載阿帕替尼金屬有機(jī)框架納米顆粒的制備及其體外抗乳腺癌的作用

龐泓冰 周財賦 韓創(chuàng)業(yè) 韓簫 何勇飛 唐立博 農(nóng)瑩丹 盧春苗 楊子葉 羅小玲

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球女性乳腺癌發(fā)病率為24.5%，死亡率為15.5%［1］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)針對ER陽性和HER2陽性乳腺癌類型的靶向治療可減少乳腺癌復(fù)發(fā)，提高存活率［2］。阿帕替尼作為一種新型口服靶向VEGFR-2細(xì)胞內(nèi)ATP結(jié)合位點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，能抑制腫瘤血管生成，在多種腫瘤中顯示出抗腫瘤作用［3-6］。目前，阿帕替尼在國內(nèi)已應(yīng)用于進(jìn)展期胃癌和肝細(xì)胞癌的治療［7］，其在乳腺癌中的應(yīng)用雖然仍處于臨床試驗階段，但是單藥阿帕替尼在重度預(yù)處理、毒性可控的轉(zhuǎn)移性非三陰性乳腺癌中已表現(xiàn)出了令人鼓舞的療效［8］。此外，阿帕替尼在乳腺癌體外研究中也展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，如通過PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖［9］，通過ERK/JAK2-STAT3途徑抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］。然而，臨床治療中患者雖然對阿帕替尼的耐受性良好，但是高劑量且長期使用會導(dǎo)致高血壓、蛋白尿和手足口病綜合征等藥物不良反應(yīng)，需減少劑量，甚至中斷或終止藥物治療［11］。因此，尋找更高效、低毒的新型方法具有重要意義。

近年來，金屬有機(jī)框架材料納米顆粒因具有高滲透性和滯留效應(yīng)能在腫瘤中積累而成為研究熱點(diǎn)之一［12］。沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）作為金屬有機(jī)框架材料納米顆粒的一個子類，具有熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性［13］和吸附-脫附性能等優(yōu)勢［14］。將藥物封裝在ZIF-8中可以調(diào)整藥物在納米材料內(nèi)的負(fù)載量［15］，ZIF-8還能在保護(hù)負(fù)載藥物的前提下于特定腫瘤微環(huán)境中崩解釋放藥物［16］，從而最大程度減少用藥量和降低藥物的毒副作用。阿帕替尼對VEGFR-2具有高選擇性親和力，而乳腺癌4T1細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移性和高血管生成的特性［17］，因此本研究選擇乳腺癌4T1細(xì)胞作為研究對象，將阿帕替尼封裝入自制的載阿帕替尼的金屬有機(jī)框架納米顆粒ZIF-8（apatinib@zeolitic imidazolate framework-8，A@ZIF-8），并探討其對乳腺癌4T1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，同時評估其生物安全性，以期為A@ZIF-8應(yīng)用于乳腺癌治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

1.1.1 細(xì)胞系 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的RMPI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.1.2 實(shí)驗動物 13只Balb/c雌性小鼠，4～6周齡，體重15～20 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。本實(shí)驗經(jīng)實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 其他主要試劑 阿帕替尼購自美國MCE公司（批號：12375；純度：99.57%），六水合硝酸鋅［Zn（NO3）2·6H2O］購自西隴科學(xué)股份有限公司，二甲基咪唑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲醇購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國西格瑪奧德里奇公司，澳洲胎牛血清及RMPI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素混合液及0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購自以色列Biological Industries生物科技公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，HE染色試劑盒及中性樹膠購自北京索萊寶科技有限公司，無水乙醇購自上海泰坦科技股份有限公司，二甲苯購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，10%中性福爾馬林固定液購自福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 ZIF-8與A@ZIF-8的制備

1.2.1 ZIF-8 稱取0.3 g六水合硝酸鋅，用40 mL甲醇溶液溶解后，用渦旋振蕩器使其充分溶解（簡稱A液）；另稱取0.17 g二甲基咪唑用40 mL甲醇溶解（簡稱B液）。將A液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在恒溫水浴下用磁力轉(zhuǎn)子攪拌1～2 min（150 r/min），隨后加入B液，繼續(xù)攪拌5 min，室溫下靜置4 h后，以12 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀物經(jīng)甲醇、DMSO分別洗滌離心2次后，再用純水溶解，離心、冷凍干燥，最終所得產(chǎn)物即為金屬有機(jī)框架納米顆粒ZIF-8。

