基于轉(zhuǎn)錄組測序分析骨髓間充質(zhì)干細胞對子宮內(nèi)膜癌細胞的影響

蒙妮 趙冰冰 隆曜先 何珊 張潔清 李力

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科；400038 重慶 2第三軍醫(yī)大學陸軍特色醫(yī)學中心婦產(chǎn)科；646000 四川 3西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦科

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤，早期子宮內(nèi)膜癌以手術聯(lián)合放化療為主要治療手段，治療效果良好，但晚期及復發(fā)性患者治療效果欠佳。近年來，腫瘤靶向治療日益受到關注，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）對多種腫瘤具有趨化性，可能作為靶向治療的載體［1-2］。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）雖然目前主要應用于骨骼再生修復、骨關節(jié)炎、缺血性心臟病等［3-5］，但其在靶向治療中也顯示出一定優(yōu)勢。然而BMSCs對腫瘤的作用仍存在爭議，如有研究報道BMSCs可能參與腫瘤發(fā)展，主要發(fā)揮促進腫瘤遷移、侵襲作用［6］，但部分研究發(fā)現(xiàn)其衍生的外泌體可抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［7］。為了進一步明確BMSCs在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其機制，尤其是常見的Ⅰ型雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌，本研究選擇雌激素和孕激素受體表達均陽性的Ishikawa細胞與BMSCs接觸共培養(yǎng)，然后對共培養(yǎng)后的癌細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，以探索BMSCs對子宮內(nèi)膜癌細胞轉(zhuǎn)錄水平的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

Ishikawa細胞購自北納生物，人BMSCs、干細胞專用培養(yǎng)基購自上海賽百康生物科技有限公司，Lenti-EGFP慢病毒和Polybrene購自上海銳賽生物技術有限公司，高糖DMEM培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，滅稻瘟素（blasticidin S，BSD）購自美國Millipore公司，10%胎牛血清（FBS）購自美國Gemini公司，0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液（P/S）、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司，TRIzol總RNA抽提盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，SYBR Green熒光定量試劑盒、PCR儀購自美國賽默飛公司，熒光激活細胞分選儀購自BD公司（BD AccuriTMC6），兔抗人ETS1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（兔抗）購自英國Abcam公司，qPCR引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染及篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 將Ishikawa細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%FBS+1%P/S的DMEM完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞融合至80%左右，重新消化、離心、重懸，按2×106/孔接種到含DMEM完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，當細胞融合率達50%時，加入MOI=50的Lenti-EGFP慢病毒液，并加入8μg/mL的Polybrene增強感染。當感染效率大于70%時，加入2.0μg/mL的BSD進行篩選，第4天將BSD濃度降到1.0μg/mL，第14天將穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的 Ishikawa細胞（即Ishikawa-EGFP細胞）擴增。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和熒光激活細胞分選 實驗分為3組：⑴空白組，未感染慢病毒的Ishikawa細胞；⑵Ishikawa-EGFP單獨培養(yǎng)組，Ishikawa-EGFP細胞接種于含DMEM完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)；⑶Ishikawa-EGFP+BMSCs接觸共培養(yǎng)組，Ishikawa-EGFP細胞和BMSCs按1∶3比例接種到10 cm培養(yǎng)皿中，干細胞專用培養(yǎng)基與DMEM培養(yǎng)基按1∶1比例混合［8］。培養(yǎng)1～4 d，熒光顯微鏡觀察并計數(shù)共培養(yǎng)組的熒光細胞數(shù)量。

