高效液相色譜法對小麥粉及其制品中硫脲的測定

王 邱，何海彤，李錦清，周銘林，劉德群

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528322）

硫脲（thiourea）是一種含硫化合物，白色而有光澤的晶體，又稱為硫代尿素，因其還原性、抗氧化和漂白作用，廣泛用于紡織業(yè)，也可用作獸藥的生產(chǎn)原料。還曾一度作為防腐劑，應(yīng)用于各類需要保鮮、防腐以及漂白的食品中[1-2]。有研究表明，硫脲雖然一次作用時毒性小，反復(fù)作用可抑制甲狀腺和造血器官的機能，進而引起變態(tài)反應(yīng)，長期接觸可能出現(xiàn)頭痛、無力、嗜睡、血壓下降、基礎(chǔ)代謝降低、白細胞減少等癥狀[3]，因此我國不允許其作為食品添加劑作用于食品中。有關(guān)部門在日常監(jiān)督抽檢或風(fēng)險監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)有部分生產(chǎn)廠家向小麥粉及其制品中添加硫脲，以達到漂白、增筋的目的。由于小麥粉及其制品是人民群眾主要的食品及原料，受眾面十分廣泛，因此為保障人民群眾食品安全，迫切需要建立高效、快速檢測小麥粉及其制品中硫脲的方法。

目前，測定硫脲的分析方法主要有分光光度法、離子色譜法、高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-13]。離子色譜法主要用于水樣中硫脲含量的測定，譚炯等[10]運用離子色譜對水樣中硫脲含量進行了研究，先用高錳酸鉀將硫脲中的硫羰基氧化為，再用離子色譜對進行測定得到其濃度，最后根據(jù)生成的與硫脲的關(guān)系來計算出硫脲的含量。小麥粉及其制品相較于水而言基質(zhì)復(fù)雜得多，高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理及上機檢測更加簡便、高效、快捷，因此已經(jīng)成為硫脲的主要檢測手段。何瑞云等[3]運用高效液相色譜法建立了面粉及其制品中硫脲的測定方法，以水為樣品提取液，用Inertsil CX陽離子交換柱進行分離，得到方法檢出限（S/N=3）為2.0 mg/kg。目前暫時還沒有關(guān)于硫脲檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅有國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的補充檢驗方法《總局關(guān)于發(fā)布食品中那非類物質(zhì)的測定和小麥粉中硫脲的測定2項檢驗方法的公告（2016年第196號）》[14]—小麥粉中硫脲的測定BJS 201602，此方法僅適用于小麥粉中硫脲的測定，并不確定是否適用于小麥粉制品，且色譜柱的使用也比較局限（HILIC親水柱）。

本實驗對小麥粉及其制品中硫脲的測定條件進行了研究，對樣品前處理條件和上機條件均進行了優(yōu)化，重點研究了前處理各方面的選擇，旨在建立一種更高效、便捷、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-30AD超高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）：日本島津公司；JJ500Y型百分位電子天平：富陽騰輝電子科技有限公司；ME204/02型萬分位電子天平：瑞士梅特勒托利多公司；JP-C400型超聲波清洗器：廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司；centrifuge 5804R型高速冷凍離心機：廣東省中科進出口有限公司。

硫脲標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；磷酸二氫銨（分析純）：阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；磷酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；實驗用水為超純水。

0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液（pH=3.0）：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫銨2.4 g于1 000 mL流動相瓶中，加入900 mL超純水，超聲溶解，靜置后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0（大約1 mL磷酸），再加超純水至1 000 mL刻度，混勻后過0.45 μm濾膜備用。

小麥粉及掛面樣品，購買于本市批發(fā)市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取硫脲標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/mL的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別移取 0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于 50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將純水（0 μg/mL，排除試劑干擾）和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度由稀至濃依次進樣，可獲得空白溶液圖譜、標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜以及校正曲線。

1.2.2 樣品前處理

先將掛面樣品用粉碎機粉碎，全部通過 40目篩，備用。準(zhǔn)確稱取小麥粉樣品和掛面樣品約2 g于50 mL容量瓶中，加入超純水20 mL混勻，在25 ℃下超聲15 min，定容，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，上清液過濾膜上機待測。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：A：甲醇，B：0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液，A+B=2+98，等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長為236 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇

根據(jù)參考文獻[1]可知硫脲的提取溶液一般為水、甲醇、乙腈和乙醇，本實驗對這幾種試劑的提取效果進行了比較。選取小麥粉和掛面樣品各一個，每個樣品稱取同質(zhì)量的4份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別以水、甲醇、乙腈和乙醇作為提取溶劑，再按照 2.2.2所述前處理方法進行操作，最后上機測定。根據(jù)加標(biāo)樣品的硫脲峰面積大小來對比提取效果。實驗結(jié)果（見圖1）顯示對小麥粉和掛面提取效果最佳的均為水，其次為乙腈、甲醇，乙醇效果相對最弱。因此選擇水為提取溶劑，同時可將水定為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品溶解和稀釋的溶劑。硫脲的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)二極管陣列檢測器在190～800 nm進行全波段掃描后，發(fā)現(xiàn)硫脲在236 nm處有最大吸收（見圖2，硫脲在水中的最大吸收波長為 236 nm、乙腈為238 nm、甲醇為240 nm、乙醇為246 nm），因此選定236 nm為硫脲液相色譜法的檢測波長。

圖1 不同提取溶劑的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.1 Histogram of peak area of labeled sampleswith different extraction solvents

圖2 硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜圖Fig.2 Thiourea ultraviolet absorption spectra of the standard solution

2.1.2 超聲提取溫度的選擇

選取一個小麥粉樣品和一個掛面樣品，均稱取等量的5份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以水作為提取溶劑，分別在 20、25、30、35、40 ℃溫度下超聲15 min，按照1.2.2所述進行操作，最后上機待測，根據(jù)各樣品的硫脲峰面積大小來比較提取效果。實驗結(jié)果（見圖3）表明小麥粉樣品與掛面樣品的提取溫度在 25 ℃時峰面積大于在 20 ℃時的峰面積，但 25 ℃之后，隨著提取溫度的升高峰面積變化并不大，在 40 ℃時出現(xiàn)峰面積變小的情況，可能是因為溫度過高造成了硫脲的降解。因此本實驗選擇 25 ℃為超聲提取溫度。

圖3 不同提取溫度的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.3 Histogram of peak area of labeled samples at different extraction temperatures

2.1.3 超聲提取時間的選擇

選取一個小麥粉樣品和一個掛面樣品，均稱取等量的5份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以水作為提取溶劑，在25 ℃下分別超聲提取10、15、20、25、30 min，按照1.2.2所述進行操作，最后上機待測，根據(jù)各樣品的硫脲峰面積大小來比較提取效果。實驗結(jié)果（見圖4）表明小麥粉樣品和掛面樣品超聲時間在 15 min時峰面積明顯大于在 10 min時的峰面積，但在提取時間為15 min之后峰面積變化不大，因此本實驗選擇15 min為樣品的超聲提取時間。

圖4 不同提取時間的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.4 Histogram of peak area of labeled samples at different extraction times

綜上所述，本實驗的前處理方法為：以水為提取溶劑，在25 ℃條件下超聲提取15 min，再以10 000 r/min的速度離心2 min后，上清液過濾膜上機測定。

2.2 高效液相色譜儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

根據(jù)參考文獻[3]可知硫脲的流動相一般為甲醇-水、乙腈-水體系，對這兩種流動相體系進行了考察（見圖5-a、圖5-b），由于硫脲的極性偏大，即使甲醇或乙腈的比例較低，在反相色譜柱上的保留均不理想，出峰較快，且峰形較差，因此考慮使用流動相添加劑。本次實驗比較了在水相中加乙酸-乙酸銨緩沖鹽/甲醇和磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽/甲醇對硫脲色譜峰的影響（見圖5-c、圖5-d），發(fā)現(xiàn)在水相中添加0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）時峰形最佳，最終確定流動相體系為0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨+甲醇=98+2，在流速為0.5 mL/min時仍有較好的峰形，實驗采用等度洗脫，有助于穩(wěn)定出峰時間，大批量樣品進樣時，每相隔十針左右需設(shè)置甲醇水的梯度沖柱程序，以便及時沖洗色譜柱，避免柱頭污染，造成對目標(biāo)峰的干擾，同時還能延長色譜柱的使用壽命。

圖5 不同流動相的硫脲的色譜圖Fig.5 Chromatograms of thiourea in different mobile phases

2.2.2 色譜柱的選擇

當(dāng)實驗選擇甲醇-水或乙腈-水作為流動相體系時，即使是柱長為250 mm的C18柱，硫脲的保留均不理想，出峰較快，峰形較差，或與溶劑峰疊加。按照BJS 201602方法中所述，將色譜柱更換為HILIC柱，但必須將樣品的提取溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶劑更換為乙醇，才能在流動相為乙腈+水=90+10時，獲得較為滿意的保留時間和峰形，但如 2.1.1中所述，乙醇的提取效果是四種提取溶劑中相對最弱的，可能會造成痕量硫脲不易檢出的情況。當(dāng)選擇磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽+甲醇流動相體系時，即使是普通的 C18柱，也能獲得較好的峰形，本次實驗選擇了 Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 150×4.6 mm）柱、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4 μm 150×4.6 mm）柱和Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）柱三種色譜柱來測試硫脲的峰形（結(jié)果見圖6），Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）柱具有更長的保留時間，有利于將硫脲與雜質(zhì)峰分開，因此本次實驗最終選擇的色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）色譜柱。