1.2.2 A@ZIF-8 稱取2.0 mg阿帕替尼，用200μL甲醇溶解制成阿帕替尼溶液。按照上述1.2.1方法配置A液和B液，將A液轉(zhuǎn)至圓底燒瓶中，恒溫水浴下磁力攪拌1～2 min（150 r/min），加入B液，磁力攪拌2 min時迅速滴加阿帕替尼溶液，繼續(xù)攪拌3 min后，按照1.2.1方法靜置、洗滌、離心和干燥，即得金屬有機(jī)框架載藥納米顆粒A@ZIF-8。

1.3 ZIF-8與A@ZIF-8的表征

各稱取1 mg ZIF-8和A@ZIF-8，分別用1 mL ddH2O制備成懸液后備用。將銅網(wǎng)放在鋪有封口膜的玻璃片上，分別取10 μL ZIF-8和A@ZIF-8懸液滴于銅網(wǎng)上，靜置后用濾紙吸去多余液體，待銅網(wǎng)晾干后，用透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米顆粒的形態(tài)并拍攝；另分別取ZIF-8和A@ZIF-8懸液，用高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米顆粒的形態(tài)并拍照，用馬爾文激光粒度儀分析納米顆粒的Zeta電位情況。

1.4 A@ZIF-8的體外抗腫瘤作用

1.4.1 CCK-8法檢測A@ZIF-8對4T1細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞接種至96孔板（5×103/孔）中，每組設(shè)5個復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。實(shí)驗分為對照組、ZIF-8組和A@ZIF-8組。其中，對照組用RMPI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，ZIF-8組和A@ZIF-8組每孔分別加入100μL預(yù)先用RMPI-1640完全培養(yǎng)基分別制備的不同濃度（2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、60.0 μg/mL、100.0μg/mL）ZIF-8培養(yǎng)基溶液和A@ZIF-8培養(yǎng)基溶液，于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=［（實(shí)驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值］×100%。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測A@ZIF-8對4T1細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞接種至6孔板（2×105/孔）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗分為對照組、ZIF-8組和A@ZIF-8組，其中對照組用無血清RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，A@ZIF-8組用無血清RMPI-1640培養(yǎng)基制備濃度為IC50的A@ZIF-8培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)，ZIF-8組用無血清RMPI-1640培養(yǎng)基制備濃度與A@ZIF-8相同的ZIF-8培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)。各組加入相應(yīng)培養(yǎng)基后，繼續(xù)孵育2 h；然后收集各組細(xì)胞，1 000 g離心5 min，吸除上清液，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加入5μL Annexin V-FITC、10μL碘化丙啶染色液混勻，室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 A@ZIF-8的生物安全性評價

從13只Balb/c雌性小鼠中隨機(jī)選取1只小鼠用于溶血試驗，其余12只小鼠用于體內(nèi)生物安全性檢測。

1.5.1 溶血試驗檢測A@ZIF-8的血液相容性 小鼠稱重后用含1%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，采用摘眼球取血法收集約2 mL新鮮全血，加入PBS重懸，3 500 r/min離心5 min后棄上清液，重復(fù)操作3次；再次向沉淀中加入20 mL PBS重懸紅細(xì)胞，即得紅細(xì)胞懸液。實(shí)驗分為對照組和不同濃度A@ZIF-8組，每組設(shè)立3個復(fù)孔。對照組用800μL PBS+200μL紅細(xì)胞懸液處理，A@ZIF-8組用800μL PBS+不同濃度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、250μg/mL、500μg/mL）A@ZIF-8溶液+200μL紅細(xì)胞懸液處理。各組溶液均于37℃水浴箱中孵育4 h后，3 500 r/min離心5 min，取上清液，用多功能酶標(biāo)儀檢測540 nm處的OD值。

1.5.2 血常規(guī)及血液生化分析A@ZIF-8的體內(nèi)安全性 12只小鼠隨機(jī)分為對照組（n=6）和A@ZIF-8組（n=6）。其中，A@ZIF-8組在尾靜脈注射200μL用生理鹽水溶解的濃度為IC50的A@ZIF-8納米顆粒溶液，每隔2 d注射1次，共注射3次；對照組在尾靜脈注射等體積的生理鹽水。于首次注射14 d后，稱重小鼠并用含1%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液（80 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，收集血液并上機(jī)檢測獲得紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、血小板計數(shù)（PLT）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等數(shù)據(jù)。

