LINC01215在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

謝晨 李智 呂嘉春 魏宜勝 彭鐵立

作者單位：511436 廣州 1廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；510260 廣州 2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科；511518 清遠(yuǎn) 3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)病例超過(guò)190萬(wàn)例，死亡93.5萬(wàn)例，我國(guó)結(jié)直腸癌死亡率也在逐年上升［1-2］。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低CRC死亡率的關(guān)鍵，因此尋找早期篩查的特異性生物標(biāo)志物具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是不具備蛋白編碼功能且長(zhǎng)度大于200 nt的DNA轉(zhuǎn)錄本，在細(xì)胞周期、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄激活等多種重要的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑改變腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)或免疫微環(huán)境，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［3-5］。LINC01215是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在乳腺癌、上皮性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6-7］。但目前LINC01215與CRC的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組通過(guò)小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)76對(duì)CRC及其癌旁組織的lncRNAs表達(dá)，其中發(fā)現(xiàn)LINC01215表達(dá)顯著。基于此，本研究進(jìn)一步通過(guò)TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本數(shù)據(jù)并結(jié)合臨床標(biāo)本分析LINC01215在CRC組織中的表達(dá)及其臨床價(jià)值，以期進(jìn)一步闡明LINC01215在CRC中作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下載CRC患者的LINC01215表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息。納入患者均有完整的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床參數(shù)信息。最終共納入530例CRC組織和43例癌旁正常組織。

1.2 臨床資料

收集2009年3月至2012年1月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診治的CRC患者的癌組織及癌旁正常組織（距癌灶5 cm），用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后立即放入液氮罐中保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴所有患者均為首次治療，CRC切除術(shù)前均未行放療、化療等抗腫瘤治療；⑵組織病理學(xué)確診為CRC。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并心、肝、腎等重要臟器疾?。虎坪喜⑵渌麗盒阅[瘤；⑶合并感染性疾病。最終共納入137例CRC患者，其中≤60歲占48.91%（67/137），男性占54.74%（75/137）；結(jié)腸癌占40.15%（55/137），直腸癌占59.85%（82/137）；低分化占86.86%（119/137），高分化占13.14%（18/137）；臨床Ⅰ和Ⅱ期患者占50.36%（69/137）；T1和T2分期患者占15.33%（21/137）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占52.55%（72/137）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者占90.51%（124/137）。收集患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、TNM分期（AJCC第8版）等臨床資料。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)為KY01-2019-02-10），患者知情同意。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)LINC01215在CRC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

使用Trizol試劑（Invitrogen Carlsbad，美國(guó)）提取CRC組織和癌旁正常組織中的總RNA，測(cè)定RNA含量后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit（TaKaRa，日本）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并按SYBR?Green分析法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃30 s；95℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù) LINC01215全長(zhǎng)基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性的引物。LINC01215上游引物為T(mén)GTGCTTGGAACGTGTAGTG，下游引物為AGCAAGCAGAGGATCAAAGC。β-actin上游引物為GGCGGCACCACCATGTACCCT，下游引物為AGGGGCCGGACTCGTCATACT。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算LINC01215的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 LINC01215相關(guān)潛在靶基因的預(yù)測(cè)及富集分析

通過(guò)MEM在線工具（https：//biit.cs.ut.ee/mem/index.cgi）獲取LINC01215潛在靶基因，選用A-AFFY-44基因矩陣，刪除未知基因和含糊不清的基因，根據(jù)相關(guān)系數(shù)從大到小排序，輸出前200個(gè)靶基因。應(yīng)用DAVID6.7在線生物信息學(xué)工具（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)LINC01215靶基因進(jìn)行GO注釋、KEGG信號(hào)通路分析，初步探討LINC01215在CRC中的潛在作用機(jī)制。

1.5 單樣本基因集富集分析LINC01215表達(dá)與CRC免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

利用gsva R語(yǔ)言包通過(guò)單樣本基因集富集分析（ssGSEA）計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分；采用Spearman分析LINC01215表達(dá)與28種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分的相關(guān)性。

