山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病流行現(xiàn)狀和防控技術(shù)研究進(jìn)展

曹啟航，姜悅才，張?zhí)炝?，馮舒童，馬文濤*，陳德坤*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西千陽莎能奶山羊發(fā)展有限公司, 陜西千陽 721100)

山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病是由偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,CP)引起的一種人畜共患病和慢性接觸性傳染病，又稱為山羊干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA)。該病多發(fā)生于山羊和綿羊，前期主要表現(xiàn)為頜下、肩前和腹下等部位的淺表淋巴結(jié)腫大，呈橢圓形腫塊，質(zhì)地較軟且無發(fā)熱；中期腫塊較硬且局部發(fā)熱，穿刺后內(nèi)容物呈暗紅色炎性膿汁；后期腫塊破潰，內(nèi)容物呈帶血豆渣樣膿汁，因細(xì)菌未被徹底清除，可能會在患部或周圍部位產(chǎn)生新的膿腫。大多數(shù)患羊出現(xiàn)腹瀉、漸進(jìn)性消瘦甚至死亡，死后剖檢可見內(nèi)臟器官腫大、膿腫。目前，該病呈全球性分布且尚無快速、簡便的診斷技術(shù)。由于該病發(fā)展緩慢，集約化養(yǎng)殖往往難以發(fā)現(xiàn)且難以徹底根除，導(dǎo)致病羊生產(chǎn)和繁殖能力下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展，威脅人類健康。論文主要從生物學(xué)特性、流行現(xiàn)狀、疾病的診斷和防控方面對該病的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，以期為該病的防控提供參考。

1 偽結(jié)核棒狀桿菌的生物學(xué)特性

1888年，Edward Nocard在患有淋巴結(jié)炎的奶牛體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)偽結(jié)核棒狀桿菌。1891年，Preisz在母羊的類似結(jié)核病變組織中成功分離到該菌，因其與結(jié)核分支桿菌的干酪樣結(jié)節(jié)形態(tài)相似，將其命名為偽結(jié)核桿菌[1]。1948年，在第6版《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中被正式命名為偽結(jié)核棒狀桿菌，又稱為假結(jié)核棒狀桿菌[2]。

CP為革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)寄生菌，無芽孢，無莢膜，有菌毛。大小約為0.5 μm×(1.0～3.0)μm，其形態(tài)主要呈球桿狀[3]。該菌在37 ℃、中性條件下生長良好。該菌的生存能力較強(qiáng)，可在干燥、低溫和高鹽等環(huán)境下生長，在自然環(huán)境下能存活較長時間。接種在普通固體培養(yǎng)基時，細(xì)菌生長稀疏；在血平板生長的菌落起初如針尖大小，隨著細(xì)菌不斷生長，菌落逐漸變大且不透明，還會產(chǎn)生較窄的β-溶血環(huán)。該菌在土壤、水源、皮膚和感染部位等均能被發(fā)現(xiàn)[4]。

2 山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的流行現(xiàn)狀

該病在封閉集約化養(yǎng)殖場中多發(fā)，與品種無關(guān)。主要在成年母羊中易感，3歲羊居多，2歲和4歲次之，1歲和5歲以上更少。全年均可發(fā)生，但以春夏季節(jié)為主，其中7月份最高，5、6、8、9月份次之，其他月份更少[5]。山羊主要通過破損的皮膚黏膜接觸被污染的飼料、器具、糞便和環(huán)境等途徑感染，還可經(jīng)呼吸道吸入污染的氣溶膠顆粒而感染。

