16S rRNA測(cè)序技術(shù)在動(dòng)物呼吸道微生物多樣性研究的進(jìn)展

李 娟，郝婷婷，張慧瑩，劉 剛，米耀云，李河林，敬曉棋*

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/榆林市動(dòng)物疾病診斷與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西榆林 719000；2.清澗縣農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，陜西榆林 718399；3.榆林市榆陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000)

呼吸系統(tǒng)疾病對(duì)動(dòng)物健康和畜牧經(jīng)濟(jì)效益影響巨大，呼吸道微生物與呼吸道疾病的相關(guān)性也逐漸被發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物呼吸系統(tǒng)微生物功能機(jī)制的研究，已成為對(duì)畜禽生產(chǎn)具有重大科學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的課題。準(zhǔn)確了解呼吸系統(tǒng)微生物多樣性，對(duì)該類疾病的有效預(yù)防、合理用藥意義重大。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)有很大的局限性，無(wú)法完全模擬機(jī)體環(huán)境，只能對(duì)1%～3%的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，不能獲取樣本中的全部微生物，且培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度較低、特異性差，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)體內(nèi)復(fù)雜微生物群落的研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)在動(dòng)物呼吸系統(tǒng)微生物多樣性研究中應(yīng)用越來(lái)越多。文中將對(duì)16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)的概況以及其研究動(dòng)物呼吸道微生物多樣性在不同部位的差異、外界因素對(duì)呼吸道微生物多樣性的影響方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序概述

在細(xì)菌總RNA中16S rRNA占80%以上，16S rRNA基因序列中含9個(gè)可變區(qū)及10個(gè)保守區(qū)，保守區(qū)是細(xì)菌共有部分，反映物種間的親緣關(guān)系；而可變區(qū)體現(xiàn)了物種間的差異，差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)是選擇16S rRNA上的可變區(qū)，用通用引物擴(kuò)增樣品DNA、高通量測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果與已知16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分析獲得樣本物種分類及豐度、菌群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等諸多信息。

16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了一代測(cè)序、二代測(cè)序、三代測(cè)序三個(gè)階段。一代測(cè)序技術(shù)主要指1977年Sanger F等[1]提出的DNA雙脫氧鏈終止法和Maxam A M等[2]提出的DNA化學(xué)降解測(cè)序法。Sanger法(用2,3-雙脫氧核苷三磷酸作底物，測(cè)定DNA中核苷酸序列)的優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)可達(dá)1 000 bp，準(zhǔn)確性可達(dá)99.999%，因測(cè)試速度慢、成本高、通量低等不足，沒(méi)有被大范圍的應(yīng)用。經(jīng)過(guò)不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，在2005年-2008年間，陸續(xù)產(chǎn)生了454測(cè)序系統(tǒng)、Solexa測(cè)序技術(shù)以及SOLiD測(cè)序技術(shù)等二代測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)具有通量高、覆蓋率高、速度快的優(yōu)勢(shì)，但卻存在讀長(zhǎng)短的缺陷，不利于生物信息學(xué)分析，且易受GC含量和重復(fù)讀長(zhǎng)的影響。2008年之后出現(xiàn)的He-licos單分子測(cè)序儀、SMRT技術(shù)和納米孔單分子測(cè)序技術(shù)等三代測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)長(zhǎng)、運(yùn)行快、不受GC堿基偏好影響、直接檢測(cè)表觀修飾位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn),無(wú)PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，避免PCR擴(kuò)增引入錯(cuò)誤，在微生物的分類鑒定和群落多樣性的研究中更具有優(yōu)勢(shì)。目前，PacBio等三代測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA可進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，序列比對(duì)率和鑒定準(zhǔn)確率都高于二代測(cè)序[3]。

16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)最初在無(wú)機(jī)環(huán)境如水、土壤、食品微生物群組研究中應(yīng)用，現(xiàn)已廣泛用于畜禽、水生動(dòng)物、野生動(dòng)物及人等機(jī)體腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和組成的檢測(cè)，近年也開(kāi)始在呼吸道微生物研究中應(yīng)用。

2 在動(dòng)物呼吸系統(tǒng)微生物多樣性研究中的應(yīng)用

16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了對(duì)呼吸道存在的難以培養(yǎng)、低生物量微生物群落的研究，豐富了人們對(duì)呼吸道內(nèi)環(huán)境的認(rèn)識(shí)。之前一直認(rèn)為氣管、支氣管、肺臟等下呼吸道是無(wú)菌的，2010年，Hilty等對(duì)肺部進(jìn)行16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)了肺臟部位微生物的存在[4]。呼吸道復(fù)雜的微生物群組，在維持呼吸道健康、誘導(dǎo)呼吸道疾病的發(fā)生中起著重要的作用。通過(guò)對(duì)呼吸系統(tǒng)微生物多樣性的研究，探索其作用的具體機(jī)理是最近階段的熱門(mén)課題。

