劉 琪,高志強(qiáng),楊珍平,喬月靜
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801)
土壤微生物是地球化學(xué)循環(huán)的主要推動力,在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。微生物群落的組成以及功能對于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要的作用[1-2]。研究表明,土壤微生物中占比最多的細(xì)菌幾乎參與了土壤中所有的生物化學(xué)過程,在物質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化過程中扮演重要的角色[3]。施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中改善作物營養(yǎng)以及提高作物生產(chǎn)力必不可少的環(huán)節(jié),同時也會影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。黃土高原地區(qū)是北方冬麥的主要產(chǎn)區(qū)之一,但小麥平均單產(chǎn)卻低于全國平均水平,為了提高產(chǎn)量,氮肥施用往往會過量,造成生態(tài)壓力[4]。因此,研究不同施氮水平下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)的演替規(guī)律,對選擇合適的施氮量以及改善土壤生態(tài)系統(tǒng)有重要意義。
土壤微生物群落的變化會影響植物的生長以及養(yǎng)分利用效率[5],肥料的施用會改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其活力,引起土壤肥力的差異,進(jìn)而影響土壤結(jié)構(gòu)以及植物的生長發(fā)育[6]。適當(dāng)?shù)脑黾邮┑浚?xì)菌群落豐富度也會隨之增加[7],還可以改變細(xì)菌門、屬水平上的群落組成[8-9],顯著降低了土壤真菌的相對豐度,增加了細(xì)菌的比例[10]。施肥還會改變土壤的理化性質(zhì)和酶活性。與不施肥相比,適量施氮會使土壤酶活性提高[11],顯著增加土壤速效氮、磷、鉀及有機(jī)碳含量[12],同時影響水穩(wěn)性團(tuán)聚體平均重量直徑[13]。
對于黃土高原地區(qū)冬小麥土壤細(xì)菌群落的研究,前人側(cè)重于對小麥土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的生物地理分布格局或某一單一生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究[14-15],而對不同施氮量下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少,在一定程度上限制了不同施氮量對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的深入理解。因此,本研究以黃土高原地區(qū)小麥土壤為研究對象,結(jié)合高通量測序,分析了5種氮肥水平下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化及其與理化性質(zhì)的關(guān)系,以期為該地區(qū)施肥制度以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)在山西省運(yùn)城市聞喜縣后宮鄉(xiāng)上院村(34°35'N,110°15'E)于2018—2019年進(jìn)行。試驗(yàn)地屬典型暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候,年平均氣溫12℃,年平均降水量500 mm。土壤類型為石灰性褐土。試驗(yàn)前耕層(0~20 cm)土壤基礎(chǔ)肥力:pH 7.93,有機(jī)質(zhì)12.07 g/kg,全氮1.35g/kg,速效磷16.28mg/kg,速效鉀218.76mg/kg。
供試冬小麥品種為‘良星99’。播前澆足底墑水(750 m3/hm2),于2018年10月11日采用施肥播種一體機(jī)進(jìn)行播種并一次性基施氮磷鉀肥。播種方式為條播,行距為18.75 cm。設(shè)置5個施氮(N)量梯度,分別為:0 kg/hm2(N0)、90 kg/hm2(N6)、180 kg/hm2(N12)、240 kg/hm2(N16)、300 kg/hm2(N20),其中N0為對照。重復(fù)3次,共計15個小區(qū),小區(qū)面積為2.5m×20m=50m2,完全隨機(jī)區(qū)組排列。所有小區(qū)的磷、鉀肥施用量均為150 kg P2O5/hm2和150 kg K2O/hm2。2019年6月7日收獲。田間管理同常規(guī)大田生產(chǎn)。試驗(yàn)地前茬為玉米(Zea maysL.)。
