橄欖苦苷對(duì)缺血再灌注大鼠心肌應(yīng)激性炎癥損傷的保護(hù)作用①

曹位平 郭建淑 馮文靜 鐘元緣 宋雷英 陳 明 （樂(lè)山市人民醫(yī)院心內(nèi)科，樂(lè)山 614000）

心肌缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI）是急性心肌梗死患者恢復(fù)冠狀動(dòng)脈正常血流灌注時(shí)，心肌組織損傷加重的病理過(guò)程，常發(fā)生于心內(nèi)直視手術(shù)、冠狀動(dòng)脈介入治療等術(shù)后［1］。既往研究顯示，I/RI的發(fā)生與大量釋放的炎癥介質(zhì)、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡等有關(guān)［2-3］。缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）過(guò)程中持續(xù)的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致心肌組織損傷，誘導(dǎo)心室重塑、左室功能障礙［4］。目前，臨床醫(yī)師主要采用抗炎、抗氧化、改善能量代謝等相關(guān)藥物治療，具有一定療效，但仍有部分患者治療效果并不理想［5］。橄欖苦苷（oleuropein，Ole）是從天然植物油橄欖葉中提取的一種有效活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗細(xì)菌和抗病毒作用［6］。既往研究顯示，Ole可抑制I/RI大鼠的心肌組織炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織損傷，但其具體作用機(jī)制尚不明確［7］。因此，本研究分析Ole減輕大鼠I/RI的作用及可能的作用機(jī)制，旨在為其臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（型號(hào)Bx50F4）購(gòu)自日本Olympus公司；生物機(jī)能測(cè)量?jī)x（BL-420F型）購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；彩色多普勒超聲便攜儀（GE VividⅠ型）購(gòu)自美國(guó)GE公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-17AIC）購(gòu)自日本SANYO公司。

1.1.2 主要試劑 Ole購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司，純度99.95%，大鼠推薦劑量40 mg/kg，p.o.；依達(dá)拉奉（edaravone，EDA）購(gòu)自山東新華制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20203037；肌酸激酶同工酶（creatinekinase Mb，CK-Mb，貨號(hào)：B20113）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（Cardiac troponinⅠ，cTnⅠ，貨號(hào)：1535721445）、乳 酸 脫 氫 酶（lactic dehydrogenase，LDH，貨 號(hào)：B20632）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST，貨號(hào)：1529778953）均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，貨號(hào)：EY-5082）、谷胱甘肽（glutathione，GSH，貨號(hào)：EY-5214）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，貨號(hào)：EY-elisa5989）、TNF-α（貨號(hào)：EYelisa-1775）ELISA試劑盒購(gòu)自上海一研生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R6688-01）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：K1622）購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；引物由上海生工生物工程合成；兔抗鼠IL-10、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α抗體和辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（260±20）g，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（川）2018-15，飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室（室溫恒定25℃，模擬晝夜光照），自由攝食與飲水。

48只大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，參考已有文獻(xiàn)采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法制備I/RI模型［8］。大鼠常規(guī)麻醉，打開(kāi)胸腔和心包后，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處，采用線栓結(jié)扎距離冠狀動(dòng)脈左前降支下緣2 mm處，缺血30 min后打開(kāi)線栓，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈的血流灌注，關(guān)閉心包和胸腔，心電圖顯示結(jié)扎后ST段下降1/2以上視為造模成功。隨后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（對(duì)照組只打開(kāi)胸腔和心包，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈）、I/RI組、Ole組和EDA組（陽(yáng)性對(duì)照組），每組12只。

1.2.2 動(dòng)物給藥干預(yù) 恢復(fù)灌注即刻，Ole組大鼠灌胃劑量為40 mg/（kg·d）的Ole，連續(xù)灌胃14 d；EDA組腹腔注射劑量為6 mg/（kg·d）的EDA。對(duì)照組和模型組分別灌胃給予等體積生理鹽水。

1.2.3 大鼠心功能檢測(cè) 造模15 d，采用生物機(jī)能測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠心率（heart rate，HR）和左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）；采用彩色多普勒超聲便攜儀檢查左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）。

