，Cp2是一種分泌型膜蛋白，利用免疫熒光和免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Cp2蛋白在子孢子中富集并始終定位于滋養(yǎng)體和Ⅰ型分裂體的的納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)上。在微小隱孢子蟲的性發(fā)育過程中，Cp2蛋白的表達(dá)水平更高，表明Cp2是一個(gè)在微小孢子蟲所有發(fā)育階段都有表達(dá)的蛋白。

Lee S U等[17]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR( real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法檢測微小隱孢子蟲Cp2基因作為活性標(biāo)記的有效性，通過將Cp2基因與熱休克蛋白70(70 ku heat shock protein，HSP70)、隱孢子蟲卵囊壁蛋白[18]、β-微管蛋白(β-tubulin)和小核糖體RNA(18S rRNA)基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Cp2基因被鑒定為最敏感、最可靠、最準(zhǔn)確的候選基因，可作為微小隱孢子蟲活性的有效標(biāo)記。基于這一點(diǎn)，Jenkins M C等[19]利用熒光定量檢測微小隱孢子蟲在脫囊過程中Cp2蛋白的基因信使RNA(mRNA)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了高水平的上調(diào)，于是推測可能是Cp2蛋白在蟲體入侵準(zhǔn)備階段的合成顯著增加。隨后，Mukerjee A等[20]通過將NP-906(一種納米抑制劑)與隱孢子蟲特異性蛋白Cp2的抗體偶聯(lián)，以特異性地靶向微小隱孢子蟲，和未與Cp2抗體結(jié)合的NP-906相比，結(jié)果顯示Cp2抗體偶聯(lián)納米顆粒(Cp2-NP-906)經(jīng)過預(yù)孵育后，細(xì)胞培養(yǎng)中的微小隱孢子蟲感染水平降低了200倍，而同濃度條件的未與Cp2抗體結(jié)合的NP-906使微小隱孢子蟲感染水平降低了4.4倍，說明Cp2-NP-906可以顯著降低培養(yǎng)細(xì)胞中微小隱孢子蟲的感染率，表明Cp2抗體對微小隱孢子蟲入侵宿主細(xì)胞具有一定的阻斷作用，從而也證明了Cp2蛋白介導(dǎo)蟲體入侵過程。

3 Cpa135

微小隱孢子蟲Cpa135蛋白是通過頂端復(fù)合體表達(dá)和分泌的多結(jié)構(gòu)域抗原蛋白[21]。該蛋白的特征之一是具有LCCL結(jié)構(gòu)域，這也是頂復(fù)門原蟲中各種分泌蛋白的共同特征。研究顯示，LCCL結(jié)構(gòu)域蛋白在微小隱孢子蟲子孢子時(shí)期表達(dá)[22]。蛋白同源性分析結(jié)果表明，Cpa135相關(guān)蛋白是頂復(fù)門原蟲LCCL蛋白中一個(gè)獨(dú)特的家族[23]。蛋白組學(xué)分析證明微小隱孢子蟲在與HCT-8相互作用過程中分泌的蛋白發(fā)揮一定的生物學(xué)功能[24]。

有研究表明,Cpa135基因可作為識別隱孢子蟲感染人類的有效標(biāo)記[25]。Tosini F等[26]在微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞試驗(yàn)中，利用RNA印跡法(Northern blot)鑒定出Cpa135的信使RNA(mRNA)；并通過蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定出在脫囊過程中，由Cpa135基因編碼的Cpa135蛋白的含量迅速增加，在30 min內(nèi)明顯穩(wěn)定；最后由熒光定量檢測結(jié)果顯示Cpa135cDNA在24 h和48 h均未檢測到熒光信號，而在72 h出現(xiàn)陽性信號，在96 h時(shí)信號幾乎無法探測到，表明微小隱孢子蟲入侵HCT-8細(xì)胞后，Cpa135基因持續(xù)沉默至48 h，72 h后mRNA的合成再次活躍，Cpa135在HCT-8細(xì)胞上的免疫熒光至少連續(xù)存在96 h。綜上研究結(jié)果表明Cpa135蛋白介導(dǎo)微小隱孢子蟲入侵過程。