于2019年6月用滅菌土鉆采集冬小麥?zhǔn)斋@后0~20 cm土樣,每個小區(qū)取3個點(diǎn)混合成一個樣品,用恒溫箱保存并運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室,將樣品過2 mm篩,剔除石砂和植物殘?jiān)入s物,一部分-80℃保存,用于土壤微生物分析,另一部分土樣風(fēng)干后用于測定pH、全氮和土壤酶活。于收獲期用環(huán)刀法取0~20 cm土樣測定土壤容重和土壤重量含水率。于收獲期采集0~20 cm原狀土樣,自然風(fēng)干后剔除石砂和植物殘?jiān)入s物,并按土壤自然裂痕將大土塊剝離為1 cm3左右,用于測定土壤團(tuán)聚體。
1.4.1 土壤pH、全氮和土壤酶活性 土壤pH采用電位法(水:土=2.5:1)測定;全氮用元素分析儀vario MACRO cube測定。土壤酶活性(蔗糖酶、脲酶和磷酸酶)用關(guān)松蔭的方法測定[16]。
1.4.2 土壤容重和土壤重量含水率 土壤容重由105℃烘干后的土壤重量和環(huán)刀體積決定,計算公式如式(1)所示。
式(1)中BD為土壤容重(g/cm3);M2為烘干后土壤與環(huán)刀的質(zhì)量(g);M0為環(huán)刀質(zhì)量(g);V為環(huán)刀體積(cm3)。
土壤重量含水率利用重量法計算,計算公式如式(2)所示。
式(2)中GWC為土壤重量含水率(%);M1為鮮土與環(huán)刀的質(zhì)量(g)。
1.4.3 土壤團(tuán)聚體 土壤團(tuán)聚體用“NYT 1121.19—2008土壤檢測第19部分:土壤水穩(wěn)性大團(tuán)聚體組成的測定”方法測定土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體的平均重量直徑[17-18]。
土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體的平均重量直徑(MWD)計算公式如式(3)所示。
1.4.4 DNA提取 土壤總DNA使用Fast DNA SPIN Extraction Kits(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)試劑盒,按照試劑盒提取步驟進(jìn)行。用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度和完整性,用NanoDrop ND-1000檢測提取DNA的濃度和純度。
1.4.5 高通量測序分析 以提取的土壤微生物總DNA為模板,利用通用引物338F(ACTCCTACGGGA GGCAGCA),806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對細(xì)菌16S rRNA V3V4區(qū)進(jìn)行RCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系5×reaction buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,DNA模板1 μL,Q5 DNA聚合酶0.25 μL,dd H2O 9.75 μL。PCR反應(yīng)條件為:98℃ 5 min;25個循環(huán):98℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 1 min;72℃ 5 min。每個樣品做3次重復(fù),混合后利用Agencourt AMPureBeads(Beckman Coulter,Indianapolis,IN)進(jìn)行純化,使用PicoGreen ds DNA Assay Kit15(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)檢測試劑盒進(jìn)行定量。樣品送由上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行序列測序分析。
1.4.6 制備標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線 回收PCR產(chǎn)物,連接至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中,篩選陽性克隆測序,并且提取含16S rRNA基因的質(zhì)粒,用超微量核酸定量儀(BioDrop DUO)測定質(zhì)粒濃度,計算16S rRNA基因拷貝數(shù),按10倍梯度稀釋,共6個梯度,用來制備16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.7 熒光定量PCR用熒光定量PCR法測定細(xì)菌16S rRNA基因豐度,反應(yīng)在CFX 384Touch熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為:TB Green?Premix Ex Taq? II 12.5 μL,上下游引物各1.0 μL,DNA模板(1~10 ng)2.0 μL,最后用超純水(dd H2O)補(bǔ)至25.0 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;35個循環(huán):95℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s;72℃5 min。熒光定量PCR擴(kuò)增效率為93.4%,R2為0.997。
