數(shù)字全息成像定量監(jiān)測癌細胞凋亡過程形態(tài)變化（特邀）

辛露，肖文，劉雅坤，張煥芝，李小平，潘鋒

（1 北京航空航天大學儀器科學與光電工程學院，北京 100191）

（2 北京大學人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100044）

0 引言

程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD）可由不同分子途徑的激活引起［1］，不同的細胞死亡過程具有不同的形態(tài)和生化特征。細胞凋亡是一種基因調(diào)控的程序性細胞死亡，通過消除生理冗余、物理損傷和異常細胞來控制多細胞生物和組織的發(fā)育［2］。放療和化療對于癌癥患者術(shù)前和術(shù)后的治療是必不可少的?；熕幬镏饕ㄟ^促進癌細胞凋亡來破壞癌細胞并抑制其增殖?？拱┧幬锏墓π峭ㄟ^它們識別癌細胞和選擇性地促進其凋亡的能力來衡量的?？拱┧幬锩舾行詼y試（Drug Sensitivity Test，DST）是一種根據(jù)敏感性確定治療腫瘤最有效藥物的方法。腫瘤的基因型和發(fā)病機制各不相同，腫瘤可能對一種或多種藥物產(chǎn)生耐藥性，或?qū)Χ喾N藥物表現(xiàn)出敏感性［3］。因此，檢測DST 中藥物誘導的癌細胞凋亡，對于降低耐藥性和提高藥敏試驗的效率，實現(xiàn)更有效的個性化治療具有重要意義［4］。目前檢測細胞凋亡的方法主要通過檢測與細胞凋亡相關(guān)的細胞形態(tài)和表面標志物的變化。

在整個有機體中，細胞凋亡會導致細胞的受控分解，從而避免任何細胞內(nèi)介質(zhì)的釋放，但在體外，細胞凋亡會進入繼發(fā)性壞死的終末期，導致細胞膜完整性的喪失以及隨后細胞內(nèi)容物釋放到周圍細胞外空間［5-6］。流式細胞術(shù)、膜蛋白［7］、TUNEL 分析［8］等方法對細胞凋亡判別的特異性較差。而細胞凋亡過程會表現(xiàn)出典型的、明確的形態(tài)學變化，包括質(zhì)膜起泡、染色質(zhì)濃縮以及核斷裂和凋亡小體的形成等［9-10］形態(tài)學標準被認為是細胞凋亡的最可靠依據(jù)［11］。

數(shù)字全息顯微（Digital Holographic Microscopy，DHM）是一種干涉成像技術(shù)，可以無創(chuàng)地提供與細胞固有特性相關(guān)的豐富的細胞內(nèi)信息。它可以根據(jù)折射率（Refractive Index，RI）對比度識別無標記細胞，而無需對細胞進行熒光標記［12］，因此在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應用，如細胞計數(shù)［13］、疾病診斷［14-15］、癌細胞分離［16-17］、治療評估［18］。細胞的RI 是一個固有的光學參數(shù)，它描述了光穿過細胞產(chǎn)生的光程差，與細胞的生物物理特性相關(guān)。此外，DHM 能夠提供定量地相位信息，這使得它與大多數(shù)僅能收集光強度的傳感器有很大不同。而定量相位圖像除了能夠提供有關(guān)形態(tài)學的信息外，還能夠計算整個細胞內(nèi)的干重（Dry Mass，DM）［19-21］。因此數(shù)字全息顯微成像技術(shù)被用來對細胞生長過程及生理活動進行動態(tài)監(jiān)測，如細胞分裂［22］、細胞遷移［23］、細胞在外界刺激下的形態(tài)變化［24-27］等。

本文采用數(shù)字全息顯微成像方法對化療藥物誘導的癌細胞凋亡過程中的形態(tài)變化進行記錄與分析。實驗過程中，通過對卵巢癌細胞A2780 加入臨床治療中常用的化療藥物順鉑誘導癌細胞凋亡，利用數(shù)值方法再現(xiàn)出癌細胞完整的凋亡過程及細胞膜破裂的定量相位圖像，進而從中提取細胞形態(tài)參數(shù)相位均值及細胞干重對癌細胞凋亡過程中的形態(tài)變化進行表征。結(jié)果表明，生長狀態(tài)的癌細胞與凋亡期及死亡細胞的相位圖像及其形態(tài)參數(shù)上有極為明顯的差異。因此，本文方法能夠在無需熒光標記的情況下對癌細胞的凋亡細胞和死細胞進行區(qū)分，為個體化治療中的體外藥敏試驗確定和選擇最有效的化療藥物，并確定其有效劑量提供一種更加經(jīng)濟、方便的檢測方法。