第4天分別收集3組細胞，制備成單細胞懸液。通過BD AccuriTMC6在488 nm波長激發(fā)光下分離Ishikawa-EGFP+BMSCs組中EGFP陽性（EGFP+）和EGFP-細胞?？瞻捉M作為陰性對照樣本調(diào)試電壓，上樣后調(diào)節(jié)細胞流速，維持在2 500 events/s左右，根據(jù)細胞大小和顆粒度選擇Forward Scatter（FSC）和Side Scatter（SSC）范圍，調(diào)整門的位置、大小和形狀，調(diào)節(jié)熒光通道電壓。取下對照樣品管，上共培養(yǎng)組樣品，開始采樣。取有EGFP+細胞的采樣管，10 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗1遍，再次離心后棄上清液。然后收集共培養(yǎng)后的Ishikawa-EGFP細胞，液氮速凍后于-80℃保存。將單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)后的Ishikawa-EGFP細胞送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析 本研究數(shù)據(jù)來源于Illumina Novaseq 6000測序平臺。測序內(nèi)容包括mRNA和miRNA。分別采用Truseq RNA sample Prep Kit和TruSeq Small RNA sample Prep Kit進行mRNA、miRNA文庫構(gòu)建，文庫質(zhì)檢后上機測序。下機測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、序列比對，然后獲得mRNA、miRNA注釋信息。再用RSEM（v1.3.1）對mRNA和miRNA進行表達量統(tǒng)計，并進行TPM均一化處理。使用R語言DESeq2包［9］進行差異表達分析，設置參數(shù)P＜0.05和上/下調(diào)差異倍數(shù)≥2（即|Log2FC|≥1）。用miRWalk在線軟件（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/searchmirnas/）預測差異miRNA靶基因，用R語言VennDiagram包對二者取交集基因后進行GO和KEGG富集分析；STRING在線軟件（https：//string-db.org/）進行蛋白網(wǎng)絡互作（protein-protein interaction network，PPI）分析；Cytoscape軟件繪制miRNA-mRNA可視化網(wǎng)絡圖。

1.2.4 qRT-PCR驗證共培養(yǎng)后的Ishikawa-EGFP細胞中CDKN1A和hsa-let-7e-5p的表達水平 采用TRIzol總RNA抽提盒提取總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再配置RT-PCR反應體系：稀釋25倍的cDNA模板（5μL），2 mmol/L上、下游引物（各 0.5 μL），2×SYBR Green Mix（10μL），ddH2O（4μL）。在熒光定量PCR儀上進行熒光定量分析。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃10 s、60℃30 s，共40個循環(huán)，記錄循環(huán)閾值（即Ct值）。以GAPDH、U6為內(nèi)參，每組設3個復孔，重復實驗3次，用2-ΔΔCt分析基因相對表達量。用NCBI Primer-BLAST在線設計引物，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

1.2.5 Western blot驗證共培養(yǎng)后的Ishikawa-EGFP細胞中CDKN1A蛋白的表達水平 收集細胞后用RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r/min離心15 min，根據(jù)BCA法測定總蛋白濃度后，按4∶1混勻蛋白提取液和5×蛋白上樣緩沖液，于100℃煮沸5 min；采用10%SDS-PADGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入一抗（P21、內(nèi)參GAPDH抗體稀釋密度均為1∶1 000），4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜后，加入二抗（稀釋密度1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜后，用ECL顯色，曝光拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ishikawa-EGFP細胞共培養(yǎng)后的增殖情況

采用熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)組第1～4天的綠色熒光細胞狀態(tài)并計數(shù)，結(jié)果顯示，EGFP標記的Ishikawa細胞數(shù)分別為94個、99個、145個、203個，表明共培養(yǎng)1～4 d的Ishikawa-EGFP細胞保持增殖趨勢，于第4天收集生長狀態(tài)良好的細胞進行分選。見圖1。

圖1 共培養(yǎng)組Ishikawa-EGFP細胞的增殖情況Fig.1 Proliferation of Ishikawa-EGFP cells in co-culture

2.2 熒光激活細胞分選共培養(yǎng)后的Ishikawa-EGFP細胞

在BD AccuriTMC6分選儀上設門圈出空白組的Ishikawa細胞群，該群占細胞總數(shù)82.1%，見圖2A；再以相應參數(shù)分選出Ishikawa-EGFP+BMSCs共培養(yǎng)組中帶綠色熒光的Ishikawa-EGFP細胞，結(jié)果顯示，Ishikawa-EGFP陰性細胞占細胞總數(shù)的10.5%，Ishikawa-EGFP陽性細胞占細胞總數(shù)的33.6%，見圖2B。

圖2 熒光激活細胞分選Ishikawa-EGFP陽性細胞Fig.2 Ishikawa-EGFP positive cells sorted out by fluorescence activated cell sorting