1.4.8 OTU聚類分析 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,運(yùn)用QIIME軟件識別疑問序列[19]。隨后,通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列,使用QIIME軟件,調(diào)用UCLUST這一序列比對工具[20],對前述獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分,并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。使用QIIME軟件計算多樣性指數(shù)以及獲取樣本在門和綱分類水平上的組成和豐度分布表。
使用Origin8.0軟件繪制柱狀圖。用Canoco4.5軟件對土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析(RDA)。用R軟件進(jìn)行主成分分析。采用SPSS 22.0軟件,利用ANOVA,對不同處理的土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌分類水平的相對豐度和α多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。
施氮量對土壤理化性質(zhì)的影響如表1所示,不同施氮量土壤中除了全氮(TN)差異不顯著外,其他理化指標(biāo)均存在顯著差異(P<0.05)。增施氮肥使土壤容重(BD)顯著降低3.25%~9.74%(P<0.05);但顯著增加了土壤重量含水率(GWC)和土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體平均重量直徑(MWD)(P<0.05)。各指標(biāo)中,N12處理表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。
表1 不同施氮量處理的土壤理化性質(zhì)
隨著施氮量的增加,蔗糖酶活性、脲酶活性和磷酸酶活性呈先升高后下降的趨勢,N12處理的土壤酶活性均最高,顯著高于N0處理(P<0.05),其中,脲酶活性和磷酸酶活性分別顯著提高47.46%和11.49%;蔗糖酶活性在N16處理中最高,但與N12處理沒有顯著差異,與N0相比顯著提高35.41%。
2.2.1 樣品序列結(jié)果及多樣性指數(shù) 所有樣品共測得原始序列503870條,樣品含有序列28861~40061條(表2)。不同處理的Chao1指數(shù)為2335~3229,ACE指數(shù)為 2521~3316,Shannon 指數(shù)為 10.26~10.41,Simpson指數(shù)為0.99826~0.99863(表2);方差分析結(jié)果表明,施氮量會顯著影響多樣性指標(biāo)(P<0.05),與不施氮肥相比,施氮處理中Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)分別提高9.65%~38.29%、9.13%~31.57%和0.39%~1.46%。
表2 不同施氮量處理的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)
2.2.2 土壤細(xì)菌豐度 不同施氮量處理中土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為6.47×1010~15.18×1010(圖1)。隨著施氮量的增加,16S rRNA基因拷貝數(shù)呈先升高后下降的趨勢,在N12處理達(dá)到最大值,N0、N6和N20處理下的16S rRNA基因拷貝數(shù)沒有顯著差異(P<0.05)。
圖1 不同施氮量下的16S rRNA基因拷貝數(shù)
2.2.3 土壤細(xì)菌群落組成 由圖2a可知,在不同施氮量的細(xì)菌門類中變形菌門(Proteobacteria,32.20%~35.92%)、放線菌門(Actinobacteria,20.84%~27.09%)、酸桿菌門(Acidobacteria,12.70%~15.35%)、綠彎菌門(Chloroflexi,8.59% ~10.12%)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,6.44%~7.77%)為土壤中優(yōu)勢菌門(平均相對豐度>5%),合計占的比重為84.76%~91.61%。不同施氮量間還檢測到一些相對豐度較低(1%~5%)的細(xì)菌門類,如浮霉菌門(Planctomycetes,1.82% ~4.24%)、擬桿菌門 (Bacteroidetes,2.33% ~3.28%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae,1.23%~1.90%)、Rokubacteria (0.42%~2.48%)和匿桿菌門(Latescibacteria,0.62%~1.88%)。此外,還檢測到20個相對豐度很低(平均相對豐度<1%)的細(xì)菌門類。
圖2 不同施氮量處理的細(xì)菌門和綱水平組成