1 材料及方法

1.1 細胞培養(yǎng)

本文研究的細胞系為上皮性卵巢癌細胞A2780 細胞。細胞培養(yǎng)過程中，A2780 細胞生長在1640（RPMI Medium 1640 basic 1X，GIBCO，中國）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加l-谷氨酰胺、15 mmol/L HEPES 和10%胎牛血清（GIBCO 10099-141，澳大利亞）。培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2，溫度為37℃。將癌細胞接種于35 mm的Willco 玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，將化療藥物順鉑（Sigma-Aldrich，Steinheim，德國）加入培養(yǎng)基中，最終培養(yǎng)基中順鉑藥物濃度為20 μg/mL。加入藥物之后，立即將細胞培養(yǎng)皿置于觀測平臺上進行細胞成像。

1.2 數(shù)字全息顯微圖像記錄

采用離軸式數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)對細胞進行成像［28］，光路結(jié)構(gòu)及光路示意如圖1，該系統(tǒng)單次相機曝光即可實現(xiàn)復雜的物體波前重建。系統(tǒng)光源選用相干激光器（532 nm，100 mW），通過單模光纖輸出。光束從激光器發(fā)出后，由準直透鏡（L）產(chǎn)生平面光波，然后激光束經(jīng)由偏振分光棱鏡（Polarization Beam Splitter，PBS）分為兩路，即物光路和參考光路。PBS 前面的半波片（Half Wave Plate，HWP1）用于調(diào)整兩個光束之間的強度比。參考光路中的另一個半波片（HPW2），使參考光波的偏振方向與物光波一致。物光波經(jīng)由反射鏡M2 反射后，通過會聚透鏡（Converge Lens，CL）后透射穿過待測樣品，然后，由顯微物鏡（Microscopic Objective ，MO）和套筒透鏡（Tube Lens，TL）構(gòu)成的顯微成像部件對待測樣品放大成像，并通過分光棱鏡（Beam Splitter，BS）與參考光波在CCD 相機成像面發(fā)生干涉，產(chǎn)生細胞干涉圖，并由CCD 相機記錄。發(fā)生干涉時，在顯微鏡MO 固定的情況下，調(diào)節(jié)待測物體的高度使其位于MO 的焦點，由于CL 與MO 組成共焦系統(tǒng)，因此調(diào)節(jié)CL 的位置使待測細胞同樣位于其焦面位置，然后調(diào)節(jié)透鏡TL 使其出射光為平面波。同時，參考光路中的反射鏡M4、M5 用于在多個方向上調(diào)節(jié)參考光與物光之間的夾角，使記錄的全息圖像的零級像、+1 級像和-1 級像相互分離，實現(xiàn)離軸全息成像。顯微物鏡MO 選用奧林巴斯20 倍平場半復消色差物鏡（Olympus UPLFLN 20），其數(shù)值孔徑為NA=0.50。記錄全息圖像采用的相機為加拿大由PointGrey 公司生產(chǎn)的由FlyCapture 軟件控制的相機，像素數(shù)為2 048×2 048，其單個像素尺寸為5.5 μm，因此成像系統(tǒng)的分辨率約為0.275 μm。在細胞成像過程中，細胞貼壁生長于細胞培養(yǎng)皿底部，培養(yǎng)皿中填滿細胞培養(yǎng)液保證細胞正常生長。從細胞培養(yǎng)液中加入藥物開始，相機每1 min 記錄一張全息圖像，共記錄9 h。

