MicroRNA-137通過Wnt信號通路對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤的作用研究*

高淼，劉莉，關(guān)阿娜，王俊霞

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率與病死率日趨增加[1]。臨床研究顯示，宮頸癌患者一般預(yù)后不良、生存期短，這與其復(fù)雜的發(fā)病機制有關(guān)[2]。因此探究與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物對延長患者生存期、降低病死率具有重要意義。MicroRNA是機體內(nèi)十分重要的非編碼RNA分子，在腫瘤的發(fā)展過程中具有重要作用[3]。本課題組之前的研究[4]發(fā)現(xiàn)，microRNA-137（miR-137）可以靶向調(diào)控Wnt5a，抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，并發(fā)現(xiàn)該作用與抑制Wnt信號通路的活化有關(guān)。分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK1）是Wnt通路的抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7,MMP-7）是Wnt通路下游的重要靶基因，兩者與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。但目前關(guān)于miR-137與MMP-7/DKK1之間關(guān)系的研究較少。因此，本研究通過人宮頸癌細(xì)胞HeLa中過表達(dá)miR-137，以探究其對宮頸癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用，以及其對Wnt上下游通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動物、試劑及儀器

人宮頸癌細(xì)胞HeLa購于上海研一生物科技有限公司。雌性健康BALB/c裸鼠30只，6～8周齡，體重（20±2）g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2020-0003]。Cell Counting試 劑 盒8（WST-8/CCK-8）購 自 英 國Abcam公司，Annexin V/FITC凋亡試劑盒購自北京利維寧生物科技有限公司，兔抗小鼠Wnt、MMP-7、DKK1、一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司，MiRNeasy Mini（r）Kit試劑盒購自德國Qiagen公司，F(xiàn)astKing RT與Super Real PreMix Plus試劑盒購自北京天根生化試劑有限公司。CyFlow Cube6流式細(xì)胞儀購自廣州吉源生物科技有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購自廣州市康恒儀器有限公司，DR-200BC酶標(biāo)儀購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司，BSF-58熒光顯微鏡購自上海巴拓儀器有限公司，Light Cycler 480 qRT-PCR儀購自瑞士羅氏公司，Invitrogen iBright成像系統(tǒng)購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染

將人宮頸癌細(xì)胞HeLa 按照常規(guī)方法復(fù)蘇，以1×105個接種在6孔板中，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨機分為3組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。以miR-137-mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為miR-137組，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為NC組，只加入等量轉(zhuǎn)染試劑不做其他處理為空白組，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。3組轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

用胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并處于對數(shù)生長期的3組細(xì)胞，以2×103個的密度接種于96孔板繼續(xù)孵育，分別于12 h、24 h、48 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在37℃下孵育2 h。采用DR-200BC酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

用胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且處于對數(shù)生長期的3組細(xì)胞，短暫離心后用PBS吹打沉淀呈細(xì)胞懸液，每組取300 μL，加入5 μL Annexin V/FITC和PI，混合均勻后，室溫下放置15 min，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1、miR-137 mRNA相對表達(dá)量

使用MiRNeasy Mini（r）Kit試劑盒提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的mRNA，用FastKing RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Super Real PreMix Plus試劑盒擴增進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min（1個循環(huán)）；PCR擴增反應(yīng)條件：95℃10 s，60℃20 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。引物序列見表1。β-actin為Wnt、MMP-7、DKK1的內(nèi)參基因，U6為miR-137的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 Western blotting檢測Wnt、MMP-7、DKK1蛋白相對表達(dá)量

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法分析并測定蛋白質(zhì)濃度。各提取好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后在5%脫脂牛奶中封閉1 h。使用1∶500稀釋的一抗與PVDF膜在4℃下孵育過夜，然后在室溫下用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育2 h。使用Pierce ECL試劑進(jìn)行免疫印跡發(fā)光顯示，然后使用Image J分析軟件進(jìn)行定量。以β-actin作為內(nèi)參蛋白計算Wnt、MMP-7、DKK1蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 裸鼠移植瘤

30只BALB/c裸鼠隨機分為3組，每組10只。取3組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞0.3 mL（1×108個/mL）皮下接種于裸鼠背部。接種空白組細(xì)胞的裸鼠為空白組，接種NC組細(xì)胞的裸鼠為NC組，接種miR-137組細(xì)胞的裸鼠為miR-137組。接種的第3天開始測量腫瘤體積（每3天測量1次），接種的第30天測量腫瘤體積后處死各組裸鼠（觀察期間共有4只裸鼠死亡，剔除后其余數(shù)據(jù)納入分析統(tǒng)計）。根據(jù)第30天的腫瘤體積計算抑瘤率：腫瘤體積（V）=長×寬2/2；抑瘤率=（1-V實驗/V空白）×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.00統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較做單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或t檢驗，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

miR-137組轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上，轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 miR-137組細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光圖 （×200）

