MicroRNA-31-3p靶向調(diào)控Sema4C表達(dá)對(duì)宮頸癌順鉑耐藥性的作用及其機(jī)制研究*

張華章，黎婧，劉智慧

[華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）婦一科，湖北 武漢 430019]

宮頸癌是排第4 位的女性常見癌癥，也是女性第二癌癥致死原因，女性中發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]。臨床上，手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療（以下簡(jiǎn)稱化療）已被廣泛用于提高宮頸癌患者的生存率。但由于原發(fā)性和繼發(fā)性化療耐藥的產(chǎn)生，晚期宮頸癌患者的5 年生存率仍然很低。深入研究宮頸癌患者化療耐藥發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，有利于提高預(yù)后水平。大量研究表明，microRNA（miRNA）在腫瘤細(xì)胞進(jìn)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和轉(zhuǎn)移[2]。MicroRNA-31-3p（miR-31-3p）在多種癌癥組織中異常表達(dá)，如結(jié)腸癌[3]、口腔癌[4]和腦膠質(zhì)瘤[5]。miR-31-3p 在宮頸癌中低表達(dá)，并且通過Mirbase 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)Sema4C 是miR-31-3p 的靶基因。有研究證明，Sema4C 可調(diào)節(jié)宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及對(duì)順鉑化療的敏感性，但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚[6-7]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人宮頸癌細(xì)胞系Hela、人正常宮頸細(xì)胞系、RPMI 1640 培養(yǎng)液、PCR 引物購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司，PCR 試劑盒（濟(jì)南諾維贊生物科技有限公司），miR-31-3p mimics（廣州銳博科技有限公司），Sema4C 過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司），LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、CCK-8試劑（日本東仁化學(xué)科技有限公司），抗Sema4C、GAPDH、山羊抗兔IgG HRP二級(jí)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（Step One Plus）、多功能酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)、-80℃冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京六一儀器廠，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人宮頸癌細(xì)胞Hela 和人正常宮頸細(xì)胞放入RPMI 1640 培養(yǎng)液，內(nèi)含10% FBS，100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)液放置于37℃、5%二氧化碳增濕培養(yǎng)箱中。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞均勻接種在6孔板中。將Opti-MEM培養(yǎng)基預(yù)混LipofectamineTM3000 試劑，分別轉(zhuǎn)染 m iR-31-3p mimics（miR-31-3p mimics 組）、空白質(zhì)粒（對(duì)照組），以及在轉(zhuǎn)染miR-31-3p mimics 的基礎(chǔ)上過表達(dá) Sema4C（miR-31-3p mimics＋Sema4C 組）10～15 min，繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3 d，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-31-3p的表達(dá) 分離并純化Hela 細(xì)胞、人正常宮頸細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系：SYBER Green Mix 10 μL、正反向引物（10 μ mol/L）各 0 .5 μ L、cDNA 2 μL、H2O 2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性45 s，62℃退火 4 5 s，72℃延伸 1 min，共 4 0 個(gè)循環(huán)，60℃繼續(xù)延伸 2 5 min。以U6為內(nèi)參基因，2-ΔΔct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting 檢測(cè)Sema4C 蛋白的表達(dá) 收集Hela 細(xì)胞并在RIPA 緩沖液中溶解。使用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。BSA 封閉后，用抗Sema4C 和GAPDH 的一抗孵育，山羊抗兔IgG HRP 的二抗（1∶2 000）處理?xiàng)l帶，并使用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)檢測(cè)條帶。

1.3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞吸光度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期miR-31-3p mimics 組、對(duì)照組、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Hela 細(xì)胞，消化分離并加入完全培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液，種植于96 孔板中，每孔約3 000個(gè)細(xì)胞。按比例配制 1 μ mol/L、2 μ mol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L 順鉑。取出兩組原有培養(yǎng)基，加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，細(xì)胞在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基，配制CCK-8 工作液，每孔加入100 μL CCK-8 溶液，細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～5 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 和Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞中miR-31-3p的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，Hela細(xì)胞與人正常宮頸細(xì)胞miR-31-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.43±0.32）和（1.06±0.12），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.193，P=0.033），Hela細(xì)胞miR-31-3p低于人正常宮頸細(xì)胞。

2.2 miR-31-3p靶向調(diào)控Sema4C的表達(dá)

利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-31-3p 可靶向結(jié)合Sema4C基因（見圖1）。qRT-PCR 結(jié)果表明，對(duì)照組、miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C組 miR-31-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.05±0.32）、（2.11±0.49）和（2.08±0.32），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.280，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié) 果 ：miR-31-3p mimics 組 、miR-31-3p mimics+Sema4C 組 miR-31-3p 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）；miR-31-3p mimics 組 與 miR-31-3p mimics+Sema4C 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 miR-31-3p靶向結(jié)合Sema4C基因

對(duì) 照 組 、miR-31-3p mimics 組 、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Sema4C 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.02±0.25）、（0.41±0.24）和（0.66±0.13），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.296，P=0.002）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Sema4C 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05）； miR-31-3p mimics+Sema4C 組 高 于miR-31-3p mimics組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Hela細(xì)胞中Sema4C蛋白的表達(dá)