1.2.4 標(biāo)本采集 分別于造模第1、3、6、9、12和15天，經(jīng)眼球靜脈叢取血100μl，3 000 r/min離心10 min，取血清，-20℃冰箱保存用于血清TNF-α檢測(cè)。造模第15天，分離腹主動(dòng)脈血1 ml，3 000 r/min離心10 min，取血清，-20℃冰箱保存用于血清CKMb、LDH、cTnⅠ和AST檢測(cè)。取血后，再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，經(jīng)頸靜脈注入2 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的伊文思藍(lán)溶液，待大鼠口唇及肢體變藍(lán)，分離左心室組織，切片，進(jìn)行TTC染色，經(jīng)Image-pro Plus軟件分析心肌梗死面積。分離心臟，一部分采用4%多聚甲醛固定，另一部分于-80℃冰箱保存。

1.2.5 HE染色檢測(cè)心肌病理 取甲醛固定的心肌組織，進(jìn)行常規(guī)切片，采用HE染色，中性樹(shù)膠封片，生物光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理變化。

1.2.6 血清中細(xì)胞因子的測(cè)定 造模第15天，采用免疫抑制法檢測(cè)血清CK-MB水平，乳酸底物法檢測(cè)血清LDH水平，膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)血清cTnⅠ水平，天門(mén)冬氨酸底物法檢測(cè)血清AST水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。分別于造模第1、3、6、9、12和15天，ELISA法測(cè)定血清TNF-α水平。

1.2.7 心肌組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的測(cè)定 造模15 d，取暫存于-80℃冰箱的心肌組織，勻漿，取上清，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)上清中SOD水平，二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH水平，硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)MDA水平。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè)心肌組織iNOS和IL-10 mRNA表達(dá) 從-80℃冰箱中取出心肌組織，勻漿，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)iNOSmRNA（正向引物：5'-CAGAAATGTTCCAGCATATCT-3'，反向引物：5'-GACCTGATGTTGCCACTGTT-3'）和IL-10 mRNA（正向引物：5'-ACCTGGTAGAAGTGATGCC-3'，反向引物：5'-CAAGGAGTTGTTTCCGTTA-3'）水平，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 Western blot檢測(cè)心肌組織iNOS和IL-10蛋白表達(dá) 取暫存于-80℃冰箱的心肌組織，勻漿，提取總蛋白，依次進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，洗膜并加入iNOS（1∶500）和IL-10（1∶500）一抗，以β-actin（1∶500）為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，洗膜加二抗室溫孵育2 h，顯像，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量。

1.2.10 H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS和IL-10蛋白表達(dá) 大鼠心肌細(xì)胞H9C2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為正常細(xì)胞對(duì)照組、H2O2組（模型組）、Ole組和EDA組（陽(yáng)性對(duì)照組）。H2O2組、Ole組和EDA組分別加入100μmol/LH2O2，對(duì)照組加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中處理2 h。Ole組加入40μg/ml Ole，EDA組加入6μg/ml的EDA，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)照組和H2O2組加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。收集細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)各組TNF-α（1∶500）、iNOS（1∶500）和IL-10（1∶500）蛋白表達(dá)。

1.2.11 LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS和IL-10蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞分為正常細(xì)胞對(duì)照組、LPS組（模型組）、Ole組和EDA組（陽(yáng)性對(duì)照組）。LPS組、Ole組和EDA組細(xì)胞分別加入10μmol/L LPS，對(duì)照組加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中處理2 h。Ole組加入40μg/ml Ole，EDA組加入6μg/ml的EDA，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)照組和LPS組加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。收集細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞TNF-α、iNOS和IL-10蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料均以±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異性，SNK-q比較多組兩兩間差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ole改善I/RI大鼠心肌心功能 I/RI組大鼠HR、LVSP、LVEF、FS水平低于對(duì)照組（P＜0.05）；Ole組和EDA組大鼠HR、LVSP、LVEF、FS水平高于I/RI組（P＜0.05）；Ole組 和EDA組 大 鼠HR、LVSP、LVEF、FS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Ole改善I/RI大鼠心肌心功能Fig.1 Ole improved cardiac function in I/RI rats