據(jù)報道，CP在全球范圍內(nèi)廣泛分布，涉及歐洲、美洲、澳洲、非洲和亞洲等地區(qū)。澳大利亞西部的羊群患病率為20%以上，新西蘭的成年羊的患病率為7.1%，美國西部母羊的患病率高達(dá)42.5%，加拿大成年羊的患病率達(dá)到36%左右[6-7]。因此，也可證明該病患病率與年齡相關(guān)，大多成年羊群會發(fā)病。劉昭平[8]對福建福安市周邊羊場進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中發(fā)病羊場占60%以上，發(fā)病率高達(dá)20%；有研究人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在廣西馬山縣的年發(fā)病率約為10%[9]；鄭國英等[10]對昆明市西山區(qū)的38 225只山羊進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病的發(fā)病率約為10.3%，病死率為0.1%左右；2018年，該病在貴州黔東南州首次被發(fā)現(xiàn)[11]。張斯旂等[12]對四川3個縣的山羊養(yǎng)殖場進(jìn)行皮下膿腫的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率在3.0%～6.5%，經(jīng)檢測CP的分離率為57.9%；還有研究者對重慶地區(qū)80份山羊體表型淋巴結(jié)炎病原菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)偽結(jié)核棒狀桿菌與金黃色葡萄球菌和化膿隱秘桿菌混合感染檢出率分別為12.5%和3.75%[13]。李晨露等[14]對陜西省部分地區(qū)奶山羊養(yǎng)殖場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，經(jīng)抗體水平檢測發(fā)現(xiàn)，羊偽結(jié)核棒狀桿菌抗體陽性率為16%～34%。這表明該病在我國各地均有報道，其發(fā)病率明顯升高且存在混合感染情況。因為該病對養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展造成的巨大損失和危害，被我國列為三類動物疫病，其防控形勢依然嚴(yán)峻[15]。

3 山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診斷方法

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 病原菌的分離培養(yǎng)鑒定 首先，選取膿腫完整的患羊，經(jīng)局部剪毛消毒后切開膿腫，無菌采集膿汁病料。其次，使用滅菌生理鹽水稀釋膿汁，經(jīng)涂片革蘭氏染色后鏡檢?？煽吹酱罅堪魻罨蚯驐U狀細(xì)菌，革蘭氏染色為陽性，無芽孢、鞭毛及莢膜，呈散在排列。最后，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，將膿汁分別接種在普通瓊脂平板、100 mL/L犢牛血清瓊脂平板和麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，血清瓊脂平板上菌落呈白色半透明狀凸起，周圍有狹窄的β-溶血環(huán)，而在普通瓊脂平板上生長較差，在麥康凱平板上不生長。挑取單菌落接種在普通肉湯和100 mL/L犢牛血清肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，可看到輕度渾濁，尤其是血清肉湯培養(yǎng)基，還會有菌膜生成[12]。

3.1.2 病原菌的生化特性鑒定 取指數(shù)生長期的細(xì)菌接種于各生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h后發(fā)現(xiàn)，該菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和果糖，不能發(fā)酵山梨醇、甘露醇和肌醇；能分解尿素，不能分解硝酸鹽，不產(chǎn)生硫化氫，不液化明膠；接觸酶試驗陽性，MR、VP試驗均呈陰性[16-17]。

3.1.3 病原菌的特征性鑒定 由于CP與馬紅球菌共同培養(yǎng)時，可使β-溶血環(huán)增大，促進(jìn)紅細(xì)胞溶解作用。同時CP還對葡萄球菌β-溶解酶產(chǎn)生的溶血具有抑制作用[18]。由于潰瘍棒狀桿菌也分泌磷脂酶D(phospholipase D,PLD)，因此在使用協(xié)同溶血試驗和溶血抑制試驗后，還需結(jié)合其他方法對二者進(jìn)行鑒定。

3.2 血清學(xué)診斷

相較于病原分離鑒定的診斷方法，研究人員更傾向于選擇血清學(xué)診斷方法。該方法利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對CLA進(jìn)行診斷，具有快速、準(zhǔn)確、簡便且不易造成污染等優(yōu)點(diǎn)，在群體流行病學(xué)調(diào)查和亞臨床感染病例的篩選等方面具有巨大優(yōu)勢。常見的血清學(xué)診斷方法包括：體內(nèi)試驗、菌體凝集抑制試驗、間接血凝試驗、雙重免疫擴(kuò)散試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗和和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，其中ELISA方法具有良好的應(yīng)用前景并被廣泛應(yīng)用。

體內(nèi)試驗是通過給實驗動物注射疑似陽性血清，觀察其能否降低死亡率，即可對抗毒素進(jìn)行檢測。Seyffert N等[19]使用CP的培養(yǎng)上清液作為包被抗原，建立的間接ELISA對220份血清樣品進(jìn)行檢測，其敏感性和特異性分別為93.5%和98.5%。魏宇辰[20]使用純化的PLD融合蛋白作為包被抗原，建立的間接ELISA陽性血清稀釋比值高，與羊口瘡、羊乳房炎和羊溶血曼氏桿菌病無交叉反應(yīng)，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)較低，具有靈敏、特異和重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，可用于羊群中偽結(jié)核棒狀桿菌的檢測。Farias A P等[21]選擇rSodC融合蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA，其靈敏度和特異性分別為96%和94%，可用于羊群的流行病學(xué)調(diào)查。Miriam F R等建立的ELISA測定山羊和綿羊白細(xì)胞中IFN-γ的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染CP患羊體內(nèi)的IFN-γ水平較高，IFN-γ可作為檢測患羊的潛在標(biāo)志物[22]。