不同施氮量下變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門、Rokubacteria和匿桿菌門的相對豐度有顯著性差異(P<0.05),其中酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度在N0處理中顯著高于其他處理(P<0.05),N12處理顯著提高變形菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門和Rokubacteria的相對豐度(P<0.05),N16處理顯著提高放線菌門的相對豐度(P<0.05)。
由圖2b可知,在綱水平上,得到的細(xì)菌群類中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,12.11%~15.65%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,13.05%~14.94%)、放線菌 綱 (Actinobacteria,8.77% ~15.74%)、Subgroup_6(7.30% ~8.44%)、芽單胞菌綱 (Gemmatimonadetes,5.78% ~6.99%)、酸微菌綱(Acidimicrobiia,4.66% ~6.31%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,4.93%~6.12%)為土壤中優(yōu)勢菌門,合計占的比重為60.85%~69.35%。不同施氮量間還檢測到一些相對豐度較低的細(xì)菌類群,如嗜熱油菌綱(Thermoleophilia,3.94%~4.81%)、KD4-96(2.84% ~3.82%)、擬桿菌綱(Bacteroidia,2.27% ~3.20%)、厭氧繩菌綱 (Anaero lineae,2.26% ~3.21%)、Blastocatellia(Subgroup_4,1.53%~2.29%)、OM190(0.89%~2.35%)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira,1.23% ~1.90%)、MB-A2-108(0.61% ~2.25%)、綠彎菌綱(Chloroflexia,0.88%~1.42%)、酸桿菌綱 (Acidobacteriia,0.99% ~1.38%)、NC10(0.81% ~2.48%)、Subgroup_17(0.75%~1.43%)、Thermoanaero baculia(0.98%~1.31%)。此外,還檢測到77個相對豐度很低的細(xì)菌門類。
不同施氮量下α-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱、酸微菌綱、KD4-96、厭氧繩菌綱、Blastocatellia_(Subgroup_4)、OM190、硝化螺旋菌綱、MB-A2-108和NC10的相對豐度有顯著性差異(P<0.05)。其中OM190、MB-A2-108和NC10的相對豐度在N0處理中顯著高于其他處理(P<0.05),γ-變形菌綱、厭氧繩菌綱、Blastocatellia_(Subgroup_4)、硝化螺旋菌綱在N12處理中顯著高于其他處理(P<0.05),放線菌綱和酸微菌綱的相對豐度在N16處理中顯著高于其他處理(P<0.05),N20處理顯著提高了α-變形菌綱和KD4-96的相對豐度(P<0.05)。
2.2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 細(xì)菌群落的主成分分析結(jié)果表明(圖3),不同施氮量處理的不同微生物群落結(jié)構(gòu)有很大差異,其中,N6和N16距離較近,在同一象限,群落組成較相似;N0和N20距離較近,但是不在同一象限,且與N6、N16較遠(yuǎn);N12處理與其他處理不同均分布于單獨(dú)的象限中。
圖3 細(xì)菌群落在OUT水平上的主成分分析
細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門分類水平與土壤理化性質(zhì)和土壤酶的冗余分析結(jié)果表明(圖4),變形菌門、放線菌門、擬桿菌門及Rokubacteria與TN、GWC、MWD、脲酶、蔗糖酶及磷酸酶呈正相關(guān),酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、硝化螺旋菌門及匿桿菌門與pH及BD呈正相關(guān);表明土壤理化性質(zhì)及土壤酶與細(xì)菌群落密切相關(guān),其中蔗糖酶(P<0.01)和脲酶(P<0.01)顯著影響了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(門水平)。
圖4 環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析
與不施氮肥相比,適量施氮(180 kg/hm2)可以增加土壤重量含水率和土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體的平均重量直徑,蔗糖酶、脲酶以及堿性磷酸酶活性也會升高;而過量施氮,土壤pH、容重會顯著下降,土壤酶活性也會降低。增施氮肥會顯著改變細(xì)菌門和綱水平上的相對豐度。
在黃土高原地區(qū)適量施氮(180 kg/hm2),可以改善土壤結(jié)構(gòu),提高土壤細(xì)菌群落多樣性,為維持生態(tài)系統(tǒng)平衡奠定基礎(chǔ)。
