低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織的影響

程景顥 李 謠 沈銘浩 楊智茹 張偉健 張 凱 王 濤 張國(guó)松,2* 尹紹武*

(1. 南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心, 南京 210023;2. 菏澤學(xué)院, 山東省“十三五”高校生理生化及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 菏澤 274015)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)隸屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬, 廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江、黃河、松花江及珠江等水系[1], 因其肉質(zhì)細(xì)嫩、蛋白豐富和肌間刺少等優(yōu)點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者青睞。據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì), 2019和2020年黃顙魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量均超過5×108kg, 年均增幅為5.31%[2]。瓦氏黃顙魚(P. vachelli)俗稱江黃顙魚、硬角黃辣丁、郎絲, 與黃顙魚同為一屬, 具有生長(zhǎng)周期短、食性雜和適溫性廣等優(yōu)點(diǎn)[3]。本研究團(tuán)隊(duì)以二代選育的瓦氏黃顙魚為父本、三代選育的黃顙魚為母本, 獲得雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(GS-02-001-2018), 其生長(zhǎng)速度和成活率均高于母本黃顙魚, 且抗病力強(qiáng), 與父本瓦氏黃顙魚相比, 可食用部分多, 更耐運(yùn)輸[4], 受到廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛, 目前已成為我國(guó)重要的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖水產(chǎn)品種, 具有推動(dòng)黃顙魚產(chǎn)業(yè)升級(jí)的潛力[5]。

水體中的溶解氧是影響水生生物生存的一個(gè)重要生態(tài)因子[6], 低溶解氧對(duì)于魚類而言是一種常見的現(xiàn)象。魚類呼吸作用所吸收的一部分氧元素在生物體中轉(zhuǎn)化為活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),少量的ROS參與細(xì)胞信號(hào)通路, 調(diào)控不同的細(xì)胞活性和基因表達(dá), 而在低氧或恢復(fù)過程中ROS過量產(chǎn)生, 致使魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。如在雜交黃顙魚的低氧脅迫研究中, Pei等[8]發(fā)現(xiàn)肝臟組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)和氧化應(yīng)激參數(shù)(MDA)顯著上調(diào), 同樣在多種硬骨魚類如暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)[9]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[10]、葛氏鱸塘鱧(Perccottus glenii)[11]和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[12]等, 在低氧脅迫下均激活抗氧化系統(tǒng)抵抗過量產(chǎn)生的ROS和氧化應(yīng)激損傷。

盡管魚類可通過一些急性應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對(duì)水體短期缺氧, 以維持其正常生理活動(dòng), 但是水體的嚴(yán)重低氧往往引起魚類瞬間大量窒息死亡。研究表明, 魚類大腦和心肌細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的凋亡,是導(dǎo)致“泛塘”的主要原因之一[13]。 然而, 目前關(guān)于魚類低氧脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制研究仍處于初步階段。王鵬飛等[14]通過對(duì)鱖(Siniperca chuatsi)肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析, 發(fā)現(xiàn)該魚在低氧脅迫下bax和caspase8等促凋亡基因上調(diào); 在長(zhǎng)期低氧脅迫中, 鯉(Cyprinus carpio)[15]肝臟中bcl-2基因表達(dá)量顯著上調(diào); 丁晨雨等[16]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫可誘導(dǎo)鰱(Hypophthalmichthys molitrix)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

腸道是魚類消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所和器官,大量微生物寄居其中。微生物菌群可以調(diào)控上百個(gè)基因的表達(dá), 參與促使腸道細(xì)胞增殖、提高吸收能力和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等[17], 其組成變化與環(huán)境因子及宿主個(gè)體間關(guān)系密切, 當(dāng)環(huán)境應(yīng)激作用于魚類個(gè)體時(shí), 常常伴隨著腸道環(huán)境的改變, 影響微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu), 進(jìn)而影響宿主的健康[18]。已有研究報(bào)道,日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[19]、花鱸(Lateolabrax Maculatus)[20]和瓦氏黃顙魚[21]等水生動(dòng)物在低氧脅迫下腸道組織結(jié)構(gòu)受損, 腸道微生物多樣性顯著下降, 致病菌數(shù)量顯著增加。