2.1 健康動(dòng)物呼吸道中的微生物多樣性在不同空間位點(diǎn)有差異性

呼吸系統(tǒng)各部位的生理結(jié)構(gòu)和理化特征不同，微生物組成也有差異。研究發(fā)現(xiàn)，某些致病菌在健康動(dòng)物上呼吸道的能夠正常共生，卻也能在全球范圍內(nèi)引起地方性肺炎[5]。因此，了解上、下呼吸道微生物組之間復(fù)雜的相互作用，已成為一個(gè)對(duì)動(dòng)物健康和養(yǎng)殖回報(bào)具有重大科學(xué)興趣的話題。Pirolo M等[6]詳細(xì)綜述了豬上呼吸道和下呼吸道的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)上呼吸道的主要為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，與下呼吸道的相對(duì)豐度方面存在差異；鼻咽腔和口咽腔微生物在屬水平上有顯著差異。何川川[7]研究健康與患病綿羊鼻腔、氣管上端、氣管下端、肺臟幾個(gè)部位微生物的分布狀況，發(fā)現(xiàn)健康綿羊呼吸系統(tǒng)4個(gè)部位的細(xì)菌和真菌在門(mén)、屬水平上有差異，從鼻腔部位至肺臟微生物物種的豐富度有所降低，但均勻度有所增加。健康綿羊呼吸道內(nèi)部幾乎都有真菌群的存在，但在病羊呼吸道的幾個(gè)部位中并未檢測(cè)出真菌。Mcmullen C等[8]詳細(xì)研究健康牛整個(gè)呼吸道17個(gè)部位存在的細(xì)菌微生物不同部位微生物群落的豐富度和多樣性。這些差異是由各種類群驅(qū)動(dòng)的，特別是支原體、鏈球菌和梭桿菌；肺微生物群與鼻咽部更相似。上呼吸道微生物群落豐富度比下呼吸道高，可能是因?yàn)樯虾粑浪幁h(huán)境細(xì)菌負(fù)荷更高[9]，微生物種類更為豐富。

2.2 健康動(dòng)物呼吸道中的微生物多樣性在不同時(shí)間點(diǎn)有差異性

健康動(dòng)物呼吸道微生物在不同時(shí)間也會(huì)有所變化。呼吸道微生物在母體分娩過(guò)程中、出生后就開(kāi)始定植，后期因生長(zhǎng)活動(dòng)和外界因素的變化而變化。母豬的陰道和乳頭皮膚微生物群是仔豬出生前8 h上呼吸道的重要來(lái)源[10]，出生后前7周內(nèi)鼻腔微生物群的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，斷奶后2周～3周后趨于穩(wěn)定[11]。牛鼻咽部細(xì)菌的豐度(16S rRNA基因拷貝數(shù))從出生到14 d顯著增加，然后略有下降到35 d[12]或保持到 42 d[13]。斷奶前犢牛鼻咽微生物群以變形菌門(mén)為主，第14天后，顯示其微生物的多樣性(結(jié)合豐富度和均勻度)增加，最豐富的細(xì)菌屬為曼氏菌、莫拉氏菌、支原體、嗜冷桿菌和假單胞菌。同時(shí)這些屬的細(xì)菌的相對(duì)豐度隨時(shí)間的推移而變化，莫拉氏菌的相對(duì)豐度在第14天至第35天之間下降，曼海氏菌和支原體的相對(duì)豐度同時(shí)大幅增加[12]。Ngunjiri J M等[14]對(duì)健康蛋雞在1、3、5、8、12、16、25、36、51周齡時(shí)，呼吸道微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)年齡對(duì)呼吸道微生物細(xì)菌β多樣性有巨大影響。隨著雞的年齡增長(zhǎng)，氣管微生物群落組成發(fā)生著非常緩慢的變化，在育雛(0周～5周)、生長(zhǎng)(6周～16周)和產(chǎn)蛋(17周以后)階段之間沒(méi)有明顯的差異。鼻微生物群落在育雛和成長(zhǎng)階段逐漸轉(zhuǎn)變，在過(guò)渡到產(chǎn)蛋階段(16周～25周)后變化更為劇烈。

2.3 動(dòng)物呼吸道微生物多樣性受外界因素的影響

呼吸道微生物群落與宿主處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持呼吸道健康。當(dāng)外界環(huán)境改變超過(guò)微生物系統(tǒng)調(diào)節(jié)范圍時(shí)，這種平衡被破壞，條件致病微生物開(kāi)始發(fā)揮作用，表現(xiàn)出咳嗽、流鼻涕、呼吸困難等臨床癥狀。

