基于形態(tài)特征和多基因序列鑒定儲(chǔ)藏稻谷的優(yōu)勢(shì)真菌

祁智慧，張海洋，田 琳，莊 媛，李 冰，唐 芳?

（1. 國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院 糧食儲(chǔ)運(yùn)研究所，北京 100037；2. 糧食儲(chǔ)運(yùn)國家工程研究中心，北京 102209；3. 北京農(nóng)學(xué)院 生物資源與環(huán)境學(xué)院，北京 102206）

國家統(tǒng)計(jì)局關(guān)于 2020年糧食產(chǎn)量的公告數(shù)據(jù)顯示，稻谷產(chǎn)量約占我國糧食總產(chǎn)量的三分之一，是主要糧食作物，也是重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備糧種。相較于小麥和玉米而言，稻谷具有不耐儲(chǔ)藏的性質(zhì)，一般在糧庫儲(chǔ)備輪換年限為3年[1]。在收購、儲(chǔ)藏和加工過程中，外界環(huán)境中的微生物會(huì)對(duì)稻谷的品質(zhì)帶來一定影響[2]。尤其是在糧庫儲(chǔ)藏時(shí)糧倉內(nèi)的糧堆是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，倉內(nèi)外環(huán)境溫濕度的變化，會(huì)導(dǎo)致水分遷移而使糧堆局部出現(xiàn)結(jié)露的情況，從而為真菌的萌發(fā)生長創(chuàng)造有利條件，可能導(dǎo)致儲(chǔ)糧風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

早在2001年，Reddy等[5]總結(jié)了水稻中報(bào)道過的143種不同的真菌，結(jié)果表明無論是在田間還是在儲(chǔ)藏期，稻谷上都存在大量真菌。儲(chǔ)藏期間稻谷的優(yōu)勢(shì)真菌主要為曲霉屬Aspergillus物種[6]。包括黃曲霉A. flavus、黑曲霉A. niger、亮白曲霉A. candidus等[7]。曲霉屬Aspergillus內(nèi)不同真菌物種之間，生長條件及產(chǎn)毒特性差異較大，對(duì)稻谷的危害程度不同[8]，準(zhǔn)確鑒定主要優(yōu)勢(shì)真菌物種，對(duì)于糧食霉變及真菌毒素污染精準(zhǔn)防控具有重要意義。

早期糧食上真菌的鑒定多以形態(tài)特征鑒定為主，部分種屬的鑒定結(jié)果可能存在不準(zhǔn)確[9]。隨著分子生物學(xué)的建立與發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段被逐漸引入糧食真菌的基因序列分析，可將分離到的真菌鑒定到屬和種水平[7,10]。目前主要采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS區(qū)）作為通用條形碼對(duì)儲(chǔ)藏真菌進(jìn)行初步鑒定，可將分離株鑒定至屬或?qū)賰?nèi)復(fù)合群水平。但I(xiàn)TS序列在 Genbank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析獲得的菌種鑒定信息具有一定的局限性[11-12]，尤其是曲霉屬Aspergillus（糧食儲(chǔ)藏真菌優(yōu)勢(shì)屬），ITS序列分析過于保守，不能將所有的物種準(zhǔn)確鑒定到單一種[12]，因此，需聚合酶Ⅱ第二大亞基基因（RNA polymerase II, RPB2）、β-微管蛋白基因（β-tubulin,TUB）或鈣調(diào)蛋白基因（Calmodulin, CAM）等多個(gè)蛋白編碼基因?qū)?fù)合群內(nèi)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確種水平鑒定[13]。本文選擇將形態(tài)學(xué)觀察與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合，對(duì)我國13省糧庫儲(chǔ)藏期間稻谷上優(yōu)勢(shì)真菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為糧食上危害真菌的識(shí)別和鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究稻谷樣品分別來源于黑龍江、吉林、遼寧、寧夏、北京、安徽、湖北、湖南、江西、四川、重慶、福建、廣西13個(gè)省儲(chǔ)存1年的糧倉（高大平房倉）。每倉采樣方法為5點(diǎn)3層法，共計(jì)15個(gè)樣品，5個(gè)取樣點(diǎn)平面位置定為糧倉的東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點(diǎn)，3層的縱向位置分別為：上層（距離糧堆表層0.5 m左右）、中層（糧堆正中間，通常距糧堆表層2.5～3 m左右，根據(jù)糧倉內(nèi)糧堆高度而定）和下層（距離糧倉地面0.5 m左右），取樣后，將樣品放置于無菌采樣袋中，于4 ℃條件下保存，實(shí)驗(yàn)前將上層、中層、下層樣品分別進(jìn)行混合。