圖6 不同色譜柱的硫脲色譜峰Fig.6 The chromatographic peaks of thiourea on different chromatographic columns

2.2.3 色譜柱柱溫的選擇

在同一流動相體系和色譜柱條件下，對比了硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）在 25、30和 40 ℃下對目標(biāo)峰的保留時間和峰形的影響。實驗結(jié)果表明色譜峰的保留時間和峰形在不同柱溫下基本沒有變化，因此本次選擇25 ℃為色譜柱柱溫（見表1）。

表1 硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同柱溫時的峰面積Table 1 Peak areas of thiourea standard solution at different column temperatures

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 校準(zhǔn)曲線的繪制

本實驗選取的線性范圍為0～20 μg/mL。分別移取0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為 0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將純水（0 μg/mL）和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度由稀至濃依次進樣，以硫脲的濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）?；貧w方程為Y=177 636X–616.712(r=0.999 99)，表明硫脲在0～20.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.3.2 檢出限和定量限

將硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級稀釋，高效液相色譜測定，3倍信噪比時（S/N=3）硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.02 μg/mL，對應(yīng)的樣品含量為0.5 mg/kg，10倍信噪比時（S/N=10）硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.06 μg/mL，對應(yīng)的樣品含量為1.5 mg/kg。因此，當(dāng)稱樣量為2.0 g，定容體積為50 mL時，本方法檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.5 mg/kg。

2.3.3 加標(biāo)回收率

對于食品中的禁用物質(zhì)，加標(biāo)回收實驗應(yīng)在方法檢出限、2倍方法檢出限、10方法檢出限進行3水平測試。將小麥粉樣品和掛面樣品先按照1.2.2處理后上機選出硫脲含量為未檢出的陰性樣品作為空白基質(zhì)樣品，稱取小麥粉陰性樣品和掛面陰性樣品各9份，分別加入50、100、500 μL濃度為 20.0 μg/mL（即0.5、1.0、5.0 mg/kg三個水平）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平加標(biāo)3次，前處理后上機測定，加標(biāo)回收率實驗結(jié)果見表2。

實驗結(jié)果表明小麥粉和掛面樣品的硫脲加標(biāo)回收率均符合 GB/T 24704—2008實驗《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄 F中回收率的要求，證明該方法準(zhǔn)確、可靠。2.3.4 方法精密度

表2 硫脲加標(biāo)回收率實驗結(jié)果Table 2 Thiourea standard addition recovery rate test results

對于食品中的禁用物質(zhì)，精密度實驗應(yīng)在方法檢出限、2倍方法檢出限、10方法檢出限進行3水平測試，每個水平做6次平行實驗，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。硫脲精密度實驗測定結(jié)果見表3。

表3 硫脲精密度實驗測定結(jié)果Table 3 Results of precision test of thiourea

精密度實驗結(jié)果符合 GB/T 27404—2008實驗《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F中精密度的要求，證明該方法穩(wěn)定、可靠。

2.4 實際樣品的測定

按照建立的方法對購買于本地批發(fā)市場的20份小麥粉樣品和10份掛面樣品進行處理和測定，發(fā)現(xiàn)所有樣品中硫脲的含量均低于檢出限，即未檢出。對其中一份小麥粉樣品和一份掛面樣品進行加標(biāo)回收實驗，添加水平均為1.0 mg/kg，加標(biāo)回收率結(jié)果分別為 93.1%和 94.8%。硫脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、小麥粉樣品色譜圖以及小麥粉加標(biāo)樣品色譜圖見圖7（掛面樣品以及掛面加標(biāo)樣品的色譜圖與小麥粉基本一致）。

圖7 硫脲標(biāo)準(zhǔn)品、小麥粉樣品、小麥粉加標(biāo)樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of thiourea standard, wheat flour sample and wheat flour standard sample

3 結(jié)論

本方法通過比較四種溶劑（水、乙腈、甲醇和乙醇）對硫脲的提取效果，選擇水為小麥粉及其制品的提取溶劑，最大吸收波長為236 nm。通過比較各流動相體系對硫脲的保留時間以及峰形的影響，選擇0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨緩沖液+甲醇=98+2為流動相，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱。該方法具有更低的檢出限和定量限，分別為0.5 mg/kg和1.5 mg/kg。對本實驗進行的方法學(xué)考察表明硫脲在0～20.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99，該方法的加標(biāo)回收實驗和精密度實驗結(jié)果均符合 GB/T 27404—2008附錄F的要求，證明該方法能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠地檢測小麥粉及其制品中的硫脲成分。

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