3.3 分子生物學(xué)診斷

羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的分子生物學(xué)診斷，根據(jù)該菌的全基因組序列，篩選特異性基因并設(shè)計引物，采用常規(guī)PCR即可進(jìn)行診斷[23]。馬玉馨等[24]建立了熒光定量PCR，其檢測敏感度為常規(guī)PCR的1 000倍。如果患羊為內(nèi)臟型病變，需對動物進(jìn)行解剖。還可根據(jù)原核生物的16S rRNA設(shè)計通用引物，PCR擴(kuò)增后結(jié)合高通量測序進(jìn)行序列比對，進(jìn)一步診斷病原菌[25]。由于偽結(jié)核棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和化膿隱秘桿菌均能引起山羊皮下膿腫，楊發(fā)龍等[26]建立的多重PCR可同時檢測這3種病原菌，該方法特異性強(qiáng)，檢測下限分別為8.7×102CFU/mL、1.1×102CFU/mL和5.1×102CFU/mL，為臨床快速診斷提供技術(shù)支撐。許國洋等[27]利用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)可選擇性穿透死菌細(xì)胞膜的特性，建立了偽結(jié)核棒狀桿菌PMA-PCR檢測法，該方法的特異性和靈敏性較高，能防止死菌DNA擴(kuò)增的干擾，從而對活菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

4 山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的防控技術(shù)

4.1 疫苗預(yù)防

4.1.1 滅活疫苗 滅活疫苗的免疫效果主要取決于滅活方式和佐劑種類。有研究為了探究二者對疫苗免疫效果的影響，通過檢測小鼠體內(nèi)抗體，發(fā)現(xiàn)使用甲醛滅活、不完全弗氏佐劑的疫苗免疫效果最佳[28]。Fontaine M C等[29]使用經(jīng)福爾馬林滅活的CP和氫氧化鋁佐劑對羊進(jìn)行免疫接種，結(jié)果表明該疫苗對機(jī)體提供了良好的免疫保護(hù)作用，阻止了感染在接種部位以外的傳播。

4.1.2 弱毒活疫苗 由于CP是一種胞內(nèi)寄生菌，滅活疫苗僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫且維持時間短，成本高需多次注射，弱毒活疫苗的研究有望解決這一問題。弱毒活疫苗能持續(xù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，但其安全性較滅活疫苗低，具有不穩(wěn)定易失活、存在毒力返祖的風(fēng)險。目前，主要通過篩選弱毒株或人工致弱的方法來獲得，其中人工致弱方法包括：改變物理化學(xué)因素、非易感動物的體內(nèi)連續(xù)傳代和基因編輯技術(shù)等。由于鐵的攝取被認(rèn)為是胞內(nèi)細(xì)菌感染過程中的毒力因素之一，有研究通過隨機(jī)誘變鑒定了21種不同的CP突變株，并使用鐵缺乏突變株CZ171053對小鼠進(jìn)行免疫接種試驗，強(qiáng)毒株攻擊后發(fā)現(xiàn)，免疫動物的存活率達(dá)到80%，同時該突變株可有效抑制細(xì)菌的胞內(nèi)生長[30]。Simmons C P等[31]研究發(fā)現(xiàn)，偽結(jié)核棒狀桿菌aroQ突變體制備的疫苗免疫原性降低，僅能減弱臨床癥狀而無法誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌特異性IFN-γ，導(dǎo)致該弱毒活疫苗不能對機(jī)體提供免疫保護(hù)。

4.1.3 類毒素疫苗 偽結(jié)核棒狀桿菌病類毒素疫苗的主要成分是PLD，此抗原成分是將CP的培養(yǎng)上清液經(jīng)過濾和濃縮得到，再用福爾馬林滅活成類毒素。Eggleton D G等[32]使用類毒素疫苗對綿羊進(jìn)行免疫接種，6個月后再通過感染病原菌來評估免疫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病變羊只的數(shù)量顯著減少，疫苗免疫保護(hù)效果良好，感染率明顯降低。有研究對兩種市售的類毒素疫苗的免疫效果進(jìn)行評價，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，接種綿羊體內(nèi)對這兩種疫苗均產(chǎn)生了抗體反應(yīng)，相比于對照組，機(jī)體膿腫數(shù)量顯著減少，此疫苗可有效控制該病的傳播和流行[33]。