1.2 主要試劑和儀器

高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基（Salt Czapek Dox Agar，SCA）、察氏瓊脂培養(yǎng)基（Capek agar, CA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar，MEA）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：寶泰克生物科技公司；2×PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；科研級(jí)生物顯微鏡（Axio scopeA1）：德國zeiss公司；PCR儀（Tgradient）：Biometra公司；凝膠成像分析儀（Gel-Doc2000）：Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 稻谷上真菌的分離計(jì)數(shù)和純化

儲(chǔ)藏稻谷真菌的分離主要采用稀釋平板法（SCA培養(yǎng)基）。稱取 25 g稻谷樣品至裝有225 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩30 min，充分洗滌后，制備10倍梯度的真菌孢子稀釋液，選擇2個(gè)適宜的稀釋梯度進(jìn)行接種，每份樣品三個(gè)平行。接種后及時(shí)將15～30 mL冷卻至50 ℃左右加了氯霉素的 SCA培養(yǎng)基倒入已加稀釋液的無菌培養(yǎng)皿中。待瓊脂凝固后，置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～8 d。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)真菌菌落數(shù)。計(jì)數(shù)后挑取單菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接3～4次，純化獲得單一菌株。

1.3.2 真菌形態(tài)特征鑒定

菌落表觀形態(tài)觀察，選擇MEA培養(yǎng)基、CA培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基用于菌株培養(yǎng)，在25 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d進(jìn)行觀察。微觀形態(tài)特征觀察使用科研級(jí)生物顯微鏡。詳細(xì)方法參考Chen等的實(shí)驗(yàn)方法[14]。

1.3.3 真菌分子生物學(xué)鑒定

使用改良的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA。用于ITS區(qū)及TUB基因序列的擴(kuò)增和測序。菌落數(shù)較多的分離株及與其形態(tài)近似的菌株擴(kuò)增 CAM基因和 RPB2基因并測序。ITS區(qū)的引物選擇ITS4和ITS1；TUB基因擴(kuò)增選擇引物bT2a和bT2b；RPB2基因擴(kuò)增選擇引物RPB2-5F和RPB2-7R；CAM基因擴(kuò)增選擇引物CMD5和CMD6。PCR反應(yīng)體系為25 μL：引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，2×PCR Master Mix為12.5 μL，ddH2O為9 μL。反應(yīng)條件參考Chen等的研究方法[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用 EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ITS、TUB、CAM 以及 RPB2單基因的序列先分別用軟件 MEGA 7進(jìn)行聚類，并兩端切齊。切齊后的單基因序列用軟件 Mesquite v 3.1串聯(lián)為多基因序列組合。采用RAXML軟件構(gòu)建最大似然法（Maximum likelihood）系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以自展（Bootstrap）進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)藏稻谷真菌分離及初步鑒定

本研究對(duì)13個(gè)省儲(chǔ)藏1年的稻谷進(jìn)行了真菌分離培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)，共獲得真菌 397 株。首先采用 ITS 片段對(duì)所獲得的真菌分離株進(jìn)行初步鑒定（通過BLASTn在NCBI數(shù)據(jù)庫上對(duì)其進(jìn)行注釋），將分離株初步鑒定至屬水平或?qū)賰?nèi)復(fù)合群水平。后續(xù)補(bǔ)充了 TUB基因序列，通過 ITS和TUB基因序列的比對(duì)分析結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，將獲得的菌株初步鑒定至種水平。397個(gè)菌株分別屬于2門4綱5目7科9屬49種（圖1）。

圖1 我國糧倉儲(chǔ)藏稻谷不同糧層真菌群落組成Fig. 1 The fungal community composition of stored rice grains from different grain layers in warehouses of China