1.6 藥物敏感性分析

從 cellminer網(wǎng) 站（https：//discover.nci.nih.gov/cellminer/）下載LINC01215表達(dá)和NCI-60藥物敏感性數(shù)據(jù)，選取美國(guó)FDA批準(zhǔn)的藥物和臨床試驗(yàn)藥物進(jìn)行分析［8］。通過(guò)Spearman分析NCI-60藥物z分?jǐn)?shù)與LINC01215表達(dá)的相關(guān)性，z分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明LINC01215表達(dá)對(duì)相應(yīng)的藥物越敏感；根據(jù)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行排序，選取前4種藥物。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)中連續(xù)變量以中位數(shù)（P25，P75）形式表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)法分析LINC01215在CRC組織及正常組織中的表達(dá)差異。根據(jù)LINC01215表達(dá)水平中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用χ2檢驗(yàn)分析LINC01215表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier曲線分析兩組患者的生存情況，組間差異采用log-rank檢驗(yàn)。采用單因素Cox回歸分析影響CRC患者總生存期（overall survival，OS）的相關(guān)因素，將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸模型，分析LINC01215與CRC預(yù)后的關(guān)聯(lián)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01215在CRC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載CRC患者的LINC01215表達(dá)數(shù)據(jù)并分析其在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，LINC01215在CRC組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（P＜0.001），見(jiàn)圖1A；采用RT-qPCR對(duì)137例CRC患者的臨床組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果亦顯示，LINC01215在CRC組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織（P=0.001），見(jiàn)圖1B。

圖1 LINC01215在CRC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of LINC01215 in CRC tissues and adjacent normal tissues

2.2 LINC01215表達(dá)水平與CRC患者臨床特征的關(guān)系

在TCGA數(shù)據(jù)中，LINC01215表達(dá)水平與CRC患者年齡、性別、TNM分期等無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。臨床樣本驗(yàn)證顯示，LINC01215表達(dá)水平與患者組織分化程度相關(guān)（P=0.037），但與年齡、性別、TNM分期等無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LINC01215表達(dá)與CRC患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between LINC01215 expression and clinical characteristics of CRC patients in TCGA

表2 LINC01215表達(dá)水平與CRC患者臨床特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between LINC01215 expression and the clinical characteristics of CRC patients

2.3 LINC01215表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，LINC01215高表達(dá)組的中位OS明顯高于LINC01215低表達(dá)組［96個(gè)月（95%CI：80～113個(gè)月）vs 82個(gè)月（95%CI：70～95個(gè)月），P=0.002］，見(jiàn)圖2。單因素Cox回歸分析顯示，LINC01215表達(dá)水平、年齡、臨床分期和TNM分期與預(yù)后相關(guān)（均P＜0.05）。將LINC01215表達(dá)水平、年齡、臨床各分期和TNM分期納入多因素Cox回歸模型，結(jié)果顯示LINC01215低表達(dá)是CRC預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（HR=1.69，95%CI：1.13～2.51，P=0.010），見(jiàn)表3。

圖2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LINC01215與CRC患者OS的關(guān)系Fig.2 The relationship between LINC01215 and OS in CRC patients based on TCGA database

表3 影響CRC患者預(yù)后的Cox回歸分析Tab.3 The results of Cox analysis affecting the prognosis of patients with CRC

2.4 LINC01215靶基因的富集分析

通過(guò)MEM在線工具獲取LINC01215的潛在靶基因，并進(jìn)行GO注釋和KEGG分析。GO注釋結(jié)果顯示，LINC01215靶基因在生物過(guò)程中主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路等，在細(xì)胞組成中主要富集于質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)等，在分子功能中主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合等；KEGG分析結(jié)果提示，LINC01215的靶基因在CRC中主要富集在免疫或免疫相關(guān)途徑，如T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。

圖3 LINC01215潛在基因靶點(diǎn)的GO注釋和KEGG分析Fig.3 GO categories and KEGG pathways of potential gene targets of LINC01215

2.5 LINC01215表達(dá)與CRC免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

基于富集分析結(jié)果，利用ssGSEA方法評(píng)估TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CRC組織標(biāo)本中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平，并分析其與LINC01215表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，LINC01215表達(dá)與CD56dim NK細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.165，P＜0.001），與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 TCGA數(shù)據(jù)的ssGSEA評(píng)分結(jié)果Fig.4 Result of ssGSEA scoring of TCGA database

