不同鐵水平飼養(yǎng)對大菱鲆(Scophthalmus maximus)生長及耐低氧能力影響的研究*

王慶敏 黃智慧 馬愛軍① 孫志賓王新安 劉志峰 徐榮靜

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 山東省海洋漁業(yè)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室 山東青島 266071; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 北京100081; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室 山東青島 266071; 4. 煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司 山東煙臺 264003)

現(xiàn)代集約化魚類養(yǎng)殖過程中易受到環(huán)境應(yīng)激的影響, 常見的應(yīng)激因子有溫度 、溶解氧、鹽度、pH值、氨氮和亞硝酸鹽等(洪磊等, 2004; 郭曉麗, 2021),其中溶解氧是魚類機體存活必不可少的環(huán)境因子之一(洪磊等, 2004; 李根芳等, 2021)。實際養(yǎng)殖水體環(huán)境中溶解氧含量波動大且分布不均, 水環(huán)境中高濃度溶解氧, 可抑制氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)的產(chǎn)生, 同時可減輕它們對養(yǎng)殖動物的毒害作用,增強養(yǎng)殖動物食欲, 提高餌料利用率, 降低養(yǎng)殖動物病害發(fā)生率, 促進生長發(fā)育; 反之, 低氧脅迫通過影響胚胎發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、呼吸、攝食及生長代謝、抗氧化(李黎等, 2005; 吳志昊等, 2011)等生命過程威脅魚類生存。因此, 探究提高魚類耐低氧能力的方法對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義, 有助于提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟價值。近年來, 越來越多的研究揭示了缺氧條件下魚體生理和代謝變化, 但在提高魚類耐低氧能力方面的研究還比較有限。

面對低氧脅迫, 魚類通常通過代償作用機制增強血液攜氧能力來提高血氧含量, 在這過程中鐵作為血液中氧的運輸載體在缺氧條件下其需求量必然會增加; 研究顯示在溶解氧含量低的條件下細(xì)胞對鐵的吸收、轉(zhuǎn)運、循環(huán)再利用等過程都會隨之發(fā)生改變, 魚類機體需要合成更多的血紅蛋白以增加氧氣的供應(yīng)(Xuet al, 2017), 因此鐵元素在魚類應(yīng)對低氧脅迫時發(fā)揮著重要作用, 研究其對魚體應(yīng)對低氧脅迫的影響具有重要的意義。

鐵作為細(xì)胞色素的重要組成成分, 參與魚類細(xì)胞內(nèi)的氧化還原供能過程, 該過程釋放的能量用來形成高能磷酸鍵, 供給肌肉收縮和代謝過程(如糖代謝、脂代謝、氧化磷酸化等), 有研究表明魚類機體用以健康生長的能量釋放與線粒體聚集鐵的水平呈正比關(guān)系。近年來的研究表明飼料中添加適量的鐵在維持魚類生長方面發(fā)揮了重要作用(Gatlinet al, 1986;Andersenet al, 1996; 魏萬權(quán)等, 1999; Shiauet al,2003; Linget al, 2010; 汪華, 2012; Luoet al, 2017;麻永財?shù)? 2019; 馮偉, 2020; Zafaret al, 2020), 但外源鐵離子變化對魚類應(yīng)對低氧脅迫的研究鮮有報道。

脅迫狀態(tài)下, 血液生理生化指標(biāo)尤其是糖、脂等能量代謝和酶活(SOD、GSH 等)等指標(biāo), 能客觀反映機體的應(yīng)激狀態(tài)和抗應(yīng)激調(diào)節(jié)機制, 是被廣泛用于評價魚類的生理健康和環(huán)境適應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)之一(Singhet al, 2017)。本研究以硫酸亞鐵為鐵源, 制作不同鐵含量飼料對大菱鲆幼魚進行投喂, 探究外源鐵離子攝入對大菱鲆在低氧脅迫過程中的影響, 從而為篩選既安全又能提高魚體生長及抗逆性的功能飼料添加劑提供新的研究思路, 同時也為研究鐵代謝對低氧脅迫調(diào)控機制的影響提供有效資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與飼養(yǎng)管理