4 CpSUB

類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like proteases，SUB)是屬于絲氨酸蛋白酶家族的一種。目前，隱孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶1(Cryptosporidiumsubtilisin-like proteases 1，CpSUB1)是唯一在微小隱孢子蟲中表達(dá)的枯草酶。Tomazic M L等[27]的研究結(jié)果表明，該酶具有高度的保守性、免疫原性和表達(dá)性，并在犢牛感染早期時(shí)在體內(nèi)被識別。

Wanyiri J W等[28]通過微小隱孢子蟲體外感染HCT-8細(xì)胞試驗(yàn)檢測CpSUB1的特性，結(jié)果顯示在微小隱孢子蟲裂解液中存在人呋喃型和蛋白酶活性，其活性可將糖蛋白gp40/15加工裂解成gp40和gp15。Cui Z H等[29]的研究結(jié)果顯示，抗gp40/15和抗gp40抗體可在體外中和微小隱孢子蟲感染，表明gp40/15的特異性抗體可阻斷蟲體入侵過程。此外，Wanyiri J W等[30]根據(jù)熒光定量分析鑒定隱孢子蟲CpSUB1蛋白血清以劑量依賴的方式顯著抑制隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞，表明CpSUB1抗體也可阻斷蟲體的入侵。除特異性抗體外，該酶的有關(guān)抑制劑在蟲體入侵過程中也發(fā)揮同樣的作用。例如，F(xiàn)eng X等[31]利用體外試驗(yàn)檢測類枯草菌蛋白酶抑制劑和其他絲氨酸蛋白酶抑制劑對隱孢子蟲活性的影響，結(jié)果顯示微小隱孢子蟲的感染的感染率顯著降低。Ch Stratakos A等[32]逐漸增加CpSUB1抑制劑(Auranta3001)的劑量后，結(jié)果顯示微小隱孢子蟲感染率呈劑量依賴性降低。不僅CpSUB1的特異性抗體和抑制劑能夠達(dá)到阻斷蟲體入侵的效果，而且研究表明，通過誘導(dǎo)CpSUB1的mRNA表達(dá)的沉默同樣能夠減少95%的隱孢子蟲從感染的腸上皮細(xì)胞中逸出，表明CpSUB1在逸出過程中發(fā)揮一定的作用，并提示在這一階段中斷隱孢子蟲生命周期也很有可能有效抑制蟲體入侵[33]。由此證明，CpSUB1可成為未來研究和開發(fā)抗隱孢子蟲藥物和疫苗的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

5 CpMuc

O'connor R M等[34]通過隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫鑒定出在2號染色體上有7條黏蛋白小序列，將其命名為隱孢子蟲黏蛋白(Cryptosporidiummucoproteins，CpMucs)。由于在任何其他頂復(fù)門基因組中沒有發(fā)現(xiàn)同源物，說明這些黏蛋白為隱孢子蟲所特有。Paluszynski J等[35]的研究表明隱孢子蟲黏蛋白4(Cryptosporidiummucoprotein 4，CpMuc4)可直接與人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco2A)受體相互作用，并在入侵過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。O'connorR M等[34]根據(jù)免疫熒光檢測結(jié)果顯示抗CpMuc4抗體和抗隱孢子蟲黏蛋白5(Cryptosporidiummucoprotein 5，CpMuc5)抗體均與微小隱孢子蟲的頂端區(qū)域發(fā)生反應(yīng)，顯示出表面暴露的抗原表位，并且具有該抗原表位的抗體在體外抑制微小隱孢子蟲的感染，表明黏蛋白CpMuc4和CpMuc5由頂端區(qū)分泌，它們的特異性抗體均可阻斷子孢子入侵Caco2A的上皮細(xì)胞[35]。

6 展望

大量證據(jù)表明，隱孢子蟲入侵相關(guān)蛋白分子介導(dǎo)宿主細(xì)胞的入侵過程，并發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前對隱孢子蟲入侵相關(guān)蛋白分子的功能研究相對較少，因此針對隱孢子蟲入侵相關(guān)蛋白，重點(diǎn)解析它們的結(jié)構(gòu)以及與宿主的互作機(jī)制將是一個(gè)重點(diǎn)研究方向，可以為防治隱孢子蟲引起的相關(guān)疾病提供重要的參考依據(jù)，研究結(jié)果也必將為設(shè)計(jì)開發(fā)抗隱孢子蟲病藥物或疫苗提供新的思路和策略。