2.2 儲(chǔ)藏稻谷可培養(yǎng)真菌群落結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)分離株初步鑒定結(jié)果分析不同真菌物種在樣品中的分布情況如圖1所示，曲霉屬Aspergillus豐度最高，為22種，青霉屬Penicillium次之，為 10種。曲霉屬Aspergillus和青霉屬Penicillium數(shù)量共占物種總數(shù)的65%，且曲霉屬Aspergillus的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其它屬。表明稻谷儲(chǔ)藏期間的真菌主要為曲霉屬Aspergillus。本研究中，將所有樣品中相對(duì)豐度大于 40%且出現(xiàn) 3次以上的真菌物種定為優(yōu)勢(shì)種，其中多育曲霉A.proliferans、蒙地曲霉A. montevidensis、黃曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger是我國儲(chǔ)藏稻谷的優(yōu)勢(shì)菌。南北方地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌明顯不同，北方以耐旱真菌多育曲霉A. proliferans和蒙地曲霉A.montevidensis為主，主要分布在糧堆上層。南方以蒙地曲霉A. montevidensis、黃曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger為主，主要分布在糧堆各層。菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與編號(hào)S49、S46、S36及S17分離株近似的菌落數(shù)量最多。其中S49、S50、N6、N12、P54分離株疑似為蒙地曲霉A.montevidensis；S46、S47、S52分離株疑似為多育曲霉A. proliferans；P1、P2、P3、S36分離株疑似為黑曲霉A. niger；S17、B63、B64、B65、B66、B67、B68、B70、F22分離株疑似為黃曲霉A. flavus。

2.3 儲(chǔ)藏稻谷上優(yōu)勢(shì)真菌形態(tài)鑒定

如圖2所示，分離株S49、S50、N6、N12、P54初步鑒定為蒙地曲霉A. montevidensis，在SCA培養(yǎng)基上菌落生長較為迅速，正面為橄欖綠色，呈顆粒狀，反面為墨綠色，在 MEA培養(yǎng)基上菌落生長緩慢，中央呈淡黃色，邊緣為深綠色，反面為淡黃色。閉囊殼通常為黃色球形或近球形，直徑為75～220 μm。分生孢子頭為輻射狀或疏松柱狀，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗為（5～12）×（2.5～3.5）μm，分生孢子球形、卵形或洋梨形，大小約為（4～6.5）×（3～5）μm，較大，表面粗糙，具小刺。分離株 46、S47、S52初步鑒定為多育曲霉A.proliferans，在 SCA培養(yǎng)基上菌落質(zhì)地為絮狀，較厚，正反面顏色均為橄欖黃色，在 MEA培養(yǎng)基上不生長，在20%蔗糖CA培養(yǎng)基生長較為局限，形成較小的灰白色菌落，閉囊殼球形或近球形。孢梗莖壁光滑，分生孢子頭直徑達(dá) 70～150μm，為輻射狀。頂囊為近球形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗（9～14）×（3.5～5）μm。分生孢子呈球形或近球形，大小約為（6～10）×（4～7）μm，壁粗糙，具小刺。分離株 S17、B63、B64、B65、B66、B67、B68、B70和F22初步鑒定為黃曲霉A. flavus，在CA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落顏色為黃綠色或草綠色，反面為無色至淡褐色。在 MEA培養(yǎng)基上菌落質(zhì)地絲絨狀至絮狀，較厚，黃綠色，菌落反面無色。孢梗莖壁厚，無色，粗糙具小刺。頂囊為近球形至燒瓶形，直徑為9～65 μm。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)通常為雙層，?；?.0～19）×（3～6）μm，瓶梗（6～12）×（2.5～4）μm。分生孢子多為球形或近球形，直徑2.5～6.5 μm，壁粗糙具小刺。菌核初期白色，老后呈褐黑色，球形或近球形。P1、P2、P3、S36初步鑒定為黑曲霉A. niger，在CA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落表面呈暗褐黑色至炭黑色，菌落平坦或中心稍凸起，質(zhì)地為致密絲絨狀，菌落反面無色至淡黃色。有的菌株會(huì)產(chǎn)生菌核。在 MEA培養(yǎng)基上，菌落呈褐黑色至炭黑色，有規(guī)則或不規(guī)則的輻射狀溝紋，質(zhì)地絲絨狀，比在 CA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌絲更多，菌落反面為無色至淡黃色。孢梗莖壁光滑。分生孢子頭初期為球形，老后分裂成幾個(gè)圓柱狀結(jié)構(gòu)。頂囊球形或近球形，直徑為30～80 μm。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，瓶梗為（7～ 12）×（2～3）μm，?；鶠椋?0～70）×（3～14）μm，分生孢子球形或近球形，直徑3～5.5 μm，壁粗糙有小刺，偶有近于光滑的孢子。

圖2 優(yōu)勢(shì)真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphological structure of dominant fungal species