2.6 藥物敏感性預(yù)測(cè)

Spearman分析結(jié)果顯示，LINC01215表達(dá)與Chelerythrine、Sapacitabine、Fenretinide、Hydroxyurea這4種藥物的敏感性呈正相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 LINC01215與藥物的敏感性預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of susceptibility between LINC01215 and drugs

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，在癌癥的診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估等方面均具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［9］。LINC01215是位于3號(hào)染色體3q13.12區(qū)的lncRNA，長(zhǎng)度為2 609 bp，其上下游基因?yàn)镃D47和ITF57。目前已有研究表明LINC01215表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如LINC01215低表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后不良［6］；在上皮性卵巢癌中沉默LINC01215可促進(jìn)RUNX3的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［7］。本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，LINC01215在CRC組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，臨床樣本檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)LINC01215在CRC組織中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與CRC病理分化程度有關(guān)?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析還發(fā)現(xiàn)，LINC01215高表達(dá)患者的中位OS明顯優(yōu)于LINC01215低表達(dá)者，多因素Cox回歸分析也顯示，LINC01215低表達(dá)為CRC預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上研究結(jié)果說(shuō)明LINC01215在CRC中低表達(dá)，且可能參與促進(jìn)CRC的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤進(jìn)展不僅受癌細(xì)胞固有的遺傳變化和環(huán)境因素影響，人體內(nèi)環(huán)境的變化也會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。為了進(jìn)一步探索LINC01215在CRC中的作用機(jī)制，本研究對(duì)LINC01215靶基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC01215在CRC中主要通過(guò)參與T細(xì)胞受體信號(hào)通路發(fā)揮作用，ssGSEA結(jié)果也表明LINC01215表達(dá)與CD56dim NK細(xì)胞的滲透水平呈負(fù)相關(guān)，與T細(xì)胞等呈正相關(guān)，提示LINC01215與免疫淋巴細(xì)胞的滲透和免疫微環(huán)境的改變有關(guān)。已有研究表明，CD56dim NK細(xì)胞在CRC中能通過(guò)減少顆粒酶和穿孔素釋放等方式，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［10］。T細(xì)胞等能通過(guò)釋放不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［11］。此外，還有研究表明，LINC01215與CD40LG和RASGRP1共表達(dá)，且參與了T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑［12］。CD40可通過(guò)刺激腫瘤血管中的白細(xì)胞黏附并增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞向腫瘤遷移，從而抑制腫瘤的形成［13］。而RasGRP1是結(jié)腸上皮中的腫瘤抑制基因之一，也是EGFR信號(hào)通路的標(biāo)志物［14］。由此推測(cè)LINC01215可能通過(guò)T細(xì)胞受體信號(hào)通路等信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)CRC微環(huán)境中的免疫滲透，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，進(jìn)而促進(jìn)CRC發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，本研究通過(guò)藥物敏感性分析篩選出了Chelerythrine、Sapacitabine、Hydroxyurea、Fenretinide等4種藥物與LINC01215表達(dá)相關(guān)。既往研究［15-20］已證實(shí)這些藥物均具有抗腫瘤效應(yīng)，其中Hydroxyurea能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和中性粒細(xì)胞的分化，并刺激效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)，可作為輔助治療藥物應(yīng)用于CRC臨床治療；而Chelerythrine作為蛋白激酶C抑制劑也可通過(guò)磷脂酶C蛋白激酶C通路對(duì)T淋巴細(xì)胞功能和細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)。提示Chelerythrine、Hydroxyurea可能參與T細(xì)胞受體信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)，因此靶向LINC01215以及T細(xì)胞受體信號(hào)通路可能在CRC藥物開(kāi)發(fā)中具有一定潛力。

綜上所述，LINC01215在CRC組織中低表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)，可能是CRC預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn)。生物信息學(xué)分析結(jié)果初步顯示LINC01215可能通過(guò)T細(xì)胞受體等信號(hào)通路而在CRC中發(fā)揮作用。但本研究納入的臨床樣本量較小，今后還需擴(kuò)大樣本量并開(kāi)展更加系統(tǒng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入探索LINC01215在CRC中的作用及其作用機(jī)制。