1.5.3 HE染色檢測A@ZIF-8對重要器官的影響 采血后脫頸處死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎器官，用0.9%生理鹽水沖洗，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋并切成2～4μm厚度的薄片，二甲苯脫蠟2次，再用梯度無水乙醇脫水，蘇木素染液染色5 min，酒精伊紅染色液染色5 min，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)Excel處理，采用 SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Bonferroni檢驗進(jìn)行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZIF-8和A@ZIF-8的形態(tài)特征及Zeta電位情況

TEM觀察結(jié)果顯示，ZIF-8和A@ZIF-8形態(tài)相似，均表現(xiàn)為顆粒大小均一，分散性較好，呈多面體球形，但A@ZIF-8直徑較ZIF-8明顯增加［（206.63±21.83）nm vs（151.23± 14.10）nm，P＜0.001］，見 圖1A～B。SEM觀察結(jié)果顯示，ZIF-8和A@ZIF-8形態(tài)相似，均呈十二面立方體狀，但A@ZIF-8粒徑較ZIF-8明顯增加［（235.32±27.82）nm vs（115.04±10.32）nm，P＜0.001］，見圖1C～D。馬爾文激光粒度儀檢測納米顆粒的電位值，結(jié)果顯示，ZIF-8封裝藥物阿帕替尼后的Zeta電位明顯高于ZIF-8［（28.87±0.40）mV vs（18.90±0.95）mV，P＜0.001］。以上結(jié)果表明，阿帕替尼成功封裝入ZIF-8，即A@ZIF-8制備成功。

圖1 ZIF-8和A@ZIF-8的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ZIF-8 and A@ZIF-8

2.2 A@ZIF-8對乳腺癌4T1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ZIF-8濃度小于60.0μg/mL時4T1細(xì)胞的增殖能力變化不明顯（均P＞0.05），當(dāng)濃度到達(dá)100.0μg/mL時其對4T1細(xì)胞的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.001）；A@ZIF-8濃度小于30.0μg/mL時，4T1細(xì)胞的增殖能力與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；從30.0μg/mL濃度開始，4T1細(xì)胞的增殖能力隨著A@ZIF-8濃度增加而逐漸下降（均P＜0.001），IC50值為27.69μg/mL。見圖2。

圖2 不同濃度A@ZIF-8對乳腺癌4T1細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of A@ZIF-8 on the proliferation of breast cancer 4T1 cells

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，27.69 μg/mL ZIF-8處理后4T1細(xì)胞凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但27.69 μg/mL A@ZIF-8處理后4T1細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高（P＜0.001），見圖3。

圖3 A@ZIF-8對乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of A@ZIF-8 on the apoptosis of breast cancer 4T1 cells

2.3 A@ZIF-8的血液相容性

溶血試驗結(jié)果顯示，對照組及各濃度A@ZIF-8組小鼠紅細(xì)胞懸液離心后，管中上清液均清澈透明，未出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，見圖4；各濃度A@ZIF-8組小鼠的OD值與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），表明A@ZIF-8在小鼠體內(nèi)未破壞血紅細(xì)胞膜，不易發(fā)生溶血。

圖4 不同濃度A@ZIF-8作用后小鼠紅細(xì)胞懸液的溶血情況Fig.4 Hemolysis of mouse erythrocyte suspension treated with different concentrations of A@ZIF-8

2.4 A@ZIF-8的體內(nèi)安全性

對照組及A@ZIF-8組小鼠處理14 d后，飲食、活動、毛色均無明顯變化，未發(fā)生疾病或死亡。實(shí)驗室檢查結(jié)果顯示，A@ZIF-8組小鼠的WBC、RBC、PLT、ALT、AST等指標(biāo)均在正常值范圍，見表1。HE染色結(jié)果顯示，A@ZIF-8組小鼠心、肝、脾、肺、腎等均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)正常，見圖5。以上結(jié)果表明，A@ZIF-8具有較好的體內(nèi)安全性。

表1 A@ZIF-8對小鼠RBC、WBC、PLT、ALT、AST的影響Tab.1 Effects of A@ZIF-8 on RBC,WBC,PLT,ALT,AST in mice