本實驗所用的大菱鲆均來自煙臺市開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司, 在圓形水池(直徑2 m, 深1.5 m)中暫養(yǎng)10 d, 水溫為(14.0±0.5) °C, 氧氣泵連續(xù)通氧, DO=(8.0±0.5) mg/L, 鹽度為30, 每天早晚各一次投喂人工餌料。暫養(yǎng)結(jié)束后禁食3 d, 從暫養(yǎng)池中挑選個體均重為(20.0±5.0) g 的健康、較為活躍的大菱鲆幼魚600 尾, 隨機分到15 個圓桶(直徑1 m, 深1 m)中, 每桶40 尾, 將15 個桶隨機分為A、B、C、D、E 五個組,每組3 個重復(fù)組, 正常養(yǎng)殖環(huán)境[水溫為(14.0±0.5) °C,鹽度為30, 溶解氧DO=(8.0±0.5) mg/L]下分別投喂5種不同的實驗飼料, 每天早晚各一次, 投喂1 h 后放水, 每周對水體指標(biāo)如溫度、溶氧量、鹽度進行抽測,保持正常養(yǎng)殖環(huán)境穩(wěn)定, 飼養(yǎng)周期為60 d, 飼養(yǎng)結(jié)束后停食24 h, 準(zhǔn)確測量不同鐵水平飼料飼養(yǎng)的大菱鲆體重生長指標(biāo), 并采集血清, 以備后續(xù)實驗; 飼喂結(jié)束后選取不同外源鐵離子飼料組投喂的大菱鲆, 開展低氧脅迫實驗。

1.2 實驗飼料與實驗設(shè)計

1.2.1 飼料制作 本實驗根據(jù)鲆鰈類和其他魚類大致需鐵含量范圍373～800 mg/kg (魏萬權(quán)等, 1999;汪華, 2012; 馮偉, 2020), 制作5 種適量范圍內(nèi)的不同鐵水平的飼料對大菱鲆幼魚進行投喂, 優(yōu)化不含外源鐵基礎(chǔ)飼料配方(張玉玲等, 2017) (表1), 以硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為鐵源, 飼料中鐵的添加量為0、75、150、225、300 mg/kg, 分別制成五種不同鐵水平的顆粒飼料, 并送青島市華測檢測技術(shù)有限責(zé)任公司檢測, 最終飼料中鐵水平檢測結(jié)果見表1。

表1 實驗基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組分Tab.1 The basic feed formula and nutritional components in the experiment

1.2.2 低氧脅迫實驗 本實驗對經(jīng)過5 種不同鐵水平飼料飼喂60 d 后的大菱鲆開展低氧脅迫實驗。根據(jù)不同低氧情況下實驗魚的行為表現(xiàn)的預(yù)實驗結(jié)果, 選擇中度缺氧和重度缺氧兩個濃度, 進行低氧脅迫試驗, 即DO1=(4.0±0.5) mg/L 和DO2=(2.0±0.5) mg/L。具體設(shè)計如下: 低氧控制的實驗方法參照Burleson 等(2011)的基礎(chǔ)上略有修改。實驗均在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的封閉玻璃魚缸(長×寬×高=90×60×40 cm)中進行,低氧條件利用氮氣調(diào)節(jié)至所需的溶解氧水平, 每隔4 h 用溶氧儀(衡欣AZ8403)測量1 次溶解氧水平, 以保持水中溶氧量穩(wěn)定在設(shè)置水平, 同時為了減少氣體與大氣的交換, 玻璃缸上蓋有封閉性良好的塑料蓋, 低氧脅迫實驗設(shè)置2 個缺氧組[14 °C, 鹽度30,DO1=(4.0±0.5) mg/L, DO2=(2.0±0.5) mg/L]和對照組[14 °C, 鹽度30, DO=(8.0±0.5) mg/L], 每組10 尾魚, 3個重復(fù)共30 尾。低氧脅迫實驗期間不投喂, 12 h 進行血清、組織采集, 用于后續(xù)實驗; 低氧耐受實驗設(shè)置1 個缺氧組[DO=(2.0±0.5) mg/L], 每組10 尾魚, 3個重復(fù), 從放入大菱鲆幼魚(0 h)開始計時, 每2 h 進行一次數(shù)據(jù)記錄, 觀察大菱鲆的活動及健康狀況, 及時撈出死魚, 并記錄其存活狀態(tài)、死亡數(shù)量, 全部實驗魚達(dá)到半數(shù)致死, 實驗結(jié)束。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定 養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 停食24 h, 準(zhǔn)確測量不同鐵水平飼料飼養(yǎng)的大菱鲆的體重生長指標(biāo), 并計算其增重率(WGR), 計算公式如下:

1.3.2 樣品制備 各實驗組隨機抽取4 尾魚, 采樣前均用MS-222 (100 mg/L)對魚進行麻醉, 無菌條件下取其血液, 4 °C 放置6 h 后, 3 500 r/min 離心15 min后取血清于無菌離心管中, 放入–80 °C 保存, 用于血清生化指標(biāo)檢測。

1.3.3 酶活檢測 采集各實驗組血清中的葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、總超氧化物歧化酶(SOD), 采用酶標(biāo)儀進行測定, 檢測方法按照南京建成生物有限公司所研制的試劑盒說明書完成。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tfa)含量的檢測按照南京建成檢測試劑盒中的說明書進行, 具體流程: 準(zhǔn)備試劑、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品-向酶標(biāo)包被板中加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素抗原, 37 °C 反應(yīng)30 min, 第一次洗板5次, 加入親和素HRP, 37 °C 反應(yīng)30 min, 第二次洗板5 次, 加入顯色液A、B, 37 °C 顯色10 min, 按照加入顯色液順序依次加入終止液, 避光反應(yīng)15～10 min 之內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm 處依序測出各孔的吸光度(OD 值)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生長數(shù)據(jù)利用Excel 2010 和SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析, 酶聯(lián)免疫測皮質(zhì)醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白的數(shù)據(jù)使用ELISAcalc 進行計算, 擬合模型選用logistic 曲線(四參數(shù)), 結(jié)果最終以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示, 采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),P＜0.05 為差異顯著,P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 常氧情況下不同鐵水平飼養(yǎng)對大菱鲆生長的影響

正常條件即常氧情況下, 飼料中不同鐵水平對大菱鲆幼魚生長指標(biāo)影響結(jié)果見表2, 分析結(jié)果顯示,飼料中不同鐵水平對大菱鲆幼魚的末均重、增重率影響較為顯著(P＜0.05), 且隨著飼料中鐵水平的增加,大菱鲆的末均重、增重率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢, 其中C、D 兩組顯著高于其余三組(P＜0.05), 且 C 與D之間差異不明顯(P＞0.05)。

表2 常氧條件下不同飼料水平對大菱鲆生長指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.2 Effects of different feed levels on growth indexes of S. maximus (mean±SE) under normoxic conditions

2.2 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧脅迫條件下生理生化指標(biāo)的變化

2.2.1 對魚體血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的影響 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清轉(zhuǎn)鐵蛋白Tfa 的變化結(jié)果見圖 1, 結(jié)果顯示, 正常溶氧量DO=(8.0±0.5) mg/L 時, 隨著飼料中鐵水平的增加,大菱鲆血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量呈現(xiàn)降低趨勢, 但C、D、E三組之間的差異并不顯著; 隨著低氧脅迫逐漸加劇,A、B、C、D 四組飼喂的大菱鲆血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量均呈下降趨勢(P＜0.05), E 組則呈先下降后上升趨勢, 但上升趨勢不顯著。

圖1 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清轉(zhuǎn)鐵蛋白Tfa 含量的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.1 Changes of serum transferrin Tfa in S. maximus fed with different iron levels under normoxic and hypoxic conditions (mean±SE)

2.2.2 對魚體代謝的影響 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清葡萄糖(GLU)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量的變化結(jié)果見圖2, 分析結(jié)果顯示: (1) 常氧DO=(8.0±0.5) mg/L 條件下, 隨著飼料中鐵水平的增加大菱鲆血清中GLU 呈先升高后下降趨勢, 其中C 組高于D 組GLU 含量但差異不顯著, 但C、D 兩組顯著高于A、E 兩組, C 組為峰點; 隨著低氧脅迫加劇, GLU 含量均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢且差異顯著(P＜0.05)。(2) 常氧DO=(8.0±0.5) mg/L 條件下,大菱鲆幼魚血清中TC、TG 含量隨著飼料鐵水平的增加也呈先升高后下降趨勢, 其中D 組高于C 組但差異不顯著, 但C、D 兩組顯著高于其余三組, D 組為峰點;隨著低氧脅迫加劇, A、B、E 三組鐵水平飼喂的大菱鲆血清 TC 含量均呈逐漸上升趨勢且差異顯著(P＜0.05), C、D 組則呈先上升后下降趨勢; 而血清TG含量C、D、E 三組均呈先上升后下降趨勢, A、B 組則呈逐漸上升趨勢(P＜0.05)。