2.3 篩選差異表達的mRNA和miRNA

原始測序數(shù)據(jù)按上述流程處理后，共篩選出5 928個差異表達mRNA，111個差異表達miRNA，且僅有65個miRNA在miRWalk中可匹配到靶基因，其中表達下調(diào)16個，表達上調(diào)49個；共富集到2 701個靶基因，韋恩圖顯示其與差異表達mRNA有852個交集基因，其中548個表達上調(diào)，304個表達下調(diào)，見圖3。PPI分析結(jié)果顯示交集基因表達的蛋白之間相互作用（|Log2FC|≥2，P＜0.05，蛋白互作分數(shù)=0.95），共有79個節(jié)點，68條邊（即節(jié)點互作關系）。核心節(jié)點包括CDKN1A、JAK1、COL1A1、VCAN 等，其中 COL1A1與 P4HA2、COL4A1、COL4A2之間存在互作關系（見圖4A），且P4HA2、COL4A1、COL4A2表達上調(diào)（見圖4B）。選取下調(diào)的16個差異表達miRNA及其預測到的交集基因，利用Cytoscape繪制miRNA-mRNA網(wǎng)絡圖，結(jié)果顯示：hsa-let-7e-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p調(diào)控大量靶基因，其中hsa-let-7e-5p潛在靶基因包括CDKN1A，見圖4B。

圖3 交集基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of intersection genes

圖4 交集基因PPI及miRNA-mRNA網(wǎng)絡圖Fig.4 PPI of intersection genes and miRNA-mRNA network

2.4 GO功能分析和KEGG富集分析結(jié)果

GO分析結(jié)果顯示，上調(diào)的交集基因主要參與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)構(gòu)、細胞膜結(jié)構(gòu)、細胞黏附分子結(jié)合等，而下調(diào)交集基因則主要參與軸突發(fā)生、突觸前活動區(qū)、生殖系統(tǒng)發(fā)育等，見圖5；KEGG富集分析結(jié)果提示，上調(diào)差異基因主要富集在PI3K-Akt、黏著斑、MAPK、癌癥中的miRNA、JAK-STAT、Ras等信號通路上，下調(diào)差異基因則主要富集在前列腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等通路，見圖6。

圖5 上調(diào)和下調(diào)交集基因的GO分析Fig.5 GO analysis of up-regulated and down-regulated intersection genes

圖6 上調(diào)和下調(diào)交集基因的KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of up-regulated and down-regulated intersection genes

2.5 驗證共培養(yǎng)后Ishikawa-EGFP細胞中CDKN1A和hsa-let-7e-5p的表達水平

為驗證上述測序結(jié)果，根據(jù)PPI分析結(jié)果選擇節(jié)點互作關系最多的CDKN1A進行qRT-PCR和Western blot驗證，同時根據(jù)miRNA-mRNA網(wǎng)絡圖選取與CDKN1A有潛在靶向調(diào)控作用的hsa-let-7e-5p進行qPCR驗證。qPCR結(jié)果顯示，相比單獨培養(yǎng)組，共培養(yǎng)后Ishikawa細胞的CDKN1A表達升高（t=-6.612，P=0.003），見圖7A；hsa-let-7e-5p表達下降（t=3.157，P=0.034），見圖7B。Western blot結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后CDKN1A蛋白表達水平較單獨培養(yǎng)組上調(diào)（t=6.125，P=0.025），見圖7C～D。

圖7 共培養(yǎng)后Ishikawa-EGFP細胞中CDKN1A和hsa-let-7e-5p的表達水平Fig.7 CDKN1A and hsa-let-7e-5p expression levels in co-cultured Ishikawa-EGFP cells

