團(tuán)頭魴foxO基因家族的序列特征及表達(dá)分析

張阿鑫 陳 康 王偉峰 劉 紅,2 王煥嶺,2

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070;2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 武漢 430070)

Fox(Forkhead box)蛋白家族是最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 其成員包含一個(gè)進(jìn)化上高度保守的約100多個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 被稱(chēng)為叉頭結(jié)構(gòu)域(Forkhead domain, FH)[1,2]。迄今為止, 從原核生物到真核生物中均發(fā)現(xiàn)Fox成員的存在, 并將其分為19個(gè)亞類(lèi)(A到S)[1]。其中FoxO是一個(gè)非常重要的亞家族, 在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4個(gè)FoxO同源基因, FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6[3,6,7], 而在一些硬骨魚(yú)類(lèi)中有7個(gè)成員, FoxO1a、FoxO1b、FoxO3a、FoxO3b、FoxO4、FoxO6a和FoxO6b[8],這些成員間具有較高的同源性。

FoxO的活性受磷酸化、乙?；头核鼗鹊恼{(diào)控, 而由于其具有高度保守的蘇氨酸和絲氨酸殘基的磷酸化位點(diǎn), 因此磷酸化是FoxO的主要修飾方式[3,4]。FoxO的功能發(fā)揮主要受兩種進(jìn)化保守的信號(hào)通路調(diào)控: 其一是經(jīng)典的胰島素信號(hào)通路, 即生長(zhǎng)因子存在的情況下通過(guò)磷脂酰肌醇三激酶(Phosphatidylin-ositol-3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(Protein kinase B, PKB, 也叫AKT)調(diào)控; 其二是Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路, 在氧化應(yīng)激時(shí)通過(guò)該通路起作用[5]。FoxO作為轉(zhuǎn)錄激活因子, 往往通過(guò)調(diào)控下游靶基因來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能, 在DNA損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和自噬、細(xì)胞增殖與分化及細(xì)胞代謝等方面都發(fā)揮重要作用[3]。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)又名武昌魚(yú), 為草食性淡水魚(yú)類(lèi), 常見(jiàn)于長(zhǎng)江中游地區(qū)。自20世紀(jì)60年代以來(lái), 團(tuán)頭魴已被公認(rèn)為中國(guó)淡水魚(yú)混養(yǎng)體系中主要的品種和最受歡迎的養(yǎng)殖品種之一[9—11], 并成為我國(guó)最重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一[12,13]。然而, 隨著養(yǎng)殖密度的增加, 水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程的加重, 水生生態(tài)系統(tǒng)的氧氣需求量急劇增加[14]。另外, 全球氣候變暖的趨勢(shì)日漸嚴(yán)重也增加了魚(yú)類(lèi)對(duì)氧氣的需求[15], 進(jìn)而導(dǎo)致水體溶解氧的減少[16]。尤其是在淡水環(huán)境中, 每天水體的含氧量處于波動(dòng)的狀態(tài)中[17], 因此低氧正成為水生生物生存壓迫下的普遍問(wèn)題[18,19]。為了進(jìn)一步了解魚(yú)類(lèi)的低氧應(yīng)激機(jī)制, 我們前期對(duì)團(tuán)頭魴低氧脅迫后的生理生化、免疫應(yīng)答和氧化應(yīng)激及基因表達(dá)等的變化進(jìn)行了研究[11,20—22], 同時(shí), 也發(fā)現(xiàn)低氧會(huì)引起團(tuán)頭魴foxO信號(hào)通路顯著富集[11]。然而,foxO是否參與團(tuán)頭魴低氧應(yīng)激, 其在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的分布等信息都是不清晰的。因此, 本研究基于組學(xué)及PCR鑒定了團(tuán)頭魴foxO基因, 并對(duì)其時(shí)空分布及在低氧脅迫下的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。這些結(jié)果為進(jìn)一步了解魚(yú)類(lèi)foxO基因在低氧應(yīng)答中的作用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 低氧處理實(shí)驗(yàn)及樣品采集