2.2 Ole減輕I/RI大鼠心肌組織病理?yè)p傷 I/RI大鼠心肌組織TTC染色肉眼可見(jiàn)I/RI組大鼠心肌梗死面積明顯大于對(duì)照組，Ole組和EDA組大鼠心肌梗死面積小于I/RI組（圖2A）。經(jīng)HE染色后，生物光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠心肌組織細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯異常，I/RI組大鼠心肌組織細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維斷裂，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ole組和EDA組大鼠心肌組織病變明顯減輕，Ole組和EDA組大鼠心肌組織病變無(wú)明顯差異（圖2A）。I/RI組大鼠血清CK-Mb、LDH、cTnⅠ和AST水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；Ole組和EDA組大鼠血清CK-Mb、LDH、cTnⅠ和AST水平均低于I/RI組（P＜0.05）；Ole組和EDA組間大鼠血清CK-Mb、LDH、cTnⅠ和AST水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2B～E。

圖2 Ole減輕I/RI大鼠心肌組織病理?yè)p傷（×200）Fig.2 Ole alleviates pathological injury of myocardial tissue in I/RI rats（×200）

2.3 Ole降低I/RI大鼠血清TNF-α水平 與造模第1天相比，I/RI組、Ole組和EDA組大鼠在造模第3天血清TNF-α水平升高（P＜0.05）；與造模第3天相比，Ole組和EDA組在造模第9、12和15天血清TNF-α水平降低（P＜0.05）；Ole組和EDA組大鼠血清TNF-α水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠血清TNF-α水平Fig.3 Levels of serum TNF-αof rats in each group

2.4 Ole對(duì)I/RI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 I/RI組大鼠心肌組織SOD和GSH水平低于對(duì)照組（P＜0.05），MDA、iNOS mRNA和蛋白、IL-10 mRNA和蛋白水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；Ole組和EDA組大鼠心肌組織SOD、GSH和IL-10表達(dá)水平高于I/RI組（P＜0.05），MDA和iNOS表達(dá)水平均低于I/RI組（P＜0.05）；Ole組和EDA組大鼠心肌組織SOD、GSH、MDA、iNOS、IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Ole對(duì)I/RI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of Ole on oxidative stress and inflammation in myocardial tissue of I/RI rats

2.5 Ole對(duì)H2O2和LPS損傷的心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10蛋白表達(dá)的影響 H2O2組心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），Ole組和EDA組心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS蛋白表達(dá)水平低于H2O2組（P＜0.05），IL-10蛋白表達(dá)水平高于H2O2組（P＜0.05）。LPS組心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），Ole組和EDA組心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS蛋白表達(dá)水平低于LPS組（P＜0.05），IL-10蛋白表達(dá)水平高于LPS組（P＜0.05）；Ole組和EDA組心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 Ole對(duì)H 2O2和LPS損傷的心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Ole on expressions of TNF-α，iNOSand IL-10 protein in H 2O2 and LPS-injured cardiomyocytes

3 討論

I/RI是一種臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程，常見(jiàn)于溶栓、介入等治療后，臨床尚缺乏特效治療藥物。Ole屬于裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、降血壓等多種藥理學(xué)作用，有望應(yīng)用于臨床I/RI的治療［9-10］。依達(dá)拉奉是一種具有抗炎、抗氧化、改善I/RI作用的藥物，目前已廣泛應(yīng)用于臨床I/RI的治療［11］。因此，本研究以依達(dá)拉奉為陽(yáng)性對(duì)照，探討Ole對(duì)I/RI大鼠的保護(hù)作用。HR、LVSP、LVEF和FS是臨床常用的反映機(jī)體生命體征和心功能的指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，I/RI組大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS水平明顯降低，而經(jīng)Ole干預(yù)后，大鼠HR、LVSP、LVEF、FS水平明顯升高，且其HR、LVSP、LVEF、FS升高水平與EDA干預(yù)無(wú)明顯差異。提示Ole可改善心肌I/RI大鼠的生命體征和心功能，其效果與EDA無(wú)明顯差異。本研究觀察到I/RI組大鼠心肌梗死面積和心肌組織病理?yè)p傷明顯增加，血清CK-MB、LDH、cTnⅠ和AST水平明顯升高，而經(jīng)Ole干預(yù)后，大鼠心肌梗死面積和心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕，血清CK-MB、LDH、cTnⅠ和AST水平明顯降低。CK-MB、LDH、cTnⅠ和AST廣泛分布于心肌組織中，為心肌損傷的重要標(biāo)志物，一旦心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，可以釋放到血液中，使其在血液中的濃度迅速升高［12-13］。JIN等［14］研究顯示，Ole可改善血液微循環(huán)，抑制心肌組織炎癥反應(yīng)，減輕心肌I/RI損傷，本研究結(jié)果與其相似。提示Ole可減輕I/RI大鼠心肌組織損傷，改善心功能，有望應(yīng)用于臨床治療。