2.4 儲(chǔ)藏稻谷上優(yōu)勢(shì)真菌分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)過ITS比對(duì)分析和形態(tài)特征鑒定，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏稻谷上的優(yōu)勢(shì)菌主要屬于3個(gè)類群，第一類屬于曲霉屬Aspergillus中耐旱真菌類群（早期屬于Eurotium散囊菌屬），具有嗜高滲透壓的特性（耐旱性）；第二類屬于黃色組AspergillussectionFlavi；第三類屬于黑色組AspergillussectionNigri。對(duì)同一組內(nèi)的真菌物種而言，ITS序列在鑒定過程中高度保守，與其物種的形態(tài)特征相近，區(qū)分困難，容易混淆。因此，選擇真菌的 ITS、TUB、CAM和RPB2基因進(jìn)行測序，結(jié)合同類群內(nèi)近似物種的模式菌株和國際權(quán)威菌株序列進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，最終確定真菌的鑒定結(jié)果。

2.4.1 儲(chǔ)藏稻谷中耐旱真菌類群的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于四個(gè)基因片段的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析方法，推測曲霉屬Aspergillus中耐旱真菌物種之間的關(guān)系（圖3）。最終得到的比對(duì)數(shù)據(jù)集包含 21個(gè)分離菌株和28個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株（附表1），包括2 283個(gè)堿基（ITS為500，TUB為411，CAM為429和RPB2為943，包括比對(duì)間隙），菌株P(guān)enicillium chrysogenumCBS 30648 作為外群。結(jié)果表明，分離株 N13、N21、N24、P47、P48、P51、P52、P55、P56和S55所測序列與謝瓦曲霉A. chevalieri標(biāo)準(zhǔn)序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)分支上；S49、S50、N6、N12、P54所測序列與蒙地曲霉A.montevidensis標(biāo)準(zhǔn)序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)分支上；S46、S47、S52所測序列與多育曲霉A.proliferans標(biāo)準(zhǔn)序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)分支上。最終確定儲(chǔ)藏稻谷中屬于耐旱真菌的優(yōu)勢(shì)種為蒙地曲霉A. montevidensis、謝瓦曲霉A. chevalieri和多育曲霉A. proliferans。本研究相關(guān)分離株的基因序列已經(jīng)提交至 NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)見附表1。

圖3 基于多基因序列（ITS、TUB、CAM、RPB2）構(gòu)建的曲霉屬中的部分曲霉（耐旱真菌）物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Aspergillus section Aspergillus (Xerophilic fungi) inferred from combined ITS, TUB, CAM and RPB2

附表1 本實(shí)驗(yàn)分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)分離株在GenBank登錄號(hào)Attached table 1 Standard isolates used in this study and their GenBank accession numbers

續(xù)附表1

2.4.2 儲(chǔ)藏稻谷上黃曲霉復(fù)合群內(nèi)物種的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于四個(gè)基因片段的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析方法，推測稻谷上黃曲霉復(fù)合群AspergillussectionFlavi內(nèi)物種之間的關(guān)系（圖4）。最終得到的比對(duì)數(shù)據(jù)集包含9個(gè)分離菌株和21個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株（附表2），包括2 429個(gè)堿基（ITS為542，TUB為509，CAM為460和RPB2為918，包括比對(duì)間隙），菌株P(guān). chrysogenumCBS 30648作為外群。S17、B63、B64、B65、B66、B67、B68、B70 和 F22所測序列與黃曲霉A. flavus和米曲霉A. oryzae標(biāo)準(zhǔn)序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)分支上（圖4）。表明上述分離株可能為黃曲霉A. flavus或米曲霉A.oryzae。通過這 4個(gè)基因片段的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析無法將黃曲霉A. flavus和米曲霉A. oryzae進(jìn)行區(qū)分。結(jié)合2.1中優(yōu)勢(shì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，可將分離株準(zhǔn)確鑒定為黃曲霉A. flavus。本研究分離株的基因序列已經(jīng)提交至 NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)見附表2。

圖4 基于多基因序列（ITS、TUB、CAM、RPB2）構(gòu)建的黃曲霉復(fù)合群物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Aspergillus section Flavi inferred from combined ITS, TUB, CAM and RPB2

附表2 本實(shí)驗(yàn)分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)分離株在GenBank登錄號(hào)Attached table 2 Standard isolates used in this study and their GenBank accession numbers