本研究所用團(tuán)頭魴來(lái)自湖北省百容水產(chǎn)良種有限公司, 將幼魚(yú)[體重(50±5) g]和成魚(yú)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后在暫養(yǎng)池中正常飼喂, 2周后用于正式實(shí)驗(yàn)。通過(guò)向水體中充入氮?dú)獾姆椒▽?duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)進(jìn)行低氧處理, 用保鮮薄膜封閉水槽上方, 使用便攜式溶解氧測(cè)定儀(JPB-607A)測(cè)定溶氧, 急性低氧(DO:1.0 mg/L, T: 25℃)處理0.5h后, 取肝臟、脾臟、肌肉、腦、心臟、鰓、腸、腎臟和血液9個(gè)組織, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)3尾, 置于加有1 mL TRIzol的離心管中, –80℃保存, 用于總RNA的提取。以常氧[DO: (5.5±1.0) mg/L]作為對(duì)照。

用于時(shí)空表達(dá)分析的樣品取自常氧條件下團(tuán)頭魴成魚(yú)(n=3)的肝臟、腦、腸、鰓、心、肌肉、血液、脾臟和腎臟9個(gè)組織, 以及不同發(fā)育時(shí)期的胚胎和仔稚魚(yú), 取樣后立即放入液氮中速凍, –80℃保存, 用于總RNA的提取。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用TRIzol試劑提取團(tuán)頭魴不同組織或不同發(fā)育時(shí)期胚胎的總RNA, 具體按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 具體為: 1 μg總RNA、5 μL oligo(dT)引物, 加RNase-free水至總體積15 μL, 在70℃孵化5min, 冰上放置2min。然后向混合物中加入1 μL RNA抑制劑、5 μL M-MLV緩沖液(5×)、2 μL dNTPs(10 mmol/L)、1 μL MMLV酶和1 μL RNase-free水, 42℃孵育60min。

1.3 基因的擴(kuò)增

利用團(tuán)頭魴基因組[25]和本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù), 用斑馬魚(yú)的foxO家族基因進(jìn)行Blastn(E值設(shè)定為1×10–5)比對(duì), 從而獲得團(tuán)頭魴7個(gè)foxO基因的cDNA序列。以獲得的cDNA為模板設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證其ORF序列的準(zhǔn)確性(引物序列見(jiàn)表 1)。引物的合成和測(cè)序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物Tab. 1 Primers used in the experiment

1.4 序列分析

將cDNA序列與基因組序列進(jìn)行比對(duì), 并按GT-AG法則確定外顯子和內(nèi)含子的位置, 構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)圖; 通過(guò)NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)及相應(yīng)的氨基酸序列; 使用ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)在線工具計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)和相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)等參數(shù); 利用DNAMAN(https://www.lynnon.com/)分析氨基酸序列的同源性; SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)FoxO蛋白的結(jié)構(gòu)域;用MAGE 6.0軟件使用最大似然法構(gòu)建FoxO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 并對(duì)其進(jìn)行1000次bootstrap檢驗(yàn)。

1.5 熒光定量PCR

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qPCR)分析團(tuán)頭魴foxO基因的表達(dá)(引物序列見(jiàn)表 1), 根據(jù)參考文獻(xiàn)[22—24]選擇ACTB為內(nèi)參基因。qPCR總反應(yīng)體系為20 μL, 包含7.4 μL的超純水, 上、下游引物各0.8 μL, 1 μL cDNA模板, 10 μL SYBR Green mix reagent。采用三步法進(jìn)行qPCR,具體如下: 預(yù)變性95℃ 5min, 接著40個(gè)循環(huán)包括95℃變性15s, 60℃退火30s及72℃延伸30s, 每個(gè)樣品3次重復(fù)。用2–??Ct方法計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因ACTB的表達(dá)量。