本研究觀察到，與大鼠I/RI造模第1天相比，I/RI模型組和Ole組大鼠在造模第3天血清TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，隨著觀察的時(shí)間延長(zhǎng)，I/RI組大鼠血清TNF-α水平始終維持高水平，而Ole組大鼠在造模第9、12和15天血清TNF-α水平逐步下降，明顯低于I/RI組。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激單核巨噬細(xì)胞合成并分泌大量炎癥介質(zhì)，還可激活死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞凋亡，在I/R的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。HUANG等［16］研究顯示，TNF-α可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與心肌I/R過(guò)程中的多種病理反應(yīng)。研究結(jié)果表明，Ole可抑制TNF-α的合成與釋放，減輕心肌組織損傷。SOD和GSH是機(jī)體重要的抗氧化酶，可清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基（reactive oxide species，ROS），對(duì)維持氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡具有重要作用，MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物，可以敏感地反映體內(nèi)的ROS水平［17-18］。已有多項(xiàng)研究顯示，I/R早期內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞可產(chǎn)生大量ROS，直接對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，引起心肌組織細(xì)胞損傷，還可攻擊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，激活中性粒細(xì)胞和NF-κB，釋放大量的TNF-α，加重心肌組織炎癥性損傷［19-20］。本研究觀察到I/RI組大鼠的SOD和GSH水平明顯降低，MDA明顯升高，經(jīng)Ole干預(yù)后，SOD和GSH水平明顯升高，MDA明顯降低。表明Ole可降低心肌I/RI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織損傷。CHEN等［21］研究顯示，大量釋放的TNF-α還可激活黃嘌呤氧化酶，促進(jìn)ROS產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，加重心肌組織損傷，甚至導(dǎo)致心室重塑。

iNOS是合成NO的關(guān)鍵限速酶，I/R早期釋放的大量炎癥因子TNF-α等可刺激巨噬細(xì)胞分泌大量iNOS，并活化產(chǎn)生大量的NO，誘導(dǎo)能量代謝障礙、ROS產(chǎn)生，加重I/R損傷［22］。IL-10是機(jī)體重要的免疫和炎癥抑制因子，可拮抗TNF-α、iNOS等促炎因子的產(chǎn)生［23］。本研究發(fā)現(xiàn)I/RI組大鼠心肌組織iNOS和IL-10表達(dá)明顯升高，經(jīng)Ole干預(yù)后，iNOS表達(dá)明顯降低，IL-10表達(dá)明顯升高。提示Ole可減輕心肌組織炎癥性損傷。H2O2和LPS均可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-10蛋白表達(dá)水平升高，Ole干預(yù)后，心肌細(xì)胞TNF-α、iNOS蛋白表達(dá)明顯降低，IL-10蛋白表達(dá)明顯升高。H2O2和LPS可分別模擬I/R時(shí)期的氧化應(yīng)激損傷和炎癥性損傷［24-25］。LIU等［26］研究顯示，H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量ROS，激活炎癥因子釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果表明，Ole可能通過(guò)抗氧化作用清除I/R時(shí)期釋放的ROS，從而抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織細(xì)胞損傷。

綜上所述，Ole通過(guò)提高I/RI大鼠的抗氧化酶活性，清除再灌注早期釋放的大量ROS，抑制心肌組織的炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織細(xì)胞損傷，改善心功能。