大腸菌群主要檢測方法研究進展

韋巧革

（融水苗族自治縣疾病預防控制中心，廣西柳州，545300)

微生物學檢測結(jié)果是判斷食品是否符合質(zhì)量要求與衛(wèi)生學要求一項重要標準，食品微生物學檢測指標包含三項，即大腸菌群檢測、致病菌檢測、細菌總數(shù)檢測等[1]。目前國內(nèi)外均以大腸菌群作為食品、水體污染常用指示菌，評價與判斷食品被糞便污染程度和有無腸道致病菌污染可能[2]。大腸菌群是一種處于37℃、24h 能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性的革蘭陰性無芽孢桿菌統(tǒng)稱，該細菌多存在于溫血動物糞便便中，人、畜糞便對外界環(huán)境污染是大腸菌群在自然界主要原因，對此，大腸菌群被國際公認為檢測各種水質(zhì)、食品、醫(yī)藥在流行病學上安全性指示菌[3]。若所檢測結(jié)果為陽性，則表示藥品、食品、水質(zhì)中存在該菌群，并被糞便污染。研究表明[4]，大腸菌群數(shù)量和受到污染程度呈正比，數(shù)量越多，受污染越為嚴重。我國目前主要以多管發(fā)酵法檢測大腸菌群，其是一種傳統(tǒng)檢測方式，準確性、權威性無可置疑，但因費時費力和檢測費用高現(xiàn)無法滿足人們對藥品、食品等監(jiān)測。對此，對于藥品、食品監(jiān)督急需一種快速、有效的大腸菌群檢測方式[5-6]。近些年來，世界各地針對大腸菌群檢測具有專門研究，文章現(xiàn)結(jié)合大量研究綜述大腸菌群快速檢測技術的進展，對其應用前景展開分析。

1 傳統(tǒng)檢測方式改進技術

1.1 試劑盒法主要依據(jù)水質(zhì)、國家食品標準檢測方式多管發(fā)酵方法研制而成。主要原理是將液體乳糖培養(yǎng)基經(jīng)過固化加工后置于特制透明塑料盒中，組成試劑盒，該檢測方式具有操作簡單快速、結(jié)果判定清晰準確、成本低廉以及便于攜帶和保存等優(yōu)勢。趙娣偉[7]研究中針對生活飲水中大腸菌群利用試劑盒法檢測，結(jié)果顯示，其靈敏度在100%，特異度是98.18%，正確指數(shù)為98.18%?？梢娛且环N科學、實用、可靠的檢測方式，適于水質(zhì)、食品大腸菌群的檢測。

1.2 快速測試片法該檢測原理是將適量乳糖、指示劑溴甲酚紫及革蘭氏陽性菌抑菌劑吸附在一定面積無菌濾紙上，大腸菌群生長發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使PH 值降低，溴甲酚紫指示劑從紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在紙片上呈黃色反應，并且在菌體中含有脫氫酶還原TTC 形成紅色不容性紅四氮唑，從而有效顯示出紅色斑點，若能滿足以上兩種特性作為陽性結(jié)果判定標準[8]。樸相哲[9]研究中對比快速測試片法和GB 法檢測在生鮮豬肉中大腸菌群結(jié)果，結(jié)果表示前者更利于在生鮮豬肉中對大腸菌群計數(shù)的統(tǒng)計，且有效縮短了其檢測流程。

2 分子生物學技術

2.1 聚合酶鏈式反應法（PCR）PCR 以它的微量、重復性好、快捷等特點在醫(yī)學領域中得到廣泛使用。主要是利用耐熱DNA聚合酶作用，通過變性、延伸、復性循環(huán)操作在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種克隆技術[10]。雖其存在較高敏感性和特異性，但因食物組分中存在多種酶抑制劑，從而影響到PCR法檢出率，且PCR 法無法區(qū)分活菌和死菌，故較難對大腸菌群定量分析。

2.2 基因芯片技術基因芯片技術是近些年出現(xiàn)的一種新型技術，具有較強交叉性，為目前當今研究熱點，是將已經(jīng)設計的基因片段或寡核肝酸依據(jù)一定循序緊密排列在芯片上，熒光標記分子經(jīng)PCR 擴增方式進入到微生物樣品DNA，且和芯片上寡核苷酸點雜交，最后經(jīng)熒光波長掃描儀利用計算機軟件分析得到樣品含量。祝儒剛[11]學者使用基因芯片技術對大腸埃希氏菌進行檢測，靈敏度達2pg，并表示所制備的基因芯片檢測實際肉及肉制品樣品準確率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，能夠作為食源性致病菌檢測理想手段。賀晨[12]將該技術和PCR 技術聯(lián)合應用，多種PCR 擴增，制備芯片，將擴增產(chǎn)物和含有探針基因芯片雜交，結(jié)果表明其對大腸桿菌特異性檢測靈敏度達2x10-3ng。因該技術存在靈敏度高、快捷、操作方便等特點逐漸成為熱門研究領域。

1.3 原位雜交法（ISH）主要原理是人工合成大腸菌群DNA 或RNA 序列互補的探針，隨后和大腸菌群行原位雜交，進而檢出相對應大腸菌群，該方式目前用于含大腸菌群濃度低的飲用水檢驗，最多用熒光標記探針來進行熒光原位雜交。有關研究表示[13]，原位雜交技術具備簡便、操作快速、安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢，且可進行定量分析，但其操作步驟繁瑣，技術繁雜從而難以規(guī)?；茝V。王建龍[14]研究中通過熒光標記探針取代同位素探針熒光原位雜交技術（FISH），并表示FISH 技術可以用于飲用水中大腸菌群的檢測，且在較短時間內(nèi)（6～8h）給出定量分析。

3 免疫學技術

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELIsA)酶聯(lián)免疫吸附法是1971年ENCVEIL 等建立在免疫酶基礎上的一種新型免疫測定技術，是目前較為常用的一種檢測手段。并有研究表示[15]其具有快速、簡便等優(yōu)點，但抗原和抗體濃度與反應液以及抗體特異性可產(chǎn)生影響。若污染物較嚴重且進行檢測，ELISA 法存在嚴重缺陷，因其受到其他存在細菌影響而降低方法特異性。主要原理是利用酶標記抗體或酶標記抗原進行抗原抗體反應，酶和底物產(chǎn)生深淺不一顏色反應[16]。測定時酶標記在抗體分子上形成酶標抗體，在大腸菌群和酶標反應形成復合物之后，底物被酶催化，進而生成有色產(chǎn)物，其中，產(chǎn)物的量和樣本待檢驗質(zhì)的含量存在直接關系，故依據(jù)呈色深淺進行定量分析，其適于所有食品大腸菌群的檢測[17]。

3.2 免疫磁珠技術（IMB）免疫磁珠技術以磁珠作為抗體載體，通過抗體抗原結(jié)合磁力作用下發(fā)生力學移動，進而達到分離特異性抗原目的。國外一學者使用改法從患者糞便中分離出多注山梨醇陽性O157:H7 大腸桿菌，表示該方式敏感度高，特異性好，且操作復雜，但不具備廣泛使用能力。

4 小結(jié)

以往針對大腸菌群檢測方式實驗量大，步驟雜，且費時費力，以及靈敏度差等缺點，而近些年發(fā)展的大腸菌群快速檢測方式包含PCR 法、酶聯(lián)免疫吸附法等，有效解決了上述問題，但檢測特異性、敏感性及操作上存在多種問題，故還未有一種真正達到成本低、靈敏度好、準確性高等檢測方式，故仍需不斷科學研究，尋找一種適宜的方式。