1.6 載體構(gòu)建

從團(tuán)頭魴基因組中下載foxO1b基因的啟動(dòng)子序列, 使用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物(引物序列見(jiàn)表 1), 并以團(tuán)頭魴肌肉組織的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 然后將獲得的序列經(jīng)雙酶切后定向連接到pGL3-basic載體中, 構(gòu)建pGL3-foxO1b啟動(dòng)子載體。同時(shí)為了驗(yàn)證Hif-1α對(duì)foxO1b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控, 我們將團(tuán)頭魴hif-1α基因的cDNA序列與pCMV-myc載體連接, 以構(gòu)建hif-1α的過(guò)表達(dá)載體。

1.7 啟動(dòng)子活性分析

Hela細(xì)胞生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液, 置于37℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中。將Hela細(xì)胞接種于24孔板, LipofectaminTM2000 轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCMV-myc-Hif-1α或pCMV-myc, 熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-foxo1b或pGL3-basic, 內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK, 轉(zhuǎn)染24h后,根據(jù)Dual-LuciferaseCReporterAssay System說(shuō)明書(shū)測(cè)定雙熒光素酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來(lái)表示, 兩組數(shù)據(jù)分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 多組數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 兩兩比較采用Duncan檢驗(yàn), 以P=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 團(tuán)頭魴foxO家族的序列特征

基因的序列分析基于組學(xué)測(cè)序及PCR驗(yàn)證, 獲得團(tuán)頭魴foxO1a、foxO1b、foxO3a、foxO3b、foxO4、foxO6a和foxO6b基因序列(GenBank登錄號(hào):MW752194-MW752200), 其編碼序列在1803—2157 bp, 編碼的氨基酸在600—718, 等電點(diǎn)(pI)和相對(duì)分子質(zhì)量分別為4.82—6.86和65.38—78.14 kD(表2)。拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)(Danio rerio)基因組中,foxO1、foxO3和foxO6均有2個(gè)拷貝, 而在人類(lèi)(Homo sapiens)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、雞(Gallus gallus)和蜥蜴(Anolis carolinensis)中每個(gè)基因都只有1個(gè)拷貝(表3)。

表2 團(tuán)頭魴foxO家族基因的序列特征Tab. 2 Sequence characteristics of foxO genes in M. amblycephala

表3 脊椎動(dòng)物中foxO基因拷貝數(shù)的比較Tab. 3 Comparison of copy numbers of foxO genes among selected vertebrate species

氨基酸序列的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析將團(tuán)頭魴7個(gè)FoxO氨基酸序列與其他幾種脊椎動(dòng)物的同源蛋白序列比對(duì), 結(jié)果顯示, 團(tuán)頭魴7個(gè)FoxO氨基酸序列與斑馬魚(yú)的同源性最高, 相似性在77.98%—92.51%?；谧畲笏迫环?gòu)建不同物種的FoxO氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 結(jié)果顯示各物種FoxO蛋白可以分為兩大分支, 即FoxO1和FoxO4為一大分支, FoxO3和FoxO6為另一大分支。另外,不同物種間每個(gè)FoxO成員各自聚成一支, 且團(tuán)頭魴每個(gè)FoxO都與斑馬魚(yú)同源關(guān)系最近(圖1)。

圖1 FoxO家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of FoxO genes帶三角形的為團(tuán)頭魴FoxO蛋白, 每個(gè)蛋白后面附上GenBank序列號(hào), 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示bootstrapThe FoxO genes of M. amblycephala were shown in black triangles. Each gene is followed by the GenBank number, the value on the nodes represent the bootstrap

2.2 團(tuán)頭魴foxO基因的表達(dá)分析

foxO基因在不同組織中的表達(dá)為了探究foxO基因在團(tuán)頭魴成魚(yú)各組織中的表達(dá)情況, 本研究利用qPCR檢測(cè)了foxO基因在肝、腦、腸、鰓、心、脾、腎、肌肉和血液9個(gè)組織中的表達(dá)變化(圖2), 團(tuán)頭魴7個(gè)foxO基因在所檢測(cè)的9個(gè)組織中均有表達(dá), 但在不同組織中的表達(dá)差異明顯, 其中,foxO4在血液中表達(dá)量最高,foxO6a在肝臟中表達(dá)量最高, 而foxO6b在腦組織中表達(dá)量最高。