圖2 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清葡萄糖(GLU)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.2 Changes of serum glucose (GLU), cholesterol (TC), and triglyceride (TG) contents in S. maximus fed at different iron levels under normoxic and hypoxic conditions (mean±SE)

2.2.3 對魚體抗氧化能力的影響 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清 SOD 和GSH-PX 含量變化結(jié)果見圖3, 結(jié)果顯示, (1) 常氧DO=(8.0±0.5) mg/L 條件下, 隨著飼料中鐵水平的增加, 大菱鲆幼魚血清SOD 活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, C 組血清中 SOD 活性顯著高于其他四組(P＜0.05); 隨著低氧脅迫逐漸加劇, A、B、E 三組大菱鲆幼魚血清SOD 活性呈逐漸升高的趨勢(P＜0.05), 而C、D 組SOD 活性雖然也略有上升但差異并不顯著。(2) 常氧DO=(8.0±0.5) mg/L 條件下, 大菱鲆幼魚血清中GSH-PX 活性隨著飼料鐵水平的增加也呈先升高后下降趨勢, D 組血清GSH-PX 活性顯著高于A、B、E 三組(P＜0.05); 隨著低氧脅迫逐漸加劇, A、B 組呈顯著上升趨勢(P＜0.05), C、D 組雖上升但并不顯著,E 組呈現(xiàn)顯著上升, 而后出現(xiàn)下降趨勢但并不顯著。

圖3 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在常氧條件和低氧條件下血清SOD 和GSH-PX 含量變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.3 Changes of serum SOD and GSH-PX contents in S. maximus fed at different iron levels under normoxic and hypoxic conditions(mean±SE)

2.2.4 飼料鐵水平對魚體耐低氧能力的影響 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆對重度缺氧[DO=(2.0±0.5) mg/L]耐受情況見表3, 隨著飼料中鐵水平的增加, 首尾死亡時間E＜A＜B＜D＜C, 末尾死亡時間 C＜D＜B＜E＜A,大菱鲆的死亡率D＜C＜B＜E＜A, 雖然C、D 組死亡率差異不顯著, 但均顯著小于其他三組(P＜0.05)。

表3 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆對重度缺氧[DO=(2.0±0.5) mg/L]條件的耐受情況Tab.3 Tolerance to severe hypoxic [DO=(2.0±0.5) mg/L]conditions in S. maximus reared at different iron levels

3 討論

3.1 不同鐵水平飼養(yǎng)對大菱鲆常氧條件下生長的影響

有研究表明缺鐵或者鐵吸收不足時, 不僅影響魚類肌紅蛋白、血紅蛋白合成, 還會降低參與眾多生命過程所必需的氧化還原酶的活性(Haase, 2010), 造成魚類供氧不足, 易引發(fā)食欲不振、生長遲緩、抵抗力減弱、貧血甚至死亡等癥狀(張浩東等, 1998; Yeet al, 2007)。因此飼料中鐵水平對魚類的生長有著顯著影響。本研究結(jié)果顯示, 隨著飼料中鐵含量的增加,實驗幼魚末均重、增重率均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,且C、D 兩組顯著高于A、B、E 三組(P＞0.05)。在尼羅羅非魚的研究中, 其體重增長率隨著飼料中鐵含量增加而增加, 而超出一定范圍后則出現(xiàn)下降, 與本研究結(jié)果一致(Shiauet al, 2003); 魏萬權(quán)等(1999)對牙鲆的研究中向含鐵量為323 mg/kg 的基礎(chǔ)飼料中添加0～50 mg/kg 鐵時, 能夠顯著促進牙鲆的生長, 添加80～140 mg/kg 的鐵反而會降低魚的生長; 在軍曹魚(麻永財?shù)? 2019)、印度囊鰓鯰魚(Heteropneustes fossilis) (Zafaret al, 2020)、建鯉(Cyprinus carpio)(Linget al, 2010)、斑點叉尾(Ictalunes punctatus)(Gatlinet al, 1986)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)(Luoet al, 2017)、羅非魚(Oreochromis niloticus) (Shiauet al, 2003)、鳙魚(Aristichthys nobilis) (馮偉, 2020)、吉富羅非魚(GIFT tilapia) (汪華, 2012)等研究中的生長指標(biāo)結(jié)果均呈相似趨勢。這說明在飼料中補充適宜添加量的鐵離子, 能夠顯著改善一些魚的生長性能, 鐵添加不足或者過量對魚類生長并無促進作用。