2.2 3組細(xì)胞活性比較

空白組、NC組、miR-137組12 h、24 h、48 h的OD值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的OD值有差異（F=10.741，P=0.000）；②3組的OD值 有 差異 （F=13.218，P=0.000），miR-137組OD值較空白組和NC組低，相對細(xì)胞活性較低；③3組OD值的變化趨勢有差異（F=11.651，P=0.000）。見表2與圖2。

圖2 3組不同時間點OD值的變化趨勢

表2 3組細(xì)胞各時間點的OD值比較 （）

表2 3組細(xì)胞各時間點的OD值比較 （）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與NC組比較，P＜0.05。

組別空白組NC組miR-137組12 h 0.441±0.080 0.453±0.088 0.212±0.041①②24 h 0.754±0.122 0.737±0.110 0.431±0.082①②48 h 1.241±0.221 1.230±0.224 0.685±0.142①②

2.3 3組細(xì)胞凋亡率比較

空白組、NC組、miR-137組細(xì)胞凋亡率分別為（5.88±1.07）%、（6.01±1.21）%、（21.18±4.27）%，3組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.685，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，miR-137組細(xì)胞凋亡率高于空白組和NC組（P＜0.05）。

2.4 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1、miR-137 mRNA相對表達(dá)量比較

空白組、NC組、miR-137組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1、miR-137 mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，miR-137組細(xì)胞Wnt和MMP-7 mRNA相對表達(dá)量較空白組和NC組降低（P＜0.05）；miR-137組細(xì)胞DKK1和miR-137 mRNA相對表達(dá)量較空白組和NC組升高（P＜0.05）。見圖3和表3。

圖3 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1 mRNA表達(dá)

表3 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1 mRNA相對表達(dá)量比較 （）

表3 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1 mRNA相對表達(dá)量比較 （）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與NC組比較，P＜0.05。

組別空白組NC組miR-137組F值P值Wnt mRNA 1.01±0.21 1.03±0.20 0.28±0.07①②30.781 0.000 MMP-7 mRNA 1.17±0.24 1.15±0.20 0.32±0.08①②33.938 0.00 DKK1 mRNA 0.87±0.17 0.85±0.16 1.23±0.19①②7.572 0.007 miR-137 mRNA 0.51±0.12 0.50±0.12 1.42±0.31①②33.519 0.000

2.5 3 組細(xì)胞 Wnt、MMP-7、DKK1 蛋白相對表達(dá)量比較

空白組、NC 組、miR-137 組細(xì)胞 Wnt、MMP-7、DKK1 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，miR-137組細(xì)胞Wnt、MMP-7 蛋白相對表達(dá)量較空白組和NC 組降低 （P＜0.05）；miR-137 組細(xì)胞 DKK1 蛋白相對表達(dá)量較空白組和NC 組增加（P＜0.05）。見圖 4 和表 4。

表4 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1蛋白相對表達(dá)量比較（）

表4 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1蛋白相對表達(dá)量比較（）

注 ：①與空白組比較，P ＜0.05；②與NC組比較，P ＜0.05。

組別空白組NC組miR-137組F 值P 值DKK1蛋白0.23±0.05 0.24±0.05 0.49±0.12①②16.778 0.000 Wnt蛋白0.38±0.10 0.36±0.10 0.09±0.01①②19.577 0.000 MMP-7蛋白0.40±0.11 0.39±0.10 0.10±0.01①②19.617 0.00

圖4 3組細(xì)胞Wnt、MMP-7、DKK1蛋白表達(dá)

2.6 3組裸鼠移植瘤的抑瘤率及腫瘤體積比較

空白組、NC 組、miR-137 組裸鼠移植瘤的抑瘤率分別為（0.00±0.00）%、（1.00±0.11）%、（49.15±5.24）%?？瞻捉M與NC 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.328，P=0.000）；空白組與miR-137 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.974，P=0.000）；NC 組與miR-137 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.543，P=0.000），miR-137 組的抑瘤率上升。

空白組、NC 組、miR-137 組裸鼠不同時間點的腫瘤體積比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的腫瘤體積有差異（F=15.271，P=0.000）；②3 組的腫瘤體積有差異（F=28.421，P=0.000），miR-137 組與空白組和 NC 組比較，腫瘤生長緩慢，相對抑瘤效果較好；③3 組的腫瘤體積變化趨勢有差異（F=13.418，P=0.000）。見表 5 和圖 5。