圖5 A@ZIF-8處理14 d后小鼠重要器官的HE染色結(jié)果（×400）Fig.5 HE staining results of vital organs of Balb/c female mice on day 14 after injection of A@ZIF-8 solution(×400)

3 討論

近年來，納米醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展為癌癥治療開辟了新的領(lǐng)域，也為提高抗癌治療效果和降低毒副作用帶來了巨大希望，特別是載藥納米的使用為準(zhǔn)確診斷和有效治療腫瘤提供了更多的可能性［18］。與其他納米顆粒相比，ZIF-8具有特殊的化學(xué)和熱穩(wěn)定性［13］，且在酸性（pH 5.0～6.0）條件下容易分解［19］。既往研究顯示，腫瘤微環(huán)境pH值一般為5.5～6.0，而ZIF-8因咪唑的質(zhì)子化，載藥后能夠在酸性條件下降解并釋放藥物，可作為天然pH響應(yīng)性靶向藥物載體［20］，這意味著載藥的ZIF-8可以在特定腫瘤微環(huán)境中崩解釋放藥物，最大程度減少用藥量和降低藥物的毒副作用。已有不少研究證實(shí)ZIF-8的作用，如ZHUANG等［21］發(fā)現(xiàn)ZIF-8在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中表現(xiàn)出較小的細(xì)胞毒性；CHENG等［22］制備了裝載阿霉素（DOX）和四氧化三鐵（Fe3O4）的納米顆粒DOX@Fe3O4-ZIF-8作為肝癌細(xì)胞靶向藥物傳遞系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該載體有較高的載藥能力且具有良好的藥物緩釋性能，且其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較游離DOX強(qiáng)。YU等［23］將姜黃素載入ZIF-8中構(gòu)建載藥納米顆粒并證明該載藥納米顆粒對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞有增殖抑制作用，能引起更多的細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。阿帕替尼作為VEGFR-2的一種小分子抑制劑，在乳腺癌的臨床試驗階段已表現(xiàn)出良好的抗癌效果［8］。為了觀察載阿帕替尼ZIF-8的抗乳腺癌作用，本研究首先將阿帕替尼裝載入ZIF-8構(gòu)建載藥納米顆粒A@ZIF-8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZIF-8載入阿帕替尼后顆粒形態(tài)與未載藥形態(tài)相同，但粒徑和Zeta電位明顯增加，表明A@ZIF-8制備成功。然后，進(jìn)一步在乳腺癌4T1細(xì)胞中觀察A@ZIF-8對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度A@ZIF-8處理后4T1細(xì)胞的增殖能力均受到抑制，且從30.0μg/mL開始，抑制作用明顯增強(qiáng)，這與A@ZIF-8的IC50為27.69μg/mL相符。后續(xù)用27.69μg/mL A@ZIF-8處理4T1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率亦明顯升高，說明A@ZIF-8能抑制4T1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在乳腺癌治療中具有應(yīng)用前景。

溶血試驗和重要器官的毒性實(shí)驗是評價納米材料安全性的重要方法［24］。為進(jìn)一步評價A@ZIF-8的安全性，本研究同時構(gòu)建小鼠模型，并檢測A@ZIF-8作用于小鼠后體外溶血、相關(guān)血液生化指標(biāo)及重要器官等的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A@ZIF-8不易破壞血紅細(xì)胞膜，也未發(fā)生溶血，且注射A@ZIF-8溶液后小鼠血常規(guī)、肝功能、腎功能等指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，重要器官HE染色在鏡下亦未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，表明A@ZIF-8具有良好的生物安全性。關(guān)于ZIF-8藥物裝載量和釋放率，既往研究已證實(shí)ZIF-8藥物裝載量良好，且在酸性條件下的釋放效果更佳［25-27］。但本研究尚未計算阿帕替尼在ZIF-8中的載藥量和釋放率，后續(xù)將繼續(xù)完善關(guān)于A@ZIF-8的載藥和釋放實(shí)驗，以提供更直觀和全面的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的載藥納米顆粒A@ZIF-8能夠抑制4T1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且具有良好的生物安全性。該結(jié)果拓展了乳腺癌治療的思路，同時有助于推動載藥納米給藥系統(tǒng)向臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展。