目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚類腸道組織的環(huán)境脅迫研究逐漸重視, 而雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織在低氧脅迫下的研究未見報(bào)道。鑒于近年來全國(guó)各地養(yǎng)殖戶對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”的需求擴(kuò)大,了解其在低氧脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制有助于推動(dòng)黃顙魚產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展。本文以雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”為研究對(duì)象, 探討低氧脅迫對(duì)該魚腸道的氧化應(yīng)激、組織形態(tài)、細(xì)胞凋亡及腸道微生物組成的影響, 初步揭示低氧脅迫下雜交黃顙魚的腸道組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制, 有助于更好地了解雜交黃顙魚腸道的低氧響應(yīng)機(jī)制, 可為后續(xù)開展魚類耐低氧新品種選育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”取自江蘇省南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 飼養(yǎng)條件為: 水溫(27±1.0) ℃,pH 7.5—8.0, 以人工配合飼料投喂幼魚, 每天喂食兩次。挑選180尾無傷無病、體質(zhì)健壯的雜交黃顙魚(15.5±1.3) g隨機(jī)平均分配于6個(gè)玻璃缸中(30尾/缸, 100 L), 在水流量5 L/min, 溶解氧濃度(Dissolved Oxygen, DO)6.8 mg/L條件下馴養(yǎng)14d, 正式實(shí)驗(yàn)前禁食24h。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組(7.0±0.5) mg/L和低氧組(1.0±0.1) mg/L, 每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù), 實(shí)驗(yàn)過程中使用溶氧測(cè)定儀(LDO101, 上海鑫嵩公司)檢測(cè)水體中DO值。對(duì)照組: 玻璃缸水體中始終充入空氣將DO維持在(7.0±0.5) mg/L, 持續(xù)96h; 低氧組: 直接充入氮?dú)?5—30min使DO由(7.0±0.5)降至(1.0±0.1) mg/L,之后調(diào)節(jié)氮?dú)獬淙肓烤S持72h, 在低氧脅迫72h后停止充入氮?dú)? 并充入30min空氣使DO恢復(fù)至(7.0±0.5) mg/L, 維持24h[22]。在實(shí)驗(yàn)0、24h、48h、72h和恢復(fù)溶氧24h(記為H0、H24、H48、H72和R24),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和低氧組分別解剖12尾魚(每個(gè)缸隨機(jī)選取4尾魚)取中腸組織, 其中9尾魚用于獲取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本, 經(jīng)液氮處理后放置–80℃保存, 用于后續(xù)酶活、凋亡相關(guān)基因表達(dá)及腸道微生物的測(cè)定; 另外3尾魚的中腸保存于4%多聚甲醛固定液中, 備用于切片檢測(cè)。

1.3 腸道酶活性檢測(cè)

稱取0.1 g腸組織放入1.5 mL離心管中, 離心管置于冰盒中, 按照重量(g)﹕體積(mL)=1﹕9的比例加入0.9 mL的生理鹽水, 冰水浴條件下進(jìn)行機(jī)械勻漿,將所得到的組織勻漿液分裝保存于–20℃冰箱。腸組織的蛋白濃度(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性, 丙二醛(MDA)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)的含量測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行操作。

1.4 腸道組織蘇木精-伊紅(HE)染色切片

用4%多聚甲醛對(duì)腸組織進(jìn)行固定, 以防止細(xì)胞死亡后的自融或分解, 固定成功后進(jìn)行流水沖洗,隨后使用不同濃度的酒精(75%、85%和95%)進(jìn)行脫水處理, 再將組織放置在石蠟的透明劑二甲苯中透明, 將組織放入融蠟箱中保溫, 待石蠟完全浸沒組織塊進(jìn)行包埋處理。接著對(duì)石蠟切片脫蠟水化,并進(jìn)行蘇木素和伊紅染色。最后脫水封片, 并將切片置于顯微鏡下觀察。