1.3 細胞形態(tài)參數(shù)計算

1.3.1 細胞相位圖像再現(xiàn)處理過程

全息干涉圖像由物光波和參考光波疊加形成，全息圖的再現(xiàn)過程是利用原參考光R(x，y)照射全息圖實現(xiàn)，在全息面得到的衍射光波包括了為零級衍射光、+1 級衍射光和-1 級衍射光。在離軸全息成像中，物光波和參考光波發(fā)生干涉時存在一定的夾角，再現(xiàn)得到的零級衍射項、+1 級衍射項和-1 級衍射項三部分也具備一定的夾角。由于離軸全息的三個衍射級次各自分離，因此單次曝光即可實現(xiàn)獨立獲取每個衍射項，更加適用于快速測量的需要。

對數(shù)字圖像形式記錄的細胞全息圖像，經(jīng)過數(shù)值衍射再現(xiàn)過程能夠得到反映細胞折射率信息的相位圖像。首先，在進行衍射再現(xiàn)之前，需要對全息圖像進行切趾［29］和空間濾波［30］。切趾操作是將全息圖像乘以一個二維三次樣條插值函數(shù)，去除由于CCD 的大小有限所產(chǎn)生的衍射條紋對波前的影響。由于離軸記錄的全息圖像的零級像、+1 級像和-1 級像相互分離，因此通過將全息圖的空間頻譜乘以一個帶通空間濾波器對全息圖像進行濾波即可得到單獨的衍射項。然后，采用角譜傳播算法對全息圖像進行數(shù)值傳播［31］，該方法的優(yōu)勢在于無論傳播距離如何，目標圖像的大小保持不變。為了消除由于顯微物鏡的使用、光學元件的缺陷以及實驗系統(tǒng)等因素產(chǎn)生的像差對計算細胞相位的影響，采用基于澤尼克多項式模型的數(shù)值參數(shù)透鏡（Numerical Parametric Lenses，NPL）的數(shù)值方法來補償像差［32-33］。此外，數(shù)字全息具備進行數(shù)值重聚焦的能力，通過對細胞區(qū)域計算出最佳的傳播距離［34］，來補償圖像記錄過程中產(chǎn)生的細胞離焦。最后，對細胞相位圖像進行解包裹，將約束在-π 和π 之間的相位值進行解構(gòu)［35］，即可得到數(shù)值連續(xù)的細胞相位圖像。

1.3.2 細胞相位及干重參數(shù)計算

為了計算單個細胞在死亡的過程中形態(tài)隨時間的變化，采用最大類間方差閾值分割方法將單個細胞從背景相位中分割出來。由全息記錄重建的細胞相位圖像實際上是由于細胞與培養(yǎng)液之間的折射率不同，照明光波在經(jīng)過不同區(qū)域時產(chǎn)生的相位差，即

式中，λ為照明光波的波長（532 nm），nc為細胞周圍培養(yǎng)液的折射率，nm和h分別為細胞在位置(x，y)處的折射率及厚度。因此，取細胞區(qū)域的像素相位均值Δφˉ來反映細胞整體的厚度和折射率信息。此外，細胞的相位圖像能夠用來計算細胞內(nèi)干物質(zhì)的質(zhì)量，即細胞的干重，其計算方法為

式中，Sc為細胞區(qū)域的面積。α是一個與細胞內(nèi)含量有關(guān)的常量，稱為特定折射增量［17］，約為0.18～0.21 mL/g，通常取α為0.2 mL/g。因此，細胞內(nèi)的干重與細胞相位均值和細胞區(qū)域的面積相關(guān)。

2 實驗結(jié)果

2.1 癌細胞死亡過程相位圖再現(xiàn)結(jié)果

實驗過程中，將培養(yǎng)皿中貼壁生長的癌細胞在加入藥物前置于數(shù)字全息顯微觀測平臺上采集一張全息圖像，并在加入藥物后每1 min 采集一張全息圖像，實驗過程進行9 h，共采集540 張全息圖。之后將采集到的全息圖進行數(shù)值重建，得到相位圖像，圖2（a）和（b）分別為加入藥物前及加入藥物9 h 后相位圖像。從相位圖像能夠很明顯看出，大部分細胞已經(jīng)破裂死亡，圖中箭頭所指向的是8 個已經(jīng)明顯破裂死亡的細胞，而其他沒有破裂的細胞也產(chǎn)生了明顯的收縮，細胞相位值有明顯增大。為了更加清晰地展示細胞的死亡過程，選取其中兩個破裂的細胞，細胞2 和細胞6，并在圖3 中展示了5 h 死亡過程中細胞形態(tài)的相位圖像。圖3中能夠較為直觀地看出，細胞在破裂死亡前細胞面積減小，相位值變大，細胞在產(chǎn)生向內(nèi)收縮的現(xiàn)像。當收縮達到一定程度，分別在4 h 35 min 和4 h 9 min 時，細胞2 和細胞6 細胞相位值不再增大而是突然減小，表明細胞發(fā)生破裂，細胞內(nèi)物質(zhì)流出失去活性，此后細胞相位值不再發(fā)生明顯的變化。