續(xù)附表2

2.4.3 儲(chǔ)藏稻谷上黑曲霉復(fù)合群內(nèi)物種的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于四個(gè)基因片段的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析方法，推測稻谷上黑曲霉復(fù)合群AspergillussectionNigri內(nèi)物種之間的關(guān)系（圖5）。最終得到的比對(duì)數(shù)據(jù)集包含4個(gè)分離菌株和14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株（附表3），包括2 002個(gè)堿基（ITS為448，TUB為414，CAM為450和RPB2為690，包括比對(duì)間隙），菌株P(guān). chrysogenumCBS 30648作為外群。實(shí)驗(yàn)室分離菌株 P1、P2、P3、S36所測序列與黑曲霉A. niger標(biāo)準(zhǔn)序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)分支上。最終確定上述分離株均為黑曲霉A. niger。本研究分離株的基因序列已經(jīng)提交至 NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)見附表3。

圖5 基于多基因序列（ITS、TUB、CAM、RPB2）構(gòu)建的黑曲霉復(fù)合群物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Aspergillus section Nigri inferred from combined ITS, TUB, CAM and RPB2

附表3 本實(shí)驗(yàn)分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)分離株在GenBank登錄號(hào)Attached table 3 Standard isolates used in this study and their GenBank accession numbers

3 討論和結(jié)論

本研究對(duì)我國 13個(gè)省份儲(chǔ)藏期稻谷進(jìn)行了真菌分離、菌落計(jì)數(shù)和鑒定，最終獲得397株菌，其中21個(gè)分離株代表儲(chǔ)藏期稻谷上優(yōu)勢(shì)種，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將21個(gè)分離株準(zhǔn)確鑒定為4個(gè)種，分別為黃曲霉A. flavus、黑曲霉A. niger、蒙地曲霉A. montevidensis和多育曲霉A. proliferans。這與已報(bào)道的儲(chǔ)藏期糧食上常見的優(yōu)勢(shì)真菌種物略有差異[15-16]。其中黃曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger在我國南方儲(chǔ)藏稻谷中普遍存在[7,17]，當(dāng)優(yōu)勢(shì)種為黃曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger時(shí)，黃曲霉毒素和赭曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)可能增加[18]，這兩種真菌是糧食行業(yè)需重點(diǎn)關(guān)注的危害真菌。很多研究中提到A. glaucus灰綠曲霉是儲(chǔ)糧上常見的優(yōu)勢(shì)菌[11]，我們分離的優(yōu)勢(shì)菌蒙地曲霉A. montevidensis原命名為阿姆斯特丹曲霉A. amstelodami，經(jīng)Chen等[14]系統(tǒng)研究后，更名為蒙地曲霉A. montevidensis，屬Raper等（1965）分類系統(tǒng)中灰綠曲霉群A. glaucusgroup中典型代表，經(jīng)真菌命名溯源，與前人研究是一致的。而多育曲霉A. proliferans屬于早期研究中提到的局限曲霉群A. restrictusgroup，也是儲(chǔ)糧上常見真菌物種之一[14]。這些物種具有嗜高滲透壓的特性（耐旱性），能夠在水分活度（aW）低于0.75條件下生長[19]，通常生長緩慢，但若不采取防控措施，長期生長仍會(huì)對(duì)稻谷品質(zhì)造成影響，如導(dǎo)致發(fā)芽率降低，脂肪酸值升高，出現(xiàn)色澤變暗，氣味異常等情況，因此作為糧堆霉變發(fā)熱早期監(jiān)測預(yù)警主要指示菌群[20]。

糧食中真菌種、屬的鑒定，由于技術(shù)條件和研究方法不同，且真菌形態(tài)具有多樣性，使得糧食真菌精準(zhǔn)鑒定方面還存在一些不足，如糧食上耐旱真菌的鑒定結(jié)果和種名一直存在爭議，黃曲霉A. flavus和米曲霉A. oryzae很難準(zhǔn)確區(qū)分，不利于后期研究學(xué)者進(jìn)行深入研究。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察及ITS、TUB、CAM和RPB2多基因系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法，對(duì)儲(chǔ)藏稻谷上曲霉屬Aspergillus的3個(gè)主要優(yōu)勢(shì)類群進(jìn)行了深入研究，并給出了主要優(yōu)勢(shì)種的精準(zhǔn)鑒定方法，可為糧食中基因型或表型相似真菌物種的準(zhǔn)確鑒定提供參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。