萘酚對煤氣化廢水微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

范凱琪，孔令翯，鄧文慧，蓋恒軍，肖 盟

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

煤熱解過程中產(chǎn)生的大量有機污染物，如酚類化合物、雜環(huán)類化合物和多環(huán)芳烴等，具有較高的生物毒性，使得煤氣化廢水的可生化性較差，生化處理難度大[1]。因此，在進行生化處理前，先對煤氣化廢水進行“酚氨回收”等預(yù)處理工藝以去除大部分有機污染物，但生化系統(tǒng)仍存在運行不穩(wěn)定的現(xiàn)象。酚類化合物是生化進水中的主要污染物及關(guān)鍵致毒物質(zhì)，包括苯酚、甲酚、乙基苯酚及萘酚等。其中萘酚在煤氣化廢水中廣泛存在，在自然界中可被微生物降解為1,2-二羥基萘、龍膽酸等小分子化合物。生物毒性分析表明，萘酚的半數(shù)有效濃度(EC50)值為2.59 mg·L-1，而苯酚的EC50值為359.97 mg·L-1[2]。因此，雖然萘酚在煤氣化廢水中含量相對較低，但其仍具有較高的生物毒性。

在廢水處理過程中，微生物菌群能夠根據(jù)進水中污染物的不同發(fā)生相應(yīng)的變化，以維持穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)及性能。Yang等[3]研究了吲哚對含酚模擬廢水微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)苯酚可作為代謝基質(zhì)促進吲哚的降解，其中Thermomonas、Pseudomonas、Comamonas、Dyella在苯酚和吲哚的代謝過程中發(fā)揮了重要作用。Huang等[4]研究了焦化廢水中微生物與污染物的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Enterobacter、Pseudomonas和Sedimentibacter與苯酚的降解有關(guān)，而Pseudomonas、Sedimentibacter、Comamonas、Dysgonomonas則與萘酚的降解呈正相關(guān)性。目前，關(guān)于萘酚對煤氣化廢水微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。鑒于此，作者采用高通量測序技術(shù)研究萘酚對煤氣化廢水污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，并探討功能微生物的相對豐度變化及相關(guān)性，以進一步闡釋煤氣化廢水中微生物對萘酚的響應(yīng)機制，為煤氣化廢水中萘酚的生物降解提供理論支撐。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

污泥，取自內(nèi)蒙古某煤化工企業(yè)污水生化處理厭氧段。

萘酚(質(zhì)量分數(shù)98%)、苯酚(質(zhì)量分數(shù)98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、無水硫酸鈉、NaCl，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

5B-3F型COD測定儀，北京連華永興科技發(fā)展有限公司；島津2014C型氣相色譜儀，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；HZQ-C型空氣浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基(MSM，g·L-1)：K2HPO41.0，KH2PO41.0，CaCl20.01，NaNO30.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO40.5，NH4Cl 1.0；pH值7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

苯酚-無機鹽培養(yǎng)基：配制一定濃度的苯酚儲備液，取適量加入到250 mL錐形瓶中，加入適量無機鹽培養(yǎng)基，使苯酚終濃度為250 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 污泥馴化

將苯酚-無機鹽培養(yǎng)基加入到500 mL螺口瓶中，污泥接種量MLSS為3 500 mg·L-1，總反應(yīng)體積為400 mL，用橡膠塞封口并通入適量空氣，置于35 ℃恒溫振蕩器中，對污泥進行馴化，溶解氧(DO)在0.1～0.5 mg·L-1之間，水力停留時間為48 h。運行30 d后，將適量萘酚加入進水中，使其濃度控制在3 mg·L-1，作為萘酚組(簡稱N)；并以不添加萘酚作為對照組(簡稱C)。每隔48 h參照HJ 828-2017《水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測定 重鉻酸鹽法》測定進、出水COD，并計算COD去除率。用乙酸乙酯萃取出水中的污染物，采用氣相色譜法測定出水中苯酚和萘酚的殘留量。

氣相色譜條件：以N2為載氣，檢測器溫度250 ℃，進樣器溫度270 ℃；初始柱溫100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至230 ℃，終溫230 ℃保持1.5 min[5]。

