沉默G6PD對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響及其作用機(jī)制

陳朝梅 奚敏 施秀 王芳 周金華

作者單位：215024 蘇州 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，難以通過手術(shù)根治［1］。化療是卵巢癌重要的治療選擇，大多數(shù)晚期患者可以從化療中受益［2］。順鉑目前是治療卵巢癌的一線治療藥物，能形成順鉑-DNA結(jié)合物，阻礙DNA復(fù)制，從而引起DNA損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［3］。但是，70%～90%的晚期卵巢癌患者最終因鉑類藥物耐藥復(fù)發(fā)死亡［4］。而且對順鉑耐藥的患者通常對其他化療藥物無反應(yīng)，預(yù)后極差。因此，闡明卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制并逆轉(zhuǎn)其耐藥性成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種高通量的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，可用于識別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，在了解腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用［5-7］。尤其是基于離子強(qiáng)度的、無標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法近年來越來越受歡迎，為從復(fù)雜的生物樣本中分析和識別數(shù)千種蛋白質(zhì)提供了一個強(qiáng)大的工具。本研究利用液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）非標(biāo)記（Label-free）定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了人卵巢癌細(xì)胞中與順鉑耐藥相關(guān)的蛋白葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD），并探討其在卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞A2780由西交利物浦大學(xué)王牧教授贈予。A2780細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.1.2 主要試劑 順鉑注射液購自齊魯制藥有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基以及消化細(xì)胞所用胰酶均購自美國HyClone公司；胰蛋白酶購自美國Promega公司；MTT粉劑、二甲基亞砜、lipid peroxidation（bodypy-c11熒光染料）均購自美國Sigma-Aldriich公司；BCA蛋白定量試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、ROS活性氧檢測試劑盒（DCFH-DA，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯）均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；siRNAG6PD及其陰性對照（siRNA-NC）由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計合成；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；G6PD、GAPDH基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成；抗體G6PD購自上海Abways生物科技有限公司；GAPDH、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自武漢ABclonal生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI雙染試盒購自美國BD Bioscience公司；丙二醛（MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

通過低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP。首先將對數(shù)生長期的親代人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞A2780接種至6孔板中，用含0.5μg/mL順鉑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，PBS洗滌后更換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞穩(wěn)定生長后以同濃度順鉑再次處理。2周后，順鉑逐漸增加至1μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2周；按照相同步驟，將順鉑濃度逐漸升至2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，直至細(xì)胞能在10μg/mL順鉑濃度中穩(wěn)定生長并重復(fù)傳代，即視為順鉑耐藥細(xì)胞A2780/CDDP。

A2780/CDDP細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中同時添加2μg/mL順鉑以維持細(xì)胞對順鉑的耐藥性。將A2780/CDDP細(xì)胞按1×105/孔接種于6孔板中，按照Lipofectamine 3000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書方法，分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-G6PD，并依次記為NC組和siG6PD組，轉(zhuǎn)染24 h后更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.3 Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)法檢測A2780和A2780/CDDP細(xì)胞中的耐藥相關(guān)差異表達(dá)蛋白

A2780和A2780/CDDP細(xì)胞經(jīng)8 M尿素超聲裂解后，提取總蛋白，在56℃下用5 mmol/L二硫醚醇（DTT）處理30 min，室溫下用11 mmol/L碘乙酰胺（IAA）在黑暗中烷基化15 min。根據(jù)BCA試劑盒說明書方法對裂解的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)估算。從所有細(xì)胞系中提取等量的蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶于37℃下消化12～14 h后，真空干燥并儲存?zhèn)溆谩?/p>

采用納升流速Easy-nLC 1000色譜系統(tǒng)分離酶解后的肽段。A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。每個樣品由自動進(jìn)樣器上樣到捕集柱（nanoviper 15 cm，2μm magic C18），再經(jīng)過分析柱［nanoviper 25 cm（75μm silica capillary，3μm magic C18）］分離，色譜柱以95%的A液平衡，流速為300 nL/min，5%～30%B液線性梯度洗脫120 min。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后，用LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀（Thermofisher，USA）進(jìn)行質(zhì)譜分析，過柱時長120 min，離子化后均帶一個單位正電荷；母離子掃描范圍為300～2 000 m/z。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)采用MaxQuant v1.6.7.0處理。根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫，比對每個肽段的MS譜，鑒定和定量相應(yīng)的蛋白。蛋白鑒定和定量分析的置信度閾值設(shè)為＞99%，F(xiàn)DR（false discovery rate）＜1%?；贛axQuant置信度評分進(jìn)行蛋白鑒定。在隨后的相對定量分析中，所有比率采用log2FC＞0.75或＜-0.75倍臨界值（P＜0.05），以減少識別蛋白上調(diào)或下調(diào)時出現(xiàn)的假陽性率［8］。