3 討論

BMSCs是骨髓基質(zhì)細胞中具有多向分化潛能的成體干細胞，它可以向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化，是組織修復和再生醫(yī)學的理想種子來源。BMSCs能抑制細胞毒性T細胞對異體移植細胞的反應，加強修復受損組織［10］。BMSCs在宮腔黏連治療方面也有促進子宮內(nèi)膜再生的潛在作用［11］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs有腫瘤趨向性，其可以逃避免疫識別而遷移至靶組織，并通過分泌細胞因子、趨化因子等調(diào)節(jié)局部微環(huán)境［12］。BMSCs也與多種腫瘤有關，如可通過激活IL-6/STAT3信號通路并促進肝癌細胞侵襲［13］。在胃癌中，BMSCs可以遷移到胃癌組織，分泌白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）并激活Src信號通路，從而促進胃癌發(fā)生發(fā)展［14］。SO等［15］將人羊水、臍帶、骨髓來源的間充質(zhì)干細胞與卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌細胞接觸共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)上清液中的IL-6、CXC基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CXCL8均顯著增加，并促進兩者侵襲和遷移。但是，BMSCs在子宮內(nèi)膜癌中確切的作用及其機制并不明確。本研究通過構(gòu)建Ishikawa-EGFP細胞與BMSCs接觸共培養(yǎng)模型進行探索BMSCs與子宮內(nèi)膜癌的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs可能促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖。進一步進行轉(zhuǎn)錄組測序分析和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的交集基因主要富集在PI3K-Akt、MAPK、JAK-STAT等信號通路上，因此推測共培養(yǎng)后可能通過激活以上通路從而促進細胞增殖。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)下調(diào)交集基因主要富集在EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路上，因此BMSCs能否促進耐藥癌細胞增殖也值得深入探討。同時選擇CDKN1A和hsa-let-7e-5p驗證測序結(jié)果的準確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后子宮內(nèi)膜癌細胞中的CDKN1A表達上調(diào)，而hsa-let-7e-5p表達下調(diào)，與測序結(jié)果相符。CDKN1A也稱p21，在腫瘤中具有雙重作用。如當DNA損傷時，p53可直接誘導其下游的p21表達，從而使細胞周期阻滯至DNA修復完成［16］。但是也有研究報道，p21可作為致癌因子促進腫瘤遷移、分化［17］。hsa-let-7e-5p屬于miRNA let-7家族的一員。既往研究顯示，let-7e沉默后可激活p21信號，從而抑制卵巢顆粒細胞增殖并增強細胞自噬［18］。還有研究報道，CDKN1A在子宮內(nèi)膜癌中低表達且與不良預后有關，同時可能受LncRNACARLo-5非編碼RNA網(wǎng)絡調(diào)控［19］。本研究在miRNA-mRNA網(wǎng)絡圖中發(fā)現(xiàn)CDKN1A和hsa-let-7e-5p存在潛在靶向關系，因此在子宮內(nèi)膜癌中hsa-let-7e-5p是否通過靶向調(diào)控CDKN1A而發(fā)揮作用值得進一步深入研究。

本研究將子宮內(nèi)膜癌細胞與BMSCs接觸共培養(yǎng)后，癌細胞中mRNA和miRNA的差異表達分析顯示膠原合成關鍵酶P4HA2以及膠原蛋白編碼基因COL4A1、COL4A2等表達上調(diào)，PPI網(wǎng)絡顯示三者存在互作關系，由此推測，BMSCs可能參與了共培養(yǎng)體系中微環(huán)境的調(diào)節(jié)。腫瘤微環(huán)境是由ECM蛋白和內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、免疫細胞和炎癥細胞等構(gòu)成。膠原蛋白是ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以參與ECM重塑而改變腫瘤微環(huán)境，從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［20］。GHOSH等［21］發(fā)現(xiàn)，衰老的間充質(zhì)干細胞可以重塑ECM，從而促進膠原蛋白沉積，進而增強乳腺癌細胞侵襲性。本研究通過GO分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)交集基因參與ECM的構(gòu)成、細胞黏附分子結(jié)合等，提示BMSCs可能通過直接接觸誘導子宮內(nèi)膜癌細胞表達更多的膠原蛋白，從而使ECM硬化，使之更利于子宮內(nèi)膜癌的遷移、侵襲。

綜上所述，本研究基于轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)后子宮內(nèi)膜癌細胞中的上調(diào)基因主要富集在PI3K-Akt、MAPK等信號通路，并參與ECM構(gòu)成等，BMSCs可能通過細胞間的相互作用調(diào)節(jié)腫瘤局部微環(huán)境并促進子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。