研究表明長期施氮使土壤pH下降[21-22],在本研究中pH沒有顯著變化,且pH與土壤細(xì)菌群落沒有顯著相關(guān)性,可能與施氮的時間長短有關(guān),也可能是由于研究條件不同引起的,尤其是試驗(yàn)地土壤pH不同。研究表明,堿性土壤明顯減緩了土壤pH的變化,使得土壤pH變化很小,且在施肥處理中,堿性土壤的化學(xué)性狀與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒有明顯的關(guān)系;但是在酸性和近中性土壤中,土壤化學(xué)性狀與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著的相關(guān)性[23],而前人研究的土壤pH通常是酸性和近中性的[24-26]。水穩(wěn)性團(tuán)聚體的MWD表示了土壤的團(tuán)聚度和穩(wěn)定性[17],本研究表明過量施氮會破環(huán)土壤結(jié)構(gòu),導(dǎo)致MWD下降,這與邢旭明等[13]研究結(jié)果相似。研究表明在施氮量超過N12處理時土壤容重沒有顯著變化,而GWC有所下降,這可能是高氮投入導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化,這與李榮等[27]的研究結(jié)果一致。
增施氮肥對土壤酶活性有顯著影響,適量施氮會提高土壤酶活性。蔗糖酶、脲酶和磷酸酶在施氮量(N)超過180 kg/hm2時活性會下降,這與CHEN研究結(jié)果相似[28]。但MARKLEIN等[29]研究發(fā)現(xiàn)磷酸酶活性會隨增施氮肥而升高,因?yàn)榱姿崦傅漠a(chǎn)生需要高氮投入;在MARKLEIN的研究中雖然土壤磷酸酶平均活性升高,但是在他85個試驗(yàn)地中有26個的土壤磷酸酶活性降低,這可能與施肥時間、土壤肥力、微生物群落等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),土壤酶活性與細(xì)菌群落相關(guān)性最高,可能是因?yàn)橥寥牢⑸锸钱a(chǎn)生土壤酶的主要原因,而且土壤酶活性可以反應(yīng)土壤退化潛力[30]。
有研究表明,增施氮肥會降低土壤細(xì)菌多樣性[31]。本研究中增施氮肥,細(xì)菌多樣性指數(shù)呈先增加后減小的趨勢,這與之前的報道一致[32]。有研究表明,氮肥添加引起的酸化作用是導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降的主要因素[33];也有研究表明,氮累積會刺激嗜氮微生物的增加和其他微生物的競爭,從而導(dǎo)致微生物多樣性下降[34]。微生物多樣性降低會導(dǎo)致陸地生態(tài)系統(tǒng)改變[35],所以過量施氮可能會導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定[36]。
結(jié)果表明,不同施氮量處理的門和綱類群相似,土壤細(xì)菌群落對不同施氮量的反應(yīng)不同,土壤細(xì)菌在門和綱水平上有顯著變化(P<0.05)。在高氮處理下酸桿菌門的豐度有所下降,酸桿菌門在生態(tài)學(xué)上歸類為寡營養(yǎng)菌門[37];在高氮處理下富營養(yǎng)菌門中放線菌門豐度最高,RAMIREZ等[9]觀察到在施用氮肥的土壤中微生物呼吸速率較低,假設(shè)施用氮肥通過改變細(xì)菌代謝來抑制土壤微生物活性,那相對于寡營養(yǎng)細(xì)菌,能夠降解不穩(wěn)定化合物的細(xì)菌群落一定會有所增加。有研究表明,變形桿菌和酸桿菌之間的比例可表示土壤的營養(yǎng)狀況,在貧瘠土壤和有機(jī)輸入量較低的農(nóng)業(yè)土壤中該比例較低,而在有機(jī)輸入量較高的農(nóng)業(yè)土壤中該比例較高[38-39]。研究發(fā)現(xiàn)N12處理的細(xì)菌群落在門水平的變形菌門顯著高于其他處理,其酸桿菌門較低,所以N12處理的土壤營養(yǎng)狀況較好。此外,本研究發(fā)現(xiàn)在N12處理中能夠?qū)喯跛嵫趸癁橄跛猁}的硝化螺旋菌屬豐度最高,說明適量氮肥有助于提高土壤氮肥力[40]。在N12處理中未分類的細(xì)菌門Rokubacteria豐度顯著高于其他處理(P<0.05)。有研究表明,Rokubacteria與硝化螺旋菌門密切相關(guān),與硝化螺旋菌門不同的是,Rokubacteria基因組很大,其中GC含量高以及具有多種混合營養(yǎng)代謝潛力[41]。綜上所述,不同施氮量可以改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),適量施氮會提高土壤細(xì)菌多樣性。冗余結(jié)果也表明,環(huán)境因子與優(yōu)勢菌門變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門相關(guān)性較強(qiáng),這說明適量施肥對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有良好的影響。
不同施氮量對土壤細(xì)菌群落及理化性質(zhì)也有一定影響,本研究只反映了土壤細(xì)菌群落變化,未分析不同施氮量下其他種類微生物的變化,不同施氮量引起的細(xì)菌群落差異是否對其他種類微生物產(chǎn)生影響還有待研究。