2.3.1 環(huán)境因素影響 呼吸道傳染病的發(fā)生往往與周?chē)h(huán)境密切相關(guān)。環(huán)境因子的改變引起宿主免疫力降低，易感性增加，誘發(fā)傳染病。運(yùn)用16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，氣態(tài)氨濃度、輸送、農(nóng)場(chǎng)管理等環(huán)境因素對(duì)呼吸道傳染病也有影響。

氨氣是養(yǎng)殖場(chǎng)主要污染氣體之一，氣態(tài)氨對(duì)動(dòng)物和人類健康有害，濃度高的氣態(tài)氨對(duì)呼吸道刺激強(qiáng)烈，能夠抑制呼吸系統(tǒng)的效率。Wang T X等[15]研究了低濃度氣態(tài)氨暴露期間豬鼻腔微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，氨水平升高，會(huì)顯著損害氣管黏膜和肺泡，并降低生長(zhǎng)性能；高出一定值會(huì)減少乳酸桿菌等有益細(xì)菌的定植，增加莫拉氏菌和鏈球菌的數(shù)量。

運(yùn)輸使動(dòng)物暴露于各種潛在壓力之下，帶來(lái)嚴(yán)重的影響。運(yùn)輸引發(fā)的呼吸道疾病，與特定病原體無(wú)關(guān)，與不同細(xì)菌種類的組合有關(guān)[16]。之前有研究顯示，肉牛[17]和馬[18]經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸轉(zhuǎn)移到新環(huán)境時(shí)，鼻咽微生物群的多樣性發(fā)生顯著變化。Zhao F W等[19]通過(guò)16S rRNA測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)健康驢子經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸后，驢鼻腔微生物群中變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的細(xì)菌數(shù)量增加，厚壁菌門(mén)的細(xì)菌數(shù)量減少，改變了鼻微生物群的豐富性和多樣性。

Weese等[20]報(bào)道了不同飼喂方式導(dǎo)致豬鼻腔微生物群中巨球菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬和纖維桿菌屬等的相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著差異。Nicola等使用IlluminaMiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)來(lái)自6個(gè)不同農(nóng)場(chǎng)犢牛呼吸道的微生物群落組成進(jìn)行了表征和比較，發(fā)現(xiàn)不同農(nóng)場(chǎng)的牛呼吸道微生物群落組成不同。

2.3.2 抗生素影響 在養(yǎng)殖業(yè)中抗生素是動(dòng)物治療和保健中最常用也是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。但抗生素的使用與病原菌耐藥基因的傳播和增多密切相關(guān)。已有研究表明，抗生素的活性譜、給藥途徑、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性不同，對(duì)微生物群組成的影響不同；給藥途徑、持續(xù)時(shí)間和劑量也會(huì)對(duì)微生物群組產(chǎn)生不同的影響[21]?？股貙?duì)呼吸道不同部位的影響過(guò)程以及潛在的機(jī)制仍然是一個(gè)主要的研究目標(biāo)。

Kathy T M等[22]首次發(fā)現(xiàn)斷奶后仔豬在接受土霉素的飼料添加與肌肉注射兩種給藥方式時(shí)，鼻腔細(xì)菌多樣性都會(huì)下降，對(duì)扁桃體微生物群的影響不大。與注射法相比，飼料中添加土霉素對(duì)鼻腔微生物群的影響更大，可能與豬采食時(shí)鼻腔和飼料中的土霉素接觸更多有關(guān)。Bond等[23]使用高通量測(cè)序研究地塞米松對(duì)健康馬和輕度哮喘馬的上、下呼吸道細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)健康馬和輕度哮喘馬的上呼吸道微生物群的作用效果不明顯，但對(duì)健康馬和輕度哮喘馬的下呼吸道微生物群都有影響。地塞米松給藥10 d后，健康馬和輕度哮喘馬的下呼吸道都經(jīng)歷了11個(gè)OTU豐度的顯著變化，鏈球菌屬等OTU豐度增加，而CandidatusSaccaribacteriaOTU豐度減少，也沒(méi)有檢測(cè)到下呼吸道炎癥對(duì)地塞米松的免疫抑制作用的影響造成的差異。Mohamed Z等[24]研究結(jié)晶性頭孢噻呋游離酸(CCFA)、硫拉霉素(TUL)、氧環(huán)素(OTC)和普卡因西林G(PPG，PPG)5種不同抗生素胃腸外常規(guī)劑量給藥后，健康生長(zhǎng)的豬鼻腔微生物群落組成和多樣性在第1、3、7、14天的變化。結(jié)果顯示，抗生素腸外單劑量給藥對(duì)豬鼻腔微生物群會(huì)產(chǎn)生影響，而這種影響是可變的。在不同的抗菌組之間，不同采樣日細(xì)菌屬相對(duì)豐度變化的時(shí)間模式不同。這一發(fā)現(xiàn)將有助于制定抗生素的替代策略，以改善豬的健康和生產(chǎn)。