1.4 卵巢癌耐藥相關(guān)差異表達(dá)蛋白的功能富集分析

應(yīng)用R語言（4.1.1版本）的clusterProfiler程序包對上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)蛋白分別進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，并通過ggplot2包繪制條形圖。上調(diào)/下調(diào)差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果均以FDR調(diào)整的P值＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 RT-qPCR檢測G6PD mRNA表達(dá)

用Trizol試劑提取A2780和A2780/CDDP細(xì)胞中的總RNA，NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測RNA的純度、濃度，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用ChamQ Universal SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR實驗。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min、60℃ 30 s、72℃ 10 min，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)水平。引物序列：G6PD上游引物為5'-AAGAGCTTTTCCAGGGCGAT-3'，下游引物為5'-CGATGAAGGTGTTTTCGGGC-3'；GAPDH上游引物為5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.6 Western blot檢測G6PD蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，按照BCA法檢測蛋白濃度，然后上樣、SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗G6PD（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育過夜；加入鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜后，利用超敏ECL底物在凝膠成像系統(tǒng)上顯影，以GAPDH為內(nèi)參分析G6PD蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 MTT檢測細(xì)胞的增殖能力

A2780、A2780/CDDP細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后的NC組和siG6PD組細(xì)胞均以1 500/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞均加入不同濃度梯度的順鉑，其中加入A2780、A2780/CDDP細(xì)胞的順鉑濃度梯度依次為0μg/mL、3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL，NC組和siG6PD組細(xì)胞依次為0μg/mL、3.75μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL、30.00μg/mL、60.00μg/mL，然后均繼續(xù)培養(yǎng)48 h；之后加入15μL的5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜，次日用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光度，以觀察A2780、A2780/CDDP細(xì)胞的耐藥情況以及沉默G6PD后細(xì)胞對順鉑的敏感性。

1.8 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

收集NC組和siG6PD組細(xì)胞，300 g離心5 min后，用100μL緩沖液重懸，然后按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書的操作步驟，每個樣品分別加入2.5μL FITC和2.5μL PI，孵育30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。另通過前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL順鉑分別處理NC組和siG6PD組細(xì)胞后，5μg/mL和15μg/mL順鉑作用下兩組細(xì)胞的凋亡率無明顯差異，故選擇10μg/mL順鉑處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。用10μg/mL順鉑處理NC組和siG6PD組細(xì)胞24 h，并記為NC+CDDP組和siG6PD+CDDP組，收集細(xì)胞，然后按照上述步驟檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.9 鐵死亡相關(guān)物質(zhì)ROS、MDA、GSH和脂質(zhì)過氧化物水平的檢測

用10μg/mL順鉑分別干預(yù)A2780細(xì)胞、A2780/CDDP細(xì)胞以及NC組和siG6PD組細(xì)胞24 h后，各組約收集1×106個細(xì)胞于離心管中并用PBS緩沖液洗滌3次，收集沉淀，分別用 10μmol/L DCFH-DA、2.5μmol/L bodypy-c11熒光染料重懸細(xì)胞，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30～40 min，用PBS緩沖液洗滌后，上流式細(xì)胞儀分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS和內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。另各收集每組細(xì)胞約1×106個，按照MDA測定試劑盒操作步驟測定MDA含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)含量歸一化；再按照GSH檢測試劑盒操作步驟測定GSH含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Bonferroni檢驗進(jìn)行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP

MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度（3.13μg/mL、6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL）順鉑對A2780、A2780/CDDP細(xì)胞存活均有抑制作用，且細(xì)胞存活率隨著順鉑藥物濃度增加而逐漸下降，但在相同濃度順鉑的作用下，A2780/CDDP細(xì)胞存活率均明顯高于A2780細(xì)胞（P=0.031、0.027、0.007、0.003、0.019）。A2780/CDDP細(xì)胞的IC50值也顯著高于A2780細(xì)胞［（28.727±3.184）μg/mL vs（5.503±0.412）μg/mL，P=0.005］，說明卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 不同濃度順鉑對A2780、A2780/CDDP細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of cisplatin on the viability of A2780 and A2780/CDDP cells