1.5 腸道組織TUNEL切片檢測(cè)

將保存在4%多聚甲醛溶液中的腸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片, 石蠟切片脫蠟至水: 依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-酒精Ⅰ5min-酒精Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。切片稍甩干后滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織, 37℃溫箱孵育20min。將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次, 每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液, 顯微鏡下控制顯色時(shí)間。細(xì)胞核經(jīng)蘇木素著色變藍(lán),DAB顯出來的陽性凋亡細(xì)胞核為棕黃色。

1.6 腸道組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的時(shí)序表達(dá)分析

采用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因(bax、bcl-2、p53和caspase 9)mRNA的表達(dá)情況。首先從課題組測(cè)得的轉(zhuǎn)錄組序列中獲取相關(guān)基因序列, 使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性上下游引物, 如表 1所示, 其中β-actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為正、反向引物各1 μL,Mix 10 μL, ddH2O 4 μL, 模板cDNA 4 μL, 總體積為20 μL。使用2–ΔΔCt公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物列表Tab. 1 Description of primers used in this study

1.7 腸道微生物分析

對(duì)照組和低氧組的腸道組織在取材完畢后置于–80℃冰箱中保存, 送至武漢菲沙基因公司進(jìn)行測(cè)序。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫。通過質(zhì)量初篩的原始序列按照Index和Barcode信息, 進(jìn)行文庫和樣本劃分, 去噪或OTU(Operational Taxonomic Units)聚類。根據(jù)ASV/OTU在不同樣本中的分布, 評(píng)估每個(gè)樣本的物種豐度、Alpha多樣性水平。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果, 預(yù)測(cè)各樣本的菌群代謝功能, 找出差異通路, 并獲得特定通路的物種組成。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用One-way analysis進(jìn)行方差檢驗(yàn), 分析同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和低氧組表達(dá)模式的數(shù)據(jù)采用t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異, 當(dāng)P-value<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著(標(biāo)為*),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道氧化應(yīng)激的影響

雜交黃顙魚在低氧脅迫和恢復(fù)下腸道組織中的4種酶活性和MDA、LPO變化見圖 1。SOD和LDH酶活性在低氧脅迫下顯著升高, 在H72達(dá)到最大, 恢復(fù)溶氧24h后仍與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05); CAT和GSH-Px酶活在H24出現(xiàn)顯著差異(P<0.05), 恢復(fù)溶氧過程中酶活性下降, 在R24與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05); 在低氧脅迫下MDA和LPO較對(duì)照組均顯著上升(P<0.05), 并在H72達(dá)到峰值, 恢復(fù)氧含量后逐漸下降, R24仍與對(duì)照組有顯差(P<0.05)。

圖1 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道氧化應(yīng)激指標(biāo)變化Fig. 1 Effects of index activities related to oxidative stress in the intestine of hybrid yellow catfish “Huangyou-1”

2.2 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖 2所示, H0中雜交黃顙魚的腸道組織具有正常的形態(tài)結(jié)構(gòu), 單層柱狀上皮細(xì)胞排列有序, 固有層緊密纖長(zhǎng), 杯狀細(xì)胞飽滿。脅迫開始后低氧組出現(xiàn)不同程度的損傷, H24杯狀細(xì)胞腫脹, H48腸黏膜出現(xiàn)壞死并有空泡結(jié)構(gòu), H72腸道組織空泡數(shù)量增多, 絨毛侵蝕情況進(jìn)一步加劇, 恢復(fù)溶氧24h后,低氧引起的腸道組織生理變化并未得到改善, 腸絨毛出現(xiàn)糜爛。

圖2 低氧脅迫和恢復(fù)下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織形態(tài)Fig. 2 Intestinal tissue morphology of of hybrid yellow catfish“Huangyou-1” under acute hypoxia and reoxygenation conditionsa. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24; C. 柱狀細(xì)胞; G. 杯狀細(xì)胞;SG. 杯狀細(xì)胞腫脹; V. 空泡; N. 黏膜層壞死; E. 腸絨毛糜爛a. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24; C. columnar cells; G. goblet cells; SG. swelling of goblet cells; V. vacuoles in the lamina propria;N. necrosis in the mucosal layer; E. erosion of villi