圖2 團(tuán)頭魴foxO在不同組織中的表達(dá)Fig. 2 Expression patterns of foxO genes in different tissues of M. amblycephala肝臟(L); 大腦(Br); 腸(I); 鰓(G); 心(H); 肌肉(M); 血液(Bl); 脾臟(S); 腎臟(K); 下同Liver (L); Brain (Br); Intestine (I); Gill (G); Heart (H); Muscle (M); Blood (Bl); Spleen (S); Kidney (K). The same applies below

foxO基因在不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)如圖 3所示,foxO1a和foxO1b的表達(dá)模式類(lèi)似, 即在早期發(fā)育過(guò)程中(48.4hpf除外)基因的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì), 直到94.4hpf(體節(jié)生成期)達(dá)到最大, 隨后表達(dá)量降低, 并在10 dpf(受精后天數(shù), Days post-fertilization)升高。另外, 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)foxO4、foxO6a和foxO6b的表達(dá)模式也比較類(lèi)似, 即在72.2hpf(眼色素沉淀晚期)、94.4hpf和10dpf表達(dá)量較高, 在其他時(shí)期的表達(dá)量都較低。foxO3a除在94.4hpf存在較高表達(dá)外, 在其他大部分時(shí)期的表達(dá)量都很低。foxO3b在發(fā)育早期的表達(dá)量逐漸升高, 直到15.4hpf(體節(jié)出現(xiàn)期)出現(xiàn)第一個(gè)峰值, 隨后逐漸下降, 但在72.2hpf表達(dá)量達(dá)到最高, 而后又呈逐漸降低的趨勢(shì)。整體來(lái)看,foxO基因在團(tuán)頭魴早期發(fā)育過(guò)程中雖然呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式, 但也存在一個(gè)共同的特點(diǎn), 即這幾個(gè)基因在72.2hpf、94.4hpf和10dpf都有相對(duì)較高的表達(dá)量。

圖3 團(tuán)頭魴foxO在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig. 3 Expression patterns of foxO genes at different developmental stages of M. amblycephala

低氧對(duì)foxO基因表達(dá)的影響為了進(jìn)一步分析低氧對(duì)團(tuán)頭魴7個(gè)foxO基因表達(dá)的影響, 本研究利用qPCR檢測(cè)了低氧處理后foxO在不同組織中的表達(dá)變化(圖4)。結(jié)果顯示低氧處理后, 7個(gè)foxO基因在各組織中的表達(dá)變化不同, 其中在肌肉、腸、鰓、腦及肝臟中呈顯著上調(diào)的趨勢(shì), 尤其是在肌肉組織中, 而在腎臟、心臟及血液中呈顯著下降的趨勢(shì)。

圖4 低氧處理后團(tuán)頭魴foxO基因在不同組織的表達(dá)變化Fig. 4 The relative expression of foxO genes in different tissues of M. amblycephala after hypoxia treatment“*”表示P<0.05, “**”表示P<0.01“*” represents P<0.05, “**” represents P<0.01

foxO基因的轉(zhuǎn)錄受Hif-1α調(diào)控為了進(jìn)一步探究團(tuán)頭魴7個(gè)foxO基因在低氧應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制, 本研究在基于JASPAR2022網(wǎng)站對(duì)foxO基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)7個(gè)foxO基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有多個(gè)Hif-1α結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了foxo1b啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明, Hif-1α過(guò)表達(dá)后, pGL3-foxo1b的熒光素活性顯著上調(diào), 說(shuō)明Hif-1α可能通過(guò)與foxO1b基因啟動(dòng)子結(jié)合影響其轉(zhuǎn)錄, 即foxO1b基因受到Hif-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖5B)。

圖5 foxO基因的轉(zhuǎn)錄受Hif-1α調(diào)控Fig. 5 The foxO gene transcription is regulated by Hif-1αA. foxO基因啟動(dòng)子中Hif-1α結(jié)合位點(diǎn); Hif-1α結(jié)合位點(diǎn)是ACGTG和GCGTG; B. Hif-1α過(guò)表達(dá)對(duì)foxO1b轉(zhuǎn)錄活性的影響; pCMVmyc作為對(duì)照A. Hif-1α binding sites of foxO gene promoters. Hif-1α binding sites are ACGTG and GCGTG; B. Effect of Hif-1α overexpression on foxO1b transcript activity. pCMV-myc is used as the control