2.2 卵巢癌耐藥相關(guān)差異表達(dá)蛋白的鑒定及功能富集分析

從A2780、A2780/CDDP細(xì)胞中分別提取5份重復(fù)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行Label-free LC/MS分析，結(jié)果共鑒定出1 515個蛋白，其中差異蛋白共197個。與A2780細(xì)胞相比，A2780/CDDP細(xì)胞中有95個上調(diào)蛋白和102個下調(diào)蛋白，上調(diào)蛋白中以G6PD表達(dá)差異最為顯著。進(jìn)一步利用GO功能注釋分析和KEGG信號通路分析差異表達(dá)蛋白的主要功能及相關(guān)信號通路，結(jié)果顯示上調(diào)蛋白（如G6PD、GCLM、STT3B等）和下調(diào)蛋白（如MIF、PDHA1等）大多富集在代謝通路，其功能主要與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、核糖磷酸代謝途徑相關(guān)，見圖2。因此，后續(xù)實驗選擇細(xì)胞中重要的代謝相關(guān)蛋白G6PD進(jìn)行研究。

圖2 卵巢癌耐藥相關(guān)差異表達(dá)蛋白的功能富集分析Fig.2 Functional enrichment analysis of differentially expressed proteins associated with drug resistance in ovarian cancer

2.3 G6PD在A2780/CDDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，A2780/CDDP細(xì)胞中 G6PD mRNA（5.101±0.625 vs 1.002±0.087，P=0.010）和蛋白（3.403±0.198 vs 1.001±0.065，P=0.002）的相對表達(dá)量明顯高于A2780細(xì)胞。見圖3A～B。此外，不同濃度（2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL）順鉑處理A2780細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞中G6PD蛋白的表達(dá)水平均高于對照組（P=0.006，＜0.001，0.002，0.005，0.008），且G6PD表達(dá)量隨順鉑濃度的增加而上升。見圖3C。

圖3 G6PD在順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP中表達(dá)上調(diào)Fig.3 Expression of G6PD was up-regulated in cisplatin-resistant cell line A2780/CDDP

2.4 沉默G6PD可增強(qiáng)A2780/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性

Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，siG6PD組中G6PD蛋白表達(dá)量顯著降低（0.251±0.045 vs 1.031±0.067，P=0.001），表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。見圖4A。

MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度（3.75μg/mL、7.50 μg/mL、15.00μg/mL、30.00μg/mL、60.00μg/mL）順鉑對NC和siG6PD組細(xì)胞存活均有抑制作用，且隨著藥物濃度增加，相應(yīng)的細(xì)胞存活率逐漸下降；但在相同濃度順鉑作用下，siG6PD組細(xì)胞存活率均明顯低于NC組（P=0.001，0.017，0.015，0.008，0.019）。siG6PD組的IC50值也顯著低于NC組［（15.298±1.165）μg/mL vs（23.476±2.378）μg/mL，P=0.012］。見圖4B。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，siG6PD組的細(xì)胞凋亡率明顯升高［（10.270±0.360）%vs（8.130±0.210）%，P=0.006］；進(jìn)一步用10 μg/mL順鉑處理24 h后，siG6PD+CDDP組的細(xì)胞凋亡率高于NC+CDDP組［（13.650±0.580）%vs（10.660±0.410）%，P=0.008］。見圖4C～D。

圖4 沉默G6PD可增強(qiáng)A2780/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性Fig.4 Silencing G6PD increased the sensitivity of A2780/CDDP cells to cisplatin

2.5 沉默G6PD增加A2780/CDDP細(xì)胞鐵死亡水平

與A2780細(xì)胞相比，A2780/CDDP細(xì)胞鐵死亡相關(guān)物質(zhì)ROS、MDA和脂質(zhì)過氧化物水平均降低（P=0.002，0.008，0.041），但GSH水平升高（P=0.001），見圖5A～D；而沉默G6PD后，A2780/CDDP細(xì)胞中ROS、MDA和脂質(zhì)過氧化物水平均較NC組升高（P=0.006，0.044，0.045），但GSH水平降低（P=0.007），見圖5E～H。

圖5 沉默G6PD增加A2780/CDDP細(xì)胞中的鐵死亡水平Fig.5 Silencing G6PD evoked ferroptosis in A2780/CDDP cells