2.3 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道細(xì)胞凋亡的影響

腸道組織TUNEL檢測(cè)結(jié)果TUNEL切片的檢測(cè)結(jié)果顯示, 低氧脅迫開始時(shí)雜交黃顙魚腸道組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較少, 而在低氧組中均檢測(cè)到不同程度的細(xì)胞凋亡(圖3)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示(表2),低氧可顯著促進(jìn)腸道組織發(fā)生凋亡, 隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng), 各處理組之間的凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05);R24的細(xì)胞凋亡指數(shù)與H48無顯著差異(P>0.05)。

表2 腸道組織凋亡指數(shù)Tab. 2 Apoptosis index of intestinal tissue

圖3 腸道組織Tunel切片檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Results of intestinal Tunel detectiona. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R2；黑色箭頭代表凋亡細(xì)胞a. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24. Black arrows mean apoptotic cells

低氧脅迫和恢復(fù)下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”bax、bcl-2、caspase9和p53基因的時(shí)序表達(dá)分析在低氧脅迫下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道中bax和p53基因的表達(dá)量顯著升高, 在H72達(dá)到峰值, 恢復(fù)溶氧后表達(dá)量下降。bcl-2基因的表達(dá)量在低氧脅迫下不斷降低, 恢復(fù)溶氧后表達(dá)量上升, R24仍與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。caspase9基因的表達(dá)量在低氧脅迫下顯著升高, 恢復(fù)溶氧后表達(dá)量降低,R24仍與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05; 圖 4)。

圖4 低氧脅迫和恢復(fù)下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”的腸道組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)模式Fig. 4 Temporal expression of apoptosis-related genes in the intestinal of hybrid yellow catfish “Huangyou-1” under acute hypoxia and reoxygenation conditions

2.4 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道微生物的影響

腸道微生物組間差異分析通過序列比對(duì)和注釋, 選取每個(gè)處理組在門(Phylum)水平上占比較大的物種, 生成相對(duì)豐度柱形圖(圖5), 以便直觀查看各處理組在門水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例。雜交黃顙魚腸道菌群相對(duì)豐度較大的主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁桿菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。H72中變形菌門豐度較對(duì)照組明顯下降(由32.53%下降到8.89%), 厚壁菌門和擬桿菌門則明顯增多(由19.56%增加到42.38%, 由11.25%增加到32.58%)。且在H72的處理組中, 除擬桿菌門外, 厚壁菌門占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)?；謴?fù)溶氧后腸道菌群數(shù)量進(jìn)一步豐富和增加, 這也表明低氧脅迫對(duì)雜交黃顙魚腸道微生物的組成具有重要影響。

圖5 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”門水平上腸道微生物菌群組成Fig. 5 Composition of intestinal microbial at phylum level of hybrid yellow catfish “Huangyou-1”

對(duì)各處理組的腸道微生物Alpha多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖6), 以Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度, 以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性, 以Faith’s PD指數(shù)表征基于進(jìn)化的多樣性, 以Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度, 以Good’s coverage指數(shù)表征覆蓋度。由圖6可知, Chao1和Observed species指數(shù)隨著低氧脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低, R24 微生物菌群豐富度增加。Shannon指數(shù)在H48達(dá)到最低, R24指數(shù)有所增加, 同樣Simpson指數(shù)在R24較低氧組有所回升。Faith’s PD和Pielou’s evenness的指數(shù)均在H48達(dá)到最低。在低氧組中Good’s coverage指數(shù)較對(duì)照組均略微升高, 表明微生物的均勻度也進(jìn)一步增加。