4.1.4 重組亞單位疫苗 Silva M T等[34]使用rCP09720和rCP01850蛋白與重組磷脂酶D(rPLD)的亞單位疫苗免疫小鼠，經(jīng)病原菌株攻擊后，兩個試驗組的總IgG和IFN-γ水平顯著增加，且僅在后者中TNF水平顯著增加；小鼠的存活率分別為40%和50%，而單獨(dú)使用rPLD的小鼠存活率為30%，表明rPLD與rCP09720和rCP01850聯(lián)用對抗感染免疫具有協(xié)同作用，尤其后者的保護(hù)作用更強(qiáng)，可誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。還有研究將CP的rNanH和rPknG兩個假定毒力因子作為重組亞單位疫苗，通過對小鼠兩次免疫接種發(fā)現(xiàn)，免疫組的抗體水平較高，IL-17、TNF和IFN-γ的表達(dá)水平升高，存活率分別為60%和20%，表明前者可引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，可被作為該病原菌的有效疫苗[35]。

4.2 手術(shù)治療

患部剪毛消毒，當(dāng)膿腫較小時，切開膿腫將膿汁排出，用消毒液反復(fù)沖洗(如新潔爾滅、30 mL/L雙氧水和1 mg/mL高錳酸鉀等)，再涂抹碘酒消毒，并使用紅霉素軟膏、環(huán)丙沙星和慶大霉素等高敏藥物涂抹傷口，每天1次，直至愈合；當(dāng)膿腫較大時，應(yīng)仔細(xì)剝離膿腫包膜，還要注意是否形成瘺管。在外科處理過程中，要注意環(huán)境的消毒和化膿廢棄物的無害化處理，不能隨意丟棄，防止病原菌擴(kuò)散，同時還應(yīng)做好個人安全防護(hù)[8]。

4.3 病原凈化

目前，山羊集約化養(yǎng)殖過程中疫病防控尤為重要，由于手術(shù)治療效果不佳、效率低且易污染環(huán)境。疫苗預(yù)防接種將有效提高山羊免疫保護(hù)力，防止羊群大規(guī)模傳染、發(fā)病。CP的凈化主要從以下兩個方面入手：一是羊群凈化，分別使用病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等檢測方法，評估目標(biāo)羊群CP的感染情況。結(jié)合檢測結(jié)果分析山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病在鄰近地區(qū)的整體流行情況，并制定科學(xué)合理的凈化程序：疫苗免疫接種病原陰性的羊群、隔離檢測新引入的羊群、隔離治療病原陽性的羊群、及時淘汰臨床癥狀嚴(yán)重的患羊、定期對羊群進(jìn)行抗體水平檢測等。當(dāng)羊群中該病檢測結(jié)果均為陰性時，則基本可以達(dá)到疫病的凈化。二是養(yǎng)殖環(huán)境凈化，定期對羊場飼養(yǎng)器具及圈舍內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行全面消毒與殺菌，并做好個人防護(hù)，及時清理污糞并發(fā)酵處理，切斷傳染源和傳播途徑，避免羊群進(jìn)一步接觸病原菌，維持健康的養(yǎng)殖環(huán)境，達(dá)到對環(huán)境中病原凈化的目的。

5 發(fā)展趨勢

由于山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病是一種接觸性的人畜共患傳染病，因此還需在山羊胴體上市前加強(qiáng)對該病原菌的監(jiān)測，以防止流入市場。由于藥物治療效果不佳且會產(chǎn)生多重耐藥，因此，該病的治療應(yīng)避免抗生素等藥物的濫用。為開發(fā)高效疫苗，不但要將抗原和不同佐劑組合以獲得更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且應(yīng)盡可能使用小反芻動物模型以提供更加可靠的結(jié)果。該病的診斷和防控技術(shù)正向著高效、靈敏、快速、便捷和低成本的方向發(fā)展。同時，還將會應(yīng)用到更多的新興技術(shù)、尋找特異性位點(diǎn)等，從而得到準(zhǔn)確的結(jié)果并保護(hù)動物免受感染，推動山羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。