2.2 癌細胞凋亡過程參數(shù)變化

為了更加準確地描述癌細胞產(chǎn)生破裂死亡過程中的形態(tài)變化，對圖2 中的8 個細胞的形態(tài)參數(shù)進行了計算。圖4 中的8 條曲線分別展示了細胞的平均相位的變化，每條曲線由90 個時間點組成，每小時取10 個時間點，即每個點由6 個時刻的細胞相位均值再取平均得到。如圖4 所示，圖中的曲線為細胞相位的平均值，陰影部分為標準差。從圖中的曲線可以看出，在加藥后細胞的平均相位值均呈現(xiàn)出增大的趨勢，直至在某一個時刻相位值突然減小，這一過程與圖3 中觀察到的細胞相位圖像變化相一致。細胞在內(nèi)外滲透壓平衡的活性狀態(tài)下，體積不會出現(xiàn)較大的變化，結(jié)合圖3 中細胞面積減小的變化過程，表明細胞在收縮過程中引細胞高度或內(nèi)部折射率在不斷增加。但不同細胞相位均值的變化過程存在差異，不同于其他細胞的逐漸增大的過程，細胞5 和細胞6 均出現(xiàn)相位均值大幅回落后又重新升高的現(xiàn)象。然而，細胞在破裂前的整體趨勢均為細胞相位值的增加。

對細胞內(nèi)干重的計算結(jié)果如圖5。從圖中的8 條曲線可以看出，細胞破裂前，在對應的細胞相位均值明顯增大且趨勢不一的情況下，細胞的干重均沒有發(fā)生明顯的變化，只在細胞破裂時干重瞬間減小。細胞干重代表了細胞內(nèi)干物質(zhì)的質(zhì)量，因此這一趨勢可能是由于細胞破裂時，細胞內(nèi)部物質(zhì)流出導致的干重急劇較少。從圖5 中能夠看出，細胞4 的干重相比其他細胞都較大，這是由于同種細胞不同個體之間存在一定的差異，且癌細胞具有較強的異質(zhì)性，因此不同細胞的形態(tài)是有差異的，但從圖中也能看出，差異較大的細胞在破裂的過程所表現(xiàn)出的干重變化趨勢是一致的。這一結(jié)果也表明由數(shù)字全息相位圖像計算所得的細胞參數(shù)能夠?qū)Π┘毎蛲龅淖兓^程進行表征。

3 結(jié)論

本文采用數(shù)字全息顯微系統(tǒng)對無任何化學標記的癌細胞加入藥物后的細胞形態(tài)變化過程進行了記錄。通過對記錄的全息干涉圖像進行切趾、頻域濾波、角譜傳播、像差補償及數(shù)值自動聚焦等過程完成了對細胞相位圖像的數(shù)值再現(xiàn)。為了對癌細胞在化療藥物下凋亡過程中細胞形態(tài)變化進行分析，從相位圖像中分割出單個細胞相位圖像，提取其相位均值及細胞干重并繪制出其參數(shù)變化曲線。結(jié)果表明，癌細胞在凋亡至裂解前，細胞干重沒有較明顯的變化，而在細胞膜裂解瞬間，細胞內(nèi)物質(zhì)流出，細胞干重急劇減小。而細胞相位均值在裂解前不斷增大，而細胞干重并未明顯增大表明細胞出現(xiàn)了收縮，這與已有研究中的細胞形態(tài)變化的結(jié)論一致。因此，數(shù)字全息顯微技術(shù)提供的定量相位圖像能夠反映癌細胞凋亡的特異性形態(tài)變化，能夠在無需熒光標記的情況下對癌細胞的凋亡細胞和死細胞進行區(qū)分，對體外抗癌藥物的篩選及個性化治療具有重要意義。