圖6 Alpha多樣性指數(shù)的分組箱線圖Fig. 6 Block boxplot of Alpha diversity index

低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)腸道優(yōu)勢(shì)菌群變化的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明, 低氧脅迫影響了雜交黃顙魚腸道微生物菌群的變化, 具體體現(xiàn)在數(shù)量和種群豐富度上, 在屬水平上對(duì)優(yōu)勢(shì)群落的豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3)。由表 3可知, 低氧造成厭氧致病菌的大量繁殖, 具體表現(xiàn)在葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和霍亂弧菌(Vibrio cholera)等致病菌數(shù)量的增加, 乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等有益菌數(shù)量的減少。

表3 低氧脅迫下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織致病菌和益生菌的相對(duì)豐度Tab. 3 Relative abundance of pathogenic and probiotics bacteria in intestinal tissues of hybrid yellow catfish “Huangyou-1” under hypoxia stress (%)

腸道微生物功能預(yù)測(cè)基于腸道微生物測(cè)序結(jié)果對(duì)低氧脅迫下雜交黃顙魚的代謝通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和KEGG功能預(yù)測(cè)(圖7)。結(jié)果顯示, 腸道微生物在細(xì)胞進(jìn)程(Cellular processes)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、人類疾病(Human diseases)、代謝(Metabolism)和生物體系統(tǒng)(Organismal systems)六大類代謝通路中均有分布,與代謝通路相關(guān)的微生物占大多數(shù), 與疾病相關(guān)的也占有一定比例。

圖7 腸道微生物的KEGG功能預(yù)測(cè)圖Fig. 7 KEGG function prediction of intestinal microbial

3 討論

3.1 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道氧化應(yīng)激的影響

在魚類受到脅迫后, 體內(nèi)ROS含量會(huì)發(fā)生變化,尤其低氧脅迫導(dǎo)致的機(jī)體補(bǔ)償代謝加劇了氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。據(jù)報(bào)道, 當(dāng)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生速率快于氧自由基的清除速率時(shí), 生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)便會(huì)被激活[24], 如鯉[25]和青田田魚(Cyprinus carpio var qingtianensis)[26]的大腦和肝臟暴露在急性低氧下, LDH、SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著增加; 團(tuán)頭魴幼體[27]在低氧脅迫過程中血清中

LDH和肝臟中GSH-Px、MDA含量均顯著增加。在本研究中發(fā)現(xiàn), 雜交黃顙魚在低氧脅迫下腸道組織的SOD、CAT和GSH-Px活性水平較對(duì)照組均顯著上升, 表明低氧脅迫使得雜交黃顙魚腸道內(nèi)抗氧化防御功能被激活, 以應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生過量ROS引起的氧化損傷, 這與花鱸[28]的低氧脅迫研究結(jié)果一致。與對(duì)照組相比, LDH在低氧脅迫下顯著升高,表明雜交黃顙魚腸道中有氧利用得到限制導(dǎo)致ATP產(chǎn)生不足, 需通過無氧呼吸來彌補(bǔ)氧氣不足所帶來的機(jī)體能量供應(yīng)緊缺, 這與李欣茹[9]對(duì)暗紋東方鲀?cè)诘脱趺{迫下肝臟中LDH活力的研究結(jié)果相似。MDA和LPO被認(rèn)為是反映生物體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物[29], 兩者含量的變化能夠反映出機(jī)體和細(xì)胞的損傷程度。在本研究中發(fā)現(xiàn)MDA和LPO的含量在低氧脅迫下不斷升高, 表明雜交黃顙魚體內(nèi)的抗氧化物酶可能難以迅速清除大量脂質(zhì)過氧化物, 從而導(dǎo)致二者含量迅速增加, 類似結(jié)果在鯔幼魚(Mugil cephalus)[30]也有報(bào)道。