1.4 菌群DNA的提取及測序

出水水質(zhì)運行穩(wěn)定后，取適量污泥，用DNA提取試劑盒提取污泥總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用NanoDrop 2000檢測DNA的含量和純度。采用16S rDNA 通用引物擴增細菌DNA的V3-V4區(qū)，正向引物341F為 5′-CCTACACGACGCTCTTCCG-ATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向引物805R為5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-ATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′[6]。對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳回收、定量分析后，采用Illumina MiSeq平臺進行測序，每組樣品做4個平行，結(jié)果取平均值。測序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.5 高通量測序及分析

采用華大基因擴增子分析平臺對測序結(jié)果進行分析。測序所得原始序列經(jīng)拼接和質(zhì)控后，對所得操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)進行聚類分析和物種分類學(xué)分析，采用Wilcoxon Rank-Sum Test進行alpha多樣性分析，使用QIIME軟件進行主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)。在門、屬等水平繪制物種相對豐度柱狀圖，屬水平中物種相對豐度<0.5%和沒有注釋到的物種均合并為Others；在門水平進行物種差異性分析，使用FDR(false discovery rate)評估差異的顯著性。選取相對豐度前10的物種進行差異顯著性檢驗。使用R(V3.4.1)和Cytoscape繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 萘酚對出水水質(zhì)的影響

進、出水COD及COD去除率如圖1所示。

圖1 進、出水COD(a)及COD去除率(b)Fig.1 COD of influent and effluent(a) and COD removal rate(b)

由圖1可知，對照組進水COD約520 mg·L-1，出水COD約30 mg·L-1，COD去除率在90%以上，表明微生物對苯酚的降解效果較好。萘酚組進水COD約560 mg·L-1，在初始運行階段，出水COD平均值約75 mg·L-1，但隨著運行時間的延長，運行30 d后出水COD維持在50 mg·L-1左右，COD去除率達90%左右。出水中未檢出苯酚和萘酚，表明經(jīng)生化處理后，苯酚和萘酚降解較為徹底。

2.2 萘酚對菌群多樣性的影響

菌群的alpha多樣性如圖2所示。

圖2 alpha多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis

由圖2可知，對照組和萘酚組的Chao1指數(shù)沒有顯著性差異(圖2a)，表明兩組菌群豐度較為接近。萘酚組的Shannon指數(shù)顯著低于對照組(P=0.0287<0.05)(圖2b)，表明加入萘酚后菌群多樣性下降。PCoA分析(圖3)顯示，萘酚能夠顯著影響菌群的物種分布(PERMANOVA，P<0.05)。

圖3 主坐標分析Fig.3 PCoA analysis

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平物種的相對豐度如圖4所示。

圖4 門水平物種相對豐度柱狀圖Fig.4 Relative abundance histogram of major microbial species at phylum level

由圖4可知，對照組中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為優(yōu)勢菌門，相對豐度分別為48.0%和19.4%，其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、Ignavibacteria和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)，相對豐度分別為5.1%、4.7%和4.2%。萘酚組中，Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria為優(yōu)勢菌門，相對豐度分別為31.3%、22.9%和20.1%，其次為Sphingobacteriia、Ignavibacteria和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)，相對豐度分別為5.0%、4.5%和3.1%。加入萘酚后，Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria仍是優(yōu)勢菌群，Betaproteobacteria的相對豐度降低了16.7%；Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相對豐度均顯著高于對照組，表明萘酚對Betaproteobacteria有一定的抑制作用，但對Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia和Deltaproteobacteria無抑制作用。

2.4 關(guān)鍵物種差異分析

屬水平物種的相對豐度如圖5所示。

圖5 屬水平物種相對豐度柱狀圖Fig.5 Relative abundance histogram of major microbial species at genus level

由圖5可知，對照組中，Thermomonas的相對豐度最高(11.3%)，其次為Alicycliphilus、Ignavibacterium、Zoogloea、Caldilinea和Georgfuchsia，相對豐度分別為6.7%、4.6%、2.7%、2.6%和2.1%，其中相對豐度<0.5%的物種約占總菌群的62.6%。萘酚組中，Azospirillum的相對豐度最高(17.7%)，其次為Thermomonas(12.4%)，此外，Alicycliphilus(7.4%)、Ignavibacterium(4.3%)、Georgfuchsia(2.4%)、Caldilinea(2.1%)的相對豐度也較高。