3 討論

3.1 團(tuán)頭魴foxO基因家族的序列分析

本研究基于團(tuán)頭魴組學(xué)分析及PCR擴(kuò)增共鑒定出7個(gè)foxO基因, 包括2個(gè)foxO1(foxO1a和foxO1b)、2個(gè)foxO3(foxO3a和foxO3b)、2個(gè)foxO6(foxO6a和foxO6b)及foxO4, 這與斑馬魚(yú)foxO鑒定的結(jié)果一致[26—29]?？截悢?shù)分析發(fā)現(xiàn), 在團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)的基因組中,foxO1、foxO3和foxO6都存在兩個(gè)拷貝, 而在人類(lèi)、牛、小鼠、雞和蜥蜴基因組中都只有一個(gè)拷貝, 這可能是由于硬骨魚(yú)類(lèi)在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了一次特有的基因組加倍, 導(dǎo)致一個(gè)基因在魚(yú)類(lèi)中可能存在多個(gè)同源基因[30—32]。SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示, 團(tuán)頭魴7個(gè)FoxO蛋白都具有保守的Forkhead(FH)、FOXO_KIX_bdg和FOXO-TAD結(jié)構(gòu)域,這是FoxO蛋白家族特有的結(jié)構(gòu)域[27]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示FoxO家族的成員幾乎都被劃分為4個(gè)不同的進(jìn)化分支, 其中團(tuán)頭魴FoxO家族蛋白成員與魚(yú)類(lèi)的同源基因進(jìn)化關(guān)系最為緊密, 與其他哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物則相距較遠(yuǎn), 這符合傳統(tǒng)意義上的進(jìn)化關(guān)系。

3.2 團(tuán)頭魴foxO基因的時(shí)空表達(dá)分析

為了分析foxO在團(tuán)頭魴不同組織及胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化, 本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)了團(tuán)頭魴foxO家族基因的時(shí)空表達(dá), 結(jié)果顯示foxO1a/foxO1b在團(tuán)頭魴各個(gè)組織中均有表達(dá)。而草魚(yú)foxO1a/foxO1b在各組織中也均有表達(dá), 但在心臟中的表達(dá)量最低[33], 與本研究結(jié)果存在一定差異, 這可能是由于物種或個(gè)體大小等的差異所導(dǎo)致的。研究表明FoxO1敲除的小鼠會(huì)由于胚胎血管生成障礙死于胚胎早期[34]。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)在36和48hpf時(shí),foxO1a/1b在斑馬魚(yú)心臟中都持續(xù)表達(dá)[35]。團(tuán)頭魴foxO1a/1b在成魚(yú)心臟和血液中的高表達(dá), 在胚胎不同發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì), 說(shuō)明團(tuán)頭魴foxO1a/1b可能與心血管的形成有關(guān)。團(tuán)頭魴foxO3a/foxO3b在每個(gè)組織都能被檢測(cè)到, 這與該基因在斑馬魚(yú)不同組織中的表達(dá)譜相似[36]。在胚胎發(fā)育過(guò)程中團(tuán)頭魴foxO3a/foxO3b的表達(dá)主要集中在眼色素沉淀晚期(72.2hpf)和體節(jié)生成期(94.4hpf)?；赗T-PCR發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)foxO3a在8hpf后表達(dá)量持續(xù)偏低, 而foxO3b在14hpf后表達(dá)量持續(xù)增加, 并其都參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及分化[34—36]。而foxO3a/3b在團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)趨勢(shì)不同, 其功能也尚不確定。團(tuán)頭魴foxO6a主要表達(dá)在肝臟中,foxO6b主要在腦組織中表達(dá), 而哺乳動(dòng)物的FoxO6只在大腦和肝臟中表達(dá)[39], 說(shuō)明魚(yú)類(lèi)foxO6與哺乳動(dòng)物相比出現(xiàn)了功能分化。另外我們也發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過(guò)程中, 團(tuán)頭魴foxO6a和foxO6b基因在眼色素沉淀前的表達(dá)水平都比較低,而斑馬魚(yú)整胚原位雜交結(jié)果顯示,foxO6a和foxO6b基因在1hpf時(shí)均未表達(dá), 但在5hpf均能檢測(cè)到表達(dá),并逐漸增加, 在24—72hpf達(dá)最高[37], 說(shuō)明團(tuán)頭魴foxO6a和foxO6b基因在胚胎發(fā)育期間的功能和斑馬魚(yú)的類(lèi)似, 并可能存在協(xié)同作用。