2.3 不同濃度順鉑作用下各組Hela細(xì)胞生存率比較

CCK-8 法結(jié)果表明，不同濃度順鉑作用下，對(duì)照組、miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C組Hela 細(xì)胞生存率比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較：miR-31-3p mimics 組 H ela 細(xì)胞生存率低于對(duì)照組（P＜0.05）；2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L 順鉑作用下，miR-31-3p mimics+Sema4C 組 H ela 細(xì)胞生存率高于 m iR-31-3p mimics 組（P＜0.05），表明 m iR-31-3p調(diào)控Hela 細(xì)胞鉑類耐藥，過表達(dá)Sema4C 可抑制miR-31-3p 的作用。見表2。

表2 不同濃度順鉑作用下各組Hela細(xì)胞的生存率變化 （%，）

表2 不同濃度順鉑作用下各組Hela細(xì)胞的生存率變化 （%，）

組別對(duì)照組miR-31-3p mimics組miR-31-3p mimics+Sema4C組F 值P 值1 μmol/L順鉑100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 2 μmol/L順鉑95.32±7.63 76.81±7.24 88.23±3.54 10.622 0.002 3 μmol/L順鉑83.58±7.63 66.89±4.38 76.25±3.45 11.755 0.001 4 μmol/L順鉑75.32±7.63 49.86±10.53 65.45±3.45 13.656 0.000 5 μmol/L順鉑63.25±7.24 32.18±2.58 38.23±6.54 39.961 0.000 6 μmol/L順鉑47.86±6.78 27.34±6.21 27.68±5.23 18.510 0.000

3 討論

有研究表明，宮頸癌的發(fā)生與人乳頭狀瘤病毒感染有關(guān)[8]。隨著宮頸癌組織的病理檢查和早期診斷的加強(qiáng)，已顯著降低了該病的發(fā)病率和病死率[9]，但宮頸癌仍然是威脅女性健康的第2 大因素。對(duì)晚期患者，宮頸癌耐藥的產(chǎn)生是限制患者預(yù)后的主要因素之一。目前已有大量關(guān)于宮頸癌的研究，但宮頸癌耐藥發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚。

目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA 在多種腫瘤和其他疾病的診斷、治療及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[10-11]。例如，miR-146a-5p 在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且miR-146a-5p 可能作為一種非侵入性生物標(biāo)志物對(duì)多種腫瘤有靶向治療有用[12]。miR-31-3p編碼基因位于染色體9p21.3，參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。在腦膠質(zhì)瘤中，miR-31-3p 扮演了重要角色，過表達(dá)miR-31-3p 可顯著降低MAD2L1 表達(dá)，并且通過生物信息學(xué)技術(shù)分析得出miR-31-3p 的靶基因涉及細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄及腫瘤等信號(hào)通路[5]。有研究證實(shí)，通過下調(diào)STAT3 的表達(dá)，miR-31-3p 還可抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞增殖和遷移[13]。在結(jié)腸癌中，miR-31-3p 表達(dá)水平可作為西妥昔單抗對(duì)RAS-WT mCRC 患者療效的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物[14]。同樣在結(jié)腸癌中，與miR-31-3p 高表達(dá)患者相比，在預(yù)處理活檢中miR-31-3p 低表達(dá)的患者有更高的總有效率，以及更高無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率[3]。

本研究結(jié)果表明，miR-31-3p 在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，與多種癌癥中的表達(dá)一致；上調(diào)miR-31-3p的表達(dá)可顯著提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了miR-31-3p可靶向調(diào)控Sema4C的表達(dá)，并進(jìn)一步驗(yàn)證miR-31-3p通過靶向調(diào)控Sema4C 的表達(dá)，影響宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。本研究不僅探究miR-31-3p 在宮頸癌順鉑化療中產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，同時(shí)也證實(shí)Sema4C 表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

Sema4C 的高表達(dá)能顯著降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性[7]。更有研究證明，Sema4C 可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。Sema4C 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，也是許多miRNA 的靶點(diǎn)，包括miR-125b、miR-25-3p、miR-205、miR-138 及miR-31。Sema4C 參與EMT 介導(dǎo)的許多惡性腫瘤的化療耐藥，包括乳腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌。miR-125b 在乳腺癌、肺癌中的異常表達(dá)和miR-25-3p 在CC17 中的異常表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)EMT 表型，并通過下調(diào)Sema4C表達(dá)調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展，完全緩解誘導(dǎo)的EMT。有研究證明，Sema4C 可通過p38-MAPK 影響卵巢癌細(xì)胞增殖[15]；在乳腺癌中，Sema4C 在與腫瘤相關(guān)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，可介導(dǎo)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，影響乳腺癌細(xì)胞增殖，還可以作為乳腺癌的重要標(biāo)志物[16-17]；在結(jié)腸癌中，Sema4C 的過度表達(dá)導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移率升高[18]；在腦膠質(zhì)瘤中，Sema4C 的表達(dá)受miR-138 靶向作用，并促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。這些結(jié)果都表明靶向Sema4C 可作為逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的新途徑。

綜上所述，miR-31-3p 通過靶向調(diào)節(jié)Sema4C 的表達(dá)，調(diào)控宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。本研究為宮頸癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。