3 討論

順鉑是治療卵巢癌有效的化療藥物之一，鉑類藥物化療的初始反應(yīng)率高達(dá)80%，但在大多數(shù)晚期患者中，最終會因獲得性耐藥導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡［9］。研究表明，卵巢癌在順鉑的反復(fù)作用下，通過改變耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞凋亡減少，DNA修復(fù)功能增強(qiáng)，細(xì)胞生長、分化和增殖加快，從而抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生耐藥［10］。卵巢癌順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制涉及多種蛋白，但目前尚未完全闡明［11-12］。本研究通過Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)法鑒定卵巢癌敏感細(xì)胞A2780和耐藥細(xì)胞A2780/CDDP中異常表達(dá)的蛋白，發(fā)現(xiàn)與A2780細(xì)胞相比，A2780/CDDP細(xì)胞中共有95個上調(diào)蛋白和102個下調(diào)蛋白，其中上調(diào)蛋白中以G6PD表達(dá)差異最為顯著；信號通路分析結(jié)果顯示這些差異蛋白主要富集在代謝通路中。提示卵巢癌順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制與代謝相關(guān)。G6PD是所有細(xì)胞中重要的代謝相關(guān)蛋白之一，其作為磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，可以產(chǎn)生NADPH以維持還原型GSH，而GSH可清除ROS以保護(hù)癌細(xì)胞免受氧化損傷。也有研究表明，細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性與細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡密切相關(guān)［13］。由此推測，G6PD可能與卵巢癌順鉑耐藥有關(guān)。為此，本研究通過siRNA技術(shù)構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/CDDP，并檢測G6PD在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G6PD mRNA和蛋白表達(dá)在A2780/CDDP細(xì)胞中明顯升高，與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果相符。進(jìn)一步用不同濃度順鉑處理A2780細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)G6PD表達(dá)量隨著順鉑濃度的增加而上升，但在沉默G6PD后的A2780/CDDP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率及順鉑的IC50值均明顯降低，而細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明G6PD上調(diào)可誘導(dǎo)卵巢癌順鉑耐藥，而沉默G6PD可增強(qiáng)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。這一現(xiàn)象在紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞中也被觀察到，表現(xiàn)為抑制G6PD表達(dá)可逆轉(zhuǎn)對紫杉醇的耐藥性［14］。

鐵死亡是一種新的細(xì)胞死亡形式，其特征是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化［15］。ROS和MDA是特異的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，也被視為鐵死亡標(biāo)志物。既往研究顯示，細(xì)胞中的ROS、MDA、脂質(zhì)過氧化物以及GSH含量可以反映細(xì)胞中的鐵死亡水平，其中ROS、MDA、脂質(zhì)過氧化物是氧化性物質(zhì)，與鐵死亡水平呈正相關(guān)，而GSH是還原性物質(zhì)，與鐵死亡的水平呈負(fù)相關(guān)［16］。鐵死亡一般在特定的病理狀態(tài)下被激活，其失調(diào)與神經(jīng)退行性變、腎功能衰竭和肺損傷等多種生理和病理過程有關(guān)［17-18］。誘導(dǎo)鐵死亡也可能有助于發(fā)現(xiàn)新的癌癥治療策略［19］，尤其在逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥中表現(xiàn)出巨大的潛力，目前已發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞都表現(xiàn)為更低的鐵死亡水平［16，20］。在順鉑處理的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)G6PD能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和ROS積累［21］。同樣，高表達(dá)的HMGA1激活G6PD轉(zhuǎn)錄后，可促進(jìn)磷酸戊糖途徑，提供NADPH和dNTP以對抗順鉑誘導(dǎo)的ROS和DNA損傷［22］。近期也有研究發(fā)現(xiàn)G6PD在肝癌中高表達(dá)且可抑制肝癌細(xì)胞中的鐵死亡水平并促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［23］。為進(jìn)一步探索鐵死亡與卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系，本研究在A2780/CDDP細(xì)胞中檢測鐵死亡相關(guān)物質(zhì)的水平，結(jié)果該耐藥細(xì)胞也表現(xiàn)出較低水平的ROS、MDA和脂質(zhì)過氧化以及較高水平的GSH，說明卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中存在較低的鐵死亡水平；但是沉默G6PD后，A2780/CDDP細(xì)胞表現(xiàn)為ROS、MDA和脂質(zhì)過氧化物水平升高，GSH水平降低，說明沉默G6PD表達(dá)可增加A2780/CDDP細(xì)胞中的鐵死亡水平。

綜上所述，G6PD在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/CDDP中表達(dá)上調(diào)，沉默G6PD可能通過增加耐藥細(xì)胞中鐵死亡水平從而增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑的敏感性，這一結(jié)果為逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供了新的思路。同時，信號通路分析結(jié)果顯示這些差異蛋白主要富集在代謝通路中，因此靶向鐵代謝可能是逆轉(zhuǎn)卵巢癌治療耐藥性的新治療策略。但本研究僅在細(xì)胞層面進(jìn)行探索，G6PD確切的作用及其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗證。