3.2 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆對低氧脅迫條件下代謝指標(biāo)的影響

鐵作為重要的氧載體和電子傳遞體參與生物機體內(nèi)的氧化還原供能過程, 影響著生物體的物質(zhì)代謝和能量代謝(曲江斌等, 1998; Qiaoet al, 2013)。在本實驗中C、D 組飼喂的大菱鲆幼魚血清中葡萄糖(GLU)含量高于A、B、E 三組, 這說明該兩組飼喂的魚在糖代謝方面比較旺盛, 供給機體生長發(fā)育所需要的能量較多。在生長性狀對比實驗中, 我們發(fā)現(xiàn)C、D 組飼喂的魚明顯要比A、B、E 三組飼喂的魚在條件反射性游動、攝食等方面要旺盛。

而當(dāng)生物體處于低氧環(huán)境時, 能量代謝會發(fā)生一系列變化, 糖類作為最有效的供能源, 也是在低氧脅迫下最常動用的能量物質(zhì)(Liet al, 2018)。本研究結(jié)果顯示: 隨著低氧脅迫加劇, 五組鐵水平飼喂的大菱鲆血清中GLU 含量均呈現(xiàn)上升趨勢, 這一結(jié)果與大口黑鱸研究相似, 說明低氧脅迫對糖代謝產(chǎn)生了顯著影響(Sunet al, 2020); 相同低氧條件下, C、D 組的GLU 含量均顯著高于其他三組, 該結(jié)果表明外源鐵離子在適宜范圍內(nèi)添加, 可以提高魚體糖代謝水平,結(jié)合低氧耐受實驗結(jié)果(表4), 表明當(dāng)GLU 含量高時其提供的能量相對較高, 因此可能相應(yīng)提高了魚體低氧耐受能力。

鐵作為機體基礎(chǔ)代謝的必需微量元素之一, 在脂質(zhì)代謝過程中, 參與一些酶和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)成, 可以直接影響肝臟脂質(zhì)負(fù)荷、代謝與分泌。血脂指標(biāo)(TG, TC)可以反映機體脂代謝水平。本研究結(jié)果顯示: 常氧條件下, 大菱鲆幼魚血清中TG、TC 含量逐漸升高, 這與在哺乳動物中的研究結(jié)果相似(張媛等, 2011)。Heinecke 等(1984)認(rèn)為, 體內(nèi)鐵不足可影響LDL 的合成, 并能減弱動脈內(nèi)膜粥樣硬化斑塊的形成, 在對中度缺鐵大鼠的研究中發(fā)現(xiàn), 中度缺鐵會導(dǎo)致大鼠血清甘油三酯、膽固醇水平降低, 隨著外源鐵水平的增加, 顯著升高; 也表明脂代謝過程中需要鐵的參與, 所產(chǎn)生的一系列變化可能與肝臟功能活動的變化有關(guān)。

隨著低氧脅迫加劇, 在C、D 兩組血清TG、TC含量呈下降趨勢, 這與軍曹魚、鰱魚低氧脅迫下血脂指標(biāo)變化研究結(jié)果相似(胡利雙, 2017; 郭志雄, 2020),該結(jié)果表明隨著低氧加劇, 魚體耗能增加, 體內(nèi)脂類物質(zhì)消耗加快, TG 和TC 用于機體功能滿足需求。然而, 低鐵組(A、B)血清TG、TC 含量均呈先上升后下降趨勢, 高鐵組(E)則呈上升趨勢, 與上述結(jié)果不一致,我們推測低鐵攝入影響脂質(zhì)代謝, 而低氧脅迫造成脂代謝紊亂, 但當(dāng)兩個脅迫因子(低鐵、低氧)同時作用機體的影響機制尚不清楚, 還需要繼續(xù)深入探究。