Lushchak等[31]認(rèn)為魚類在低氧條件下可提高自身抗氧化能力, 從而為應(yīng)對(duì)復(fù)氧后的再次氧化應(yīng)激做準(zhǔn)備, 在本研究中可以發(fā)現(xiàn)雜交黃顙魚的抗氧化防御系統(tǒng)在低氧24h就已全部啟動(dòng), 這也進(jìn)一步印證了上述觀點(diǎn)。在恢復(fù)溶氧過程中抗氧化酶(SOD)、能量代謝酶(LDH)活性和氧化應(yīng)激參數(shù)(MDA、LPO)含量略有下降, 但是較對(duì)照組仍有顯差, 表明氧化應(yīng)激在氧氣恢復(fù)過程中也同樣存在, 這可能是由于氧濃度的恢復(fù)使細(xì)胞進(jìn)行大量有氧呼吸產(chǎn)生過量ROS導(dǎo)致; 值得注意的是, CAT和GSH-Px的活性在恢復(fù)溶氧24h后與對(duì)照組并無顯著差異, 這可能是因?yàn)轸~體內(nèi)的超氧自由基經(jīng)SOD先還原為過氧化氫, GSH-Px與CAT之間存在代償互補(bǔ)效應(yīng), 可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化成水, 彼此之間削弱活性[32]。上述研究結(jié)果證實(shí)了低氧和恢復(fù)均會(huì)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”造成氧化損傷, 而抗氧化防御系統(tǒng)的激活可以保護(hù)細(xì)胞并減少氧化應(yīng)激對(duì)魚體帶來的損傷。

3.2 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道細(xì)胞凋亡和組織結(jié)構(gòu)的影響

研究表明, 魚類在低氧下不僅會(huì)產(chǎn)生過量的ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng), 還會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[33], 本研究采用TUNEL染色法對(duì)雜交黃顙魚腸道組織進(jìn)行觀察, 結(jié)果顯示, 低氧脅迫加重了腸組織細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象, 且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng), 凋亡細(xì)胞數(shù)目也在增加, 與團(tuán)頭魴[10]和鰱[16]的心肌細(xì)胞在低氧脅迫下的研究結(jié)果相似。

低氧脅迫下雜交黃顙魚腸道中caspase9基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加, 推測(cè)可能是細(xì)胞色素C通過凋亡小體來激活下游的Caspase家族,caspase9的激活使胞膜內(nèi)陷, 通過促使胞內(nèi)蛋白降解,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[34]。p53是一種腫瘤抑制基因,在本研究中p53的表達(dá)量在低氧脅迫下不斷增加,并在H72達(dá)到最高, 表明p53在低氧條件下對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)具有一定的促進(jìn)作用。有研究認(rèn)為,bcl-2和bax是魚類細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用的兩個(gè)基因, 二者的比值在一定程度上決定了細(xì)胞的發(fā)展方向[35]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn), 雜交黃顙魚腸道中bax和bcl-2的表達(dá)量隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)分別上升和下降,bcl-2/bax的值逐漸減小, 顯著促進(jìn)了腸道細(xì)胞的凋亡?；謴?fù)溶氧后bax的表達(dá)量減少, 而bcl-2的表達(dá)量增加, 這可能是由于在細(xì)胞中形成了穩(wěn)定的bcl-2/bax異源二聚體, “中和”了bax/bax同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[36]。此外, 恢復(fù)溶氧24h后bax、bcl-2和caspase9的表達(dá)量與對(duì)照組仍有顯著差異, 這可能是因?yàn)榛謴?fù)過程中氧氣的重新導(dǎo)入會(huì)使得魚體產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象, 而這種氧化應(yīng)激程度過強(qiáng)時(shí), 機(jī)體同樣會(huì)自發(fā)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。

研究報(bào)道, 高溫[37]、攝食[38]和細(xì)菌感染[39]等常常引起魚類腸上皮組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生功能性變化, 在本研究中我們通過HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn), 低氧脅迫下雜交黃顙魚腸道組織中的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少、空泡數(shù)量增多, 且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng),腸絨毛排列雜亂, 出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象, 在恢復(fù)溶氧后, 低氧引起的腸道組織生理變化并未得到改善; 表明低氧亦可改變雜交黃顙魚腸道正常的組織形態(tài), 此結(jié)果與大口黑鱸(Micropterus salmoides)[40]和日本沼蝦[41]的低氧脅迫研究結(jié)果一致。