表5 3組裸鼠移植瘤不同時間點的腫瘤體積比較 （mm3，）

表5 3組裸鼠移植瘤不同時間點的腫瘤體積比較 （mm3，）

組別空白組NC組miR-137組n 8 9 9 3 d 65.01±2.17 60.81±6.23 31.21±2.81 6 d 87.14±5.11 90.17±6.30 45.19±5.07 9 d 112.57±7.14 107.22±11.57 72.39±5.09 12 d 147.81±5.21 135.17±12.08 88.47±10.28 15 d 251.34±12.11 27.017±11.71 122.85±11.08組別空白組NC組miR-137組18 d 387.41±22.08 398.54±20.17 178.71±15.61 21 d 517.32±31.28 506.31±28.77 225.37±12.35 24 d 677.81±40.14 651.38±41.18 356.51±20.49 27 d 836.21±41.91 851.92±46.27 407.82±25.11 30 d 1 017.58±88.37 1 010.99±80.17 510.29±31.46

圖5 3組裸鼠移植瘤腫瘤體積不同時間點變化趨勢

3 討論

宮頸癌高發(fā)于30～55 歲女性，其病因復(fù)雜多樣，一般由病毒感染、性生活不潔等因素導(dǎo)致?；颊咴缙诔霈F(xiàn)陰道接觸性出血，晚期則出現(xiàn)不規(guī)則出血，并伴有惡臭味白帶分泌。與其他癌癥一樣，宮頸癌主要以化療、放療和手術(shù)治療為主，但由于早期癥狀易被患者忽視，治療效果有限[7-8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對宮頸癌細(xì)胞中特定靶點展開靶向治療受到越來越多的關(guān)注[9]。表皮生長因子受體的靶向治療已經(jīng)取得了良好的進(jìn)展，因此繼續(xù)尋找宮頸癌發(fā)展不同環(huán)節(jié)的靶點對其治療非常重要。MIAO 等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-137 能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲，但miR-137 對宮頸癌細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控機制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，與空白組和NC 組相比，miR-137 組細(xì)胞在 12 h、24 h、48 h 的 OD 值降低，細(xì)胞凋亡率上升，說明過表達(dá)miR-137 可以抑制宮頸癌細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞增殖率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-137 位于 microRNA 1 號染色體短臂的 2 區(qū) 2 帶位置，在多種癌癥[11-12]中抑制癌細(xì)胞的增殖與侵襲，促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。彭蔭偉等[13]研究結(jié)果顯示，miR-137 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)低，過表達(dá)可靶向調(diào)控表皮生長因子受體（EGFR）抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。馬琛等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-137 能靶向調(diào)控人Twist 相關(guān)蛋白1（TWIST1），抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移，并且可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，還有研究[15]顯示miR-137 過表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。結(jié)合本研究裸鼠移植瘤的腫瘤體積不同時間點的變化趨勢與抑瘤率的結(jié)果，說明miR-137 具有抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

本 研 究 中 ，miR-137 組 細(xì) 胞 的 Wnt、MMP-7 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量較空白組和NC 組降低，DKK1 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量升高，說明miR-137可以調(diào)控MMP-7/DKK1 信號通路。DKK 是哺乳動物中高度保守的一類基因家族，其中DKK1 可以與LRP5/6 受體結(jié)合，抑制LRP5/6 與Wnt 形成復(fù)合物，阻斷Wnt 信號通路的活化[16]。Wnt 的經(jīng)典信號通路在多種腫瘤中均過度活化，抑制Wnt 信號通路可以抑制宮頸癌細(xì)胞的生長[17]。既往研究顯示[18]，上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中DKK1 的表達(dá)可以抑制Wnt/βcantenin 通路活化。MMP-7 是Wnt 經(jīng)典通路下游重要的靶基因，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，與多種癌癥的發(fā)展相關(guān)。馮倩等[19]研究顯示，上調(diào)Wnt 通路可以促進(jìn)MMP-7 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。此外，WANG 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-137 可以降低MMP-7 蛋白的表達(dá)，延緩細(xì)胞增殖。結(jié)合以上研究與本研究結(jié)果推測，miR-137 可能通過調(diào)控Wnt 上下游的MMP-7/DKK1信號通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，在人宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-137可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖，該作用可能通過調(diào)控Wnt 及其上下游MMP-7/DKK1 信號通路有關(guān)。本研究為宮頸癌的治療提供了可能的靶點，但miR-137 調(diào)控MMP-7/DKK1 信號通路的機制尚不明確，還需進(jìn)一步研究證實。