2.4 腸道微生物的影響

研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群可通過(guò)與肺部微生物群之間的串?dāng)_影響肺部健康，這被稱為“腸-肺軸”[25],“腸-肺軸”是雙向的，即腸道微生物群通過(guò)腸道免疫細(xì)胞識(shí)別共生體和病原體后，釋放的微生物產(chǎn)物和免疫調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)肺免疫，影響肺微生物群，反之亦然。微生物群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸、代謝物或細(xì)菌素，可能會(huì)直接與病毒顆粒相互作用，改變侵染力或治療效果[26]。在醫(yī)學(xué)上，對(duì)新冠肺炎患者的上呼吸道和腸道微生物進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，結(jié)果顯示從感染初期的生態(tài)失調(diào)到后來(lái)多樣化的整個(gè)過(guò)程都在同步變化。這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)沒(méi)有針對(duì)COVID-19的特定抗病毒藥物和疫苗的情況下，對(duì)新型冠狀病毒防控具有臨床意義[27]。腸道和呼吸道微生物群的精確干預(yù)和調(diào)節(jié)可能提供新的治療選擇，益生菌(如雙歧桿菌和糞桿菌)、益生元(如低聚木糖)治療或共生治療可用于調(diào)節(jié)腸道和呼吸道微生物群，以促進(jìn)COVID-19患者的康復(fù)[28]。在動(dòng)物方面，Meera等應(yīng)用16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究腸道微生物組成對(duì)豬肺炎支原體易感性的影響，分析3周齡(斷奶)、8周齡(接種豬肺炎支原體之前)和12周齡(接種豬肺炎支原體之后)時(shí)，豬腸道中細(xì)菌群落的差異和豐度，認(rèn)為仔豬腸道微生物組的多樣性和組成與豬肺炎支原體接種后的發(fā)展有潛在關(guān)聯(lián)[29]。腸道微生物群的缺乏增加了雞感染馬立克氏病病毒的嚴(yán)重程度，同時(shí)在感染后4 d，腸道菌群衰竭，雞法氏囊中IFN-α、IFN-β和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄增加[30]。

3 小結(jié)與展望

上面介紹了16S rRNA基因測(cè)序的基本概況，歸納了用16S rRNA測(cè)序技術(shù)評(píng)估時(shí)空、環(huán)境、抗生素、腸道微生物對(duì)動(dòng)物呼吸道微生物多樣性的影響。表明不同時(shí)空位點(diǎn)、環(huán)境條件、抗生素作用及腸道微生物，都會(huì)影響動(dòng)物呼吸道微生物群落的多樣性。

16S rRNA測(cè)序技術(shù)極大的推動(dòng)了人類探索和研究動(dòng)物呼吸道微生物多樣性的進(jìn)程，但仍有一些不可回避的局限性，如對(duì)樣本中物種組成只能分辨到屬水平的相對(duì)豐度；且結(jié)果受樣本起始濃度、PCR循環(huán)數(shù)、擴(kuò)增引物等諸多因素影響；基于DNA的微生物分析目前無(wú)法區(qū)分DNA、活細(xì)菌和被肺免疫機(jī)制殺死的細(xì)菌，導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌豐度和多樣性的高估等問(wèn)題。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展、測(cè)序平臺(tái)的改進(jìn)、信息技術(shù)的提升，16S rRNA測(cè)序技術(shù)將得到不斷完善，應(yīng)用前景更加廣闊。在動(dòng)物呼吸道微生物多樣性研究中，16S rRNA區(qū)域的選擇、測(cè)序平臺(tái)和用于分析的生物信息學(xué)工具存在顯著差異[6]。試劑盒[31]、采樣部位和采樣方法也是造成不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果差異的因素。因此，我們認(rèn)為，今后關(guān)于宏基因組分、試劑盒選擇、采樣或?qū)②呌跇?biāo)準(zhǔn)化，更有利于研究。

人們對(duì)動(dòng)物呼吸道微生物群落的認(rèn)識(shí)還比較有限，相關(guān)研究多見(jiàn)于多樣性的分析和病原菌的篩選方面，微生物群落與動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病之間復(fù)雜的相互關(guān)系和作用機(jī)制，將是今后研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

研究范圍全面系統(tǒng)化。隨著微生物組研究的不斷發(fā)展，越來(lái)越明顯的是，動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能在一定程度上受棲息在體內(nèi)不同的非致病共生體的影響。今后，呼吸道微生物多樣性的研究位點(diǎn)的選擇將趨于整個(gè)系統(tǒng) 、時(shí)間選擇也將會(huì)趨于對(duì)整個(gè)生命周期、比較的層面也更加全面，從動(dòng)物整體免疫機(jī)能角度研究呼吸道疾病的防治。