3.3 低氧脅迫和恢復(fù)對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道微生物的影響

腸道是魚類體內(nèi)重要的消化吸收器官, 生存著結(jié)構(gòu)復(fù)雜且數(shù)量龐大的微生物菌群, 這些微生物菌群不僅與其營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫防御和能量傳遞有著密切聯(lián)系, 還在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用, 它們與宿主的健康生長(zhǎng)息息相關(guān)[42]。有研究認(rèn)為, 放線菌的豐度代表著腸道的健康狀況, 放線菌豐度越高說明腸道健康狀況越好[43], 在H72的處理組中放線菌的數(shù)量顯著低于對(duì)照組, 并且通過HE切片也可觀察出H72中的腸道組織受損嚴(yán)重, 這也進(jìn)一步印證了上述觀點(diǎn)。腸道微生物豐度柱形圖顯示雜交黃顙魚腸道核心菌群是變形菌門, 此結(jié)論印證了Harris[44]提出的水生動(dòng)物存在固有的腸道微生物群落的觀點(diǎn)。此外, 在門水平上腸道菌群組成差異較大, 說明低氧影響了雜交黃顙魚腸道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)。通過Alpha多樣性分組箱線圖, 我們發(fā)現(xiàn)在低氧脅迫過程中, 雜交黃顙魚腸道中的Shannon和Simpson指數(shù)較對(duì)照組下降, 也說明了其微生物豐富度隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

水生動(dòng)物在不同的水體環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 進(jìn)而使腸道內(nèi)環(huán)境平衡受到?jīng)_擊, 宿主的正常防御系統(tǒng)被破壞, 致病菌會(huì)轉(zhuǎn)移、定植甚至侵襲魚體組織器官[45]。Suo等[46]對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)研究發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期暴露在亞致死濃度的硫化物水體中, 腸道組織結(jié)構(gòu)受損, 梭桿菌數(shù)量顯著增多。Kan等[47]發(fā)現(xiàn)五氯苯酚脅迫使得金魚(Carassius auratus)腸道內(nèi)大量積累這種物質(zhì), 導(dǎo)致其腸道內(nèi)菌群數(shù)量發(fā)生改變。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)一些厭氧菌得到大量繁殖, 其中不乏有致病菌(葡萄球菌、鏈球菌)的侵入及益生菌群(乳酸菌、雙歧桿菌)數(shù)量的降低, 這與日本沼蝦[19]和瓦氏黃顙魚[21]的研究結(jié)果一致。通過繪制低氧脅迫下樣本的KEGG功能預(yù)測(cè)圖, 發(fā)現(xiàn)腸道微生物主營(yíng)代謝功能, 但是在細(xì)胞進(jìn)程和生物體系統(tǒng)等方面同樣發(fā)揮著獨(dú)特的功能, 值得注意的是, 在本次功能預(yù)測(cè)中, 與疾病相關(guān)的微生物也占有一定比例,說明低氧脅迫下雜交黃顙魚的免疫防御系統(tǒng)會(huì)遭到損害, 從側(cè)面揭示了低氧、腸道微生物和宿主免疫之間的復(fù)雜關(guān)系。

4 結(jié)論

綜上所述, 低氧和恢復(fù)會(huì)誘導(dǎo)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)、能量相關(guān)酶(LDH)活性和應(yīng)激指標(biāo)(MDA和LPO)含量顯著升高, 凋亡指數(shù)及凋亡相關(guān)基因(bax、p53和caspase9)表達(dá)量顯著升高,bcl-2基因的表達(dá)量則減少, 表明隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng), 雜交黃顙魚的腸道氧化應(yīng)激損傷逐漸加大, 恢復(fù)溶氧后這種現(xiàn)象仍然存在, 這可能是腸道產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的誘因之一。此外, 隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng), 黏膜層壞死、空泡和絨毛侵蝕等腸道組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象逐漸加劇, 葡萄球菌和鏈球菌等厭氧菌數(shù)量增多, 使腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞, 進(jìn)而影響腸道功能。本研究結(jié)果為闡明低氧和恢復(fù)下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”腸道組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。