3.3 低氧對(duì)團(tuán)頭魴 foxO基因家族表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)低氧脅迫后果蠅FoxO轉(zhuǎn)錄活性被迅速誘導(dǎo), 并且在低氧條件下foxO突變體的糖代謝紊亂, 個(gè)體存活率降低[40]。另外研究也證實(shí)低氧處理后FOXO3a作為HIF-1的下游靶點(diǎn)被激活[39]。斑馬魚(yú)中foxO3b的缺失, 可導(dǎo)致低氧耐受能力降低[41]。這些研究表明foxO可能參與低氧調(diào)控。為了研究低氧對(duì)魚(yú)類(lèi)foxO表達(dá)的影響, 本研究通過(guò)qPCR分析了低氧處理后團(tuán)頭魴不同組織中foxO的表達(dá)變化, 結(jié)果顯示7個(gè)foxO基因在許多組織尤其是肌肉中的表達(dá)量都顯著上調(diào)?；趩?dòng)子分析顯示團(tuán)頭魴這7個(gè)foxO基因啟動(dòng)子序列中都存在Hif-1α的結(jié)合位點(diǎn), 并且通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示Hif-1α對(duì)foxO1b有調(diào)控作用, 推測(cè)foxO基因可通過(guò)Hif-1α介導(dǎo)的途徑參與魚(yú)類(lèi)低氧調(diào)控。另有研究表明低氧脅迫會(huì)造成團(tuán)頭魴和鰱的心肌細(xì)胞凋亡, 從而導(dǎo)致魚(yú)體心臟損傷甚至死亡[42,43]。Sirtl可能通過(guò)抑制Foxo1 mRNA表達(dá), 延遲心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期, 減少細(xì)胞凋亡[44]。而黃顙魚(yú)在低氧脅迫中會(huì)造成氧化應(yīng)激損傷, 代謝模式由有氧呼吸至無(wú)氧呼吸轉(zhuǎn)變[45]。外源性胰島素能激活 AKT-FoxO1 磷酸化、上調(diào)FoxO1蛋白和轉(zhuǎn)錄水平, 進(jìn)而提高糖酵解和降低糖異生水平來(lái)維持大口黑鱸的糖代謝穩(wěn)態(tài)[46]。而FoxO的低表達(dá)可促使細(xì)胞發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和保護(hù)的作用[47—50]。本研究發(fā)現(xiàn)foxO基因在心臟和血液中主要呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(shì), 推測(cè)其基因表達(dá)減少可能有助于減少細(xì)胞凋亡, 調(diào)節(jié)糖代謝, 增加了機(jī)體的抗氧化能力和心臟的供應(yīng)能力。

本研究共鑒定出團(tuán)頭魴7個(gè)foxO基因, 包括2個(gè)foxO1、2個(gè)foxO3、1個(gè)foxO4和2個(gè)foxO6, 并顯示了特異的時(shí)空表達(dá)模式。另外本研究也發(fā)現(xiàn)低氧引起團(tuán)頭魴foxO基因在大部分組織中的上調(diào)表達(dá),受Hif-1α調(diào)控, 說(shuō)明foxO家族可能通過(guò)Hif-1α介導(dǎo)的途徑參與魚(yú)類(lèi)低氧應(yīng)激, 這為進(jìn)一步研究魚(yú)類(lèi)低氧的調(diào)控機(jī)制研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。