選取相對豐度前10的物種作為關(guān)鍵物種進行差異性分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 關(guān)鍵物種相對豐度差異柱狀圖Fig.6 Relative abundance difference histogram of key species

由圖6可知，萘酚組中，Thermomonas、Alicycliphilus的相對豐度略有升高，但并不顯著(P>0.05)，表明這兩類微生物受萘酚的影響較小。對照組和萘酚組中，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相對豐度均較高。其中，Thermomonas是一類具有反硝化性能的芳香族化合物降解菌[3]；Alicycliphilus是一類能夠利用氧、硝酸鹽、氯酸鹽作為最終電子受體，在好氧和缺氧條件下降解外源污染物的細菌，所涉及的外源污染物包括苯、甲苯、萘、蒽等單環(huán)和多環(huán)芳烴類化合物及含氮雜環(huán)類化合物[7]；Ignavibacterium是一類異養(yǎng)發(fā)酵細菌，能夠在厭氧條件下降解酚類化合物[8]；Caldilinea屬綠彎菌門，在厭氧消化系統(tǒng)中通常占有較高豐度，是一類互養(yǎng)型細菌，對甲烷的產(chǎn)生具有較強的促進作用[9]。這4類微生物在菌群結(jié)構(gòu)中相對豐度較穩(wěn)定，表明其能夠適應(yīng)不同酚類污染物且能夠耐受萘酚的毒性，是降解苯酚和萘酚的主要物種。與對照組比較，萘酚組中Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter的相對豐度顯著升高(P<0.05)，說明這3類微生物具有降解萘酚的性能或與其它物種協(xié)同作用實現(xiàn)萘酚的降解。其中，Azospirillum對酚類化合物具有較強的降解性能[10]，多見于根際微生物中，對苯甲酸鹽類殺蟲劑具有較高的耐受性[11]；Georgfuchsia屬β-變形菌綱，是一類在嚴格厭氧條件下利用硝酸鹽、Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)作為電子受體降解單環(huán)芳烴的反硝化細菌[12]；Flavihumibacter在多環(huán)芳烴降解菌群的富集過程中常具有較高豐度[13-14]。與對照組比較，萘酚組中Zoogloea、Thauera和Parvibaculum的相對豐度顯著降低(P<0.05)，表明在萘酚作用下，其生長代謝活性受到抑制。

物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)可以直觀展示物種間的相關(guān)性。其中，Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分別與Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相關(guān)性，表明這些微生物之間存在協(xié)同關(guān)系。Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae和Gemmatimonasaurantiaca均具有降解芳烴類化合物的性能，萘酚經(jīng)降解后開環(huán)可生成小分子化合物，這些小分子化合物可通過Ignavibacteriumalbum和Caldilineatarbellica的進一步降解實現(xiàn)萘酚的去除。由此可見，加入萘酚后，部分降解多環(huán)芳烴及酚類化合物的功能微生物的相對豐度升高，在菌群協(xié)同作用下可實現(xiàn)萘酚的有效去除。

圖7 關(guān)鍵物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation network diagram of key species

3 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)研究了萘酚對煤氣化廢水污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討了功能微生物的相對豐度變化及相關(guān)性。結(jié)果表明，加入萘酚后，出水COD升高，運行30 d后，出水COD可穩(wěn)定在50 mg·L-1左右；菌群的多樣性降低，且菌群的物種分布顯著改變，其中Betaproteobacteria的相對豐度降低，Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相對豐度有所升高。關(guān)鍵物種差異性分析表明，加入萘酚后，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相對豐度沒有顯著變化，但Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter等具有酚類、多環(huán)芳烴降解性能的微生物的相對豐度顯著升高(P<0.05)，且Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分別與Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相關(guān)性，推斷通過這些功能微生物的協(xié)同作用可降低出水COD，實現(xiàn)萘酚的有效去除。