3.3 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在低氧脅迫條件下對其轉(zhuǎn)鐵蛋白的影響

在生理情況下, 血清中的鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白是判斷機體鐵缺乏或鐵超負(fù)荷的有效標(biāo)志物(張開羽等,2020)。在本研究中, 無論在正常溶解氧[DO=(8.0±0.5)mg/L]還是低氧脅迫[DO=(4.0±0.5)、(2.0±0.5) mg/L]條件下, 隨著飼料中鐵水平的增加, 大菱鲆血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量均呈現(xiàn)降低趨勢, 這表明飼料中上升的鐵水平會抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá), 轉(zhuǎn)鐵蛋白含量越低無法結(jié)合過多游離鐵造成鐵超負(fù)荷狀態(tài), 過量的鐵會導(dǎo)致過氧化物以及自由基的產(chǎn)生進而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明鐵過量時, 轉(zhuǎn)鐵蛋白被抑制表達(dá),減少了機體攝取貯鐵池或者紅細(xì)胞生成器官中的鐵,與本研究結(jié)果一致(Yoshigaet al, 1997)。生物機體內(nèi)約 1 000 mg 的鐵儲存在肝臟中、約3 mg 與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合后用于血液循環(huán), 為大多數(shù)細(xì)胞供鐵, 而1 800 mg 的鐵在紅細(xì)胞中用于氧氣運輸和肌紅蛋白合成(Hentzeet al, 2004), 因此細(xì)胞內(nèi)的鐵和氧穩(wěn)態(tài)緊密相連, 相應(yīng)的傳感器IRP 和HIF 的活動受鐵和氧的可用性控制(Gassmannet al, 2015)。通過鐵和氧控制系統(tǒng)的相互作用來調(diào)節(jié)鐵水平相關(guān)基因的表達(dá)最終決定了紅細(xì)胞生成的程度以及腸道對鐵的吸收速度(Royet al, 2000)。本研究中C、D、E 三組Tfa 含量隨著低氧脅迫加劇進而降至最低, 說明急性缺氧條件下, 魚類細(xì)胞對膳食鐵的吸收和巨噬細(xì)胞的釋放不能滿足對紅細(xì)胞生成以及充當(dāng)氧氣運輸載體的需要, 鐵吸收不足導(dǎo)致血色素水平降低, 體內(nèi)供氧減少造成生理性缺氧, 從某種程度上講, 缺鐵具有模擬缺氧的作用, 因此, 鐵和氧氣必須以緊密協(xié)調(diào)的方式相互影響才能維持魚類內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡, 保證其健康生長發(fā)育。

3.4 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在低氧脅迫條件下對其抗氧化性的影響

有研究發(fā)現(xiàn), 在低氧條件下魚類會表現(xiàn)出低氧應(yīng)激反應(yīng), 蝦虎魚(Perccottus glenii) (Lushchaket al,2007)、鳉魚(Fundulus heteroclitus) (Duet al, 2016)等魚類通過增加其抗氧化酶(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等活性來提高其抗氧化能力(Shahet al, 2009; Wanget al, 2010; Lushchak,2011)。本實驗結(jié)果顯示, 在正常溶氧量DO=(8.0±0.5)mg/L 情況下C 組大菱鲆血清中SOD 活性最高, D 組GPx 活性最高, 且這兩組的SOD、GPx 活性顯著高于A、C、E 三組; 說明C、D 組大菱鲆幼魚抗氧化能力較強。在低氧脅迫實驗中, A、B、E 三組血清中SOD、GPx 活性均呈顯著升高的趨勢, 說明隨著低氧脅迫的加劇, 這三組均表現(xiàn)出低氧應(yīng)激反應(yīng), 以清除魚類機體產(chǎn)生的過多的ROS, 盡量減少低氧應(yīng)激對機體損傷, 這與Behera 等(2014)報道的通過向基礎(chǔ)飼料中補充鐵, 提高了野鯪魚(Labeo rohita)肝臟中 SOD 活性的研究結(jié)果一致, 而C、D 兩組表現(xiàn)為不顯著上升趨勢, 但兩種酶活性都顯著高于其他組, 表明C、D 組本身抗氧化能力較強可以更好地應(yīng)對低氧應(yīng)激反應(yīng),從而表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)不強烈。不同組產(chǎn)生抗氧化差異的主要機理為, 鐵過量(E 組)時, 鐵主要通過發(fā)生Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基及羥基, 損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA, 誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)對魚類機造成毒害作用, 低氧脅迫加劇了應(yīng)激損傷。鐵與硫共同構(gòu)成鐵硫中心參與多種氧化還原酶(如SOD、GSH 等)的合成,急性缺氧應(yīng)激時, 鐵缺乏(A、B 組)導(dǎo)致合成原料不足,降低了魚類的抗氧化性, 而適量添加鐵(C、D 組)避免了以上兩種問題。這與李根芳等(2021)的研究中適當(dāng)補充外源鐵離子能夠提高斑馬魚肝臟細(xì)胞應(yīng)對低氧脅迫的壓力研究結(jié)果一致, 以上均說明飼料中適當(dāng)添加鐵離子可提高其抗氧化能力。

3.5 不同鐵水平飼養(yǎng)大菱鲆在低氧脅迫條件下對其低氧耐受性的影響

大量補鐵可使血清鐵濃度超過轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合能力造成游離鐵的產(chǎn)生(艾維, 2008), 這些游離鐵通過Fenton 反應(yīng)催化產(chǎn)生過量活性氧(ROS), 造成氧化應(yīng)激損傷。低氧耐受性比較實驗結(jié)果顯示, 在低氧DO=(2.0±0.5) mg/L 應(yīng)激條件下, 低鐵組(A)死亡率顯著高于其他四個小組, 推測是由于A 組飼料中鐵離子較低, 造成機體鐵缺乏, 有研究顯示, 缺鐵自由基的產(chǎn)生和清除均需含鐵酶類的參與, 缺鐵時, 催化自由基產(chǎn)生和清除的酶活性都降低, 導(dǎo)致自由基清除障礙, 過多的自由基可攻擊細(xì)胞膜、線粒體膜及溶酶體膜等, 從而對機體產(chǎn)生氧化損傷; 在低氧脅迫下,加快自由基的產(chǎn)生, 最終導(dǎo)致機體失衡甚至死亡。高鐵組(E)死亡率較高可能是高鐵飼料飼喂后機體內(nèi)儲存了大量了游離鐵, 產(chǎn)生了本身不能夠清除的ROS,低氧脅迫加劇了氧化應(yīng)激損傷進而死亡。而C、D 組死亡率顯著低于其他三個小組, 從糖代謝、脂代謝以及抗氧化酶活性分析結(jié)果顯示, 適量的鐵離子, 對機體能量補給, 以及抗氧化系統(tǒng)的增強都具有促進作用, 因此可相對延長或提高大菱鲆耐低氧脅迫的能力。在細(xì)胞水平上, 李根芳等(2021)關(guān)于鐵離子對斑馬魚肝臟細(xì)胞應(yīng)答低氧脅迫的影響研究中發(fā)現(xiàn), 補充外源鐵離子可以提高胞內(nèi)鐵離子水平, 產(chǎn)生一些有益的ROS 有助于提高低氧脅迫下細(xì)胞的生存率均與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究制作不同鐵含量飼料對大菱鲆幼魚進行投喂, 探究不同鐵水平飼養(yǎng)對大菱鲆常氧下生長及耐低氧能力影響, 結(jié)果顯示飼料中添加適量的鐵, 能夠顯著改善大菱鲆的生長性能, 同時可以提高耐低氧能力。因此, 鐵離子在魚類機體應(yīng)對低氧應(yīng)激時發(fā)揮了重要作用, 具體的調(diào)控機制有待進一步研究。本文結(jié)果將為今后研制功能性餌料添加劑提供數(shù)據(jù)支撐, 進而為魚類健康養(yǎng)殖提供新的研究思路, 同時也為深入探究魚類鐵代謝對低氧脅迫調(diào)控機制影響奠定基礎(chǔ)。