花生籽仁發(fā)育過程中糖分積累特征及蔗糖代謝酶活性分析

劉永惠，沈 一，沈 悅，梁 滿，陳志德

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，南京 210014）

0 引言

花生(Arachis hypogaeaL.)是中國重要的經(jīng)濟和油料作物，在增加農(nóng)民收入和保障國家油脂安全方面具有重要的作用[1]。近年來，隨著人民生活水平的提高和食品加工業(yè)的快速發(fā)展，食用花生的需求量不斷上升。但目前國內(nèi)主栽品種以油用花生為主，缺少優(yōu)質(zhì)食用專用型花生品種，不能滿足食用花生市場的需求[2]。含糖量是評價食用花生的重要指標之一，與花生的口味、加工品質(zhì)密切相關[3]?；ㄉ讶手械目扇苄蕴侵饕ㄕ崽恰⒐呛推咸烟堑?，其中蔗糖是最主要的糖分[4]。當蔗糖含量達到6%以上時，花生籽仁口感較好，而中國目前大部分花生品種蔗糖含量較低，僅在3%～4%左右。如何提高花生品種的蔗糖含量，培育優(yōu)質(zhì)食用型花生品種是生產(chǎn)上亟待解決的問題。

花生的含糖量被認為是可以遺傳的性狀[5]，且含糖量的大小與品種、籽仁成熟度、生長環(huán)境、栽培措施等因素有關[6]，推測這些因素可能通過影響相關酶的活性來促進或減少蔗糖等糖分的積累。研究證實蔗糖磷酸合酶SPS(sucrose phosphate synthase)、蔗糖合酶SS(sucrose synthase)以及蔗糖轉(zhuǎn)化酶INV(sucrose invertase)是調(diào)控植物蔗糖代謝途徑的關鍵酶[7]。其中SPS與蔗糖合成密切相關，是蔗糖合成途徑的關鍵限速酶[8]；SS負責催化蔗糖分解與合成的可逆反應，有研究認為其更偏向于蔗糖的分解反應[9]；INV主要在蔗糖的轉(zhuǎn)運、貯藏和分配中發(fā)揮重要作用[10]，根據(jù)最適pH，可以將其分為中性或堿性轉(zhuǎn)化酶NI(neutral invertase)，可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI(soluble acid invertase)，以及細胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶BAI(cellwall binding acid invertase)[11]。目前上述酶在甘蔗、甜瓜、甜菜等高糖分作物中研究較多，且不同作物的糖分積累機制及關鍵酶調(diào)控作用存在差異。如甜瓜果實中SPS、AI(acid invertase)活性被認為是決定其果實蔗糖含量的關鍵酶[12]；高糖甘蔗品種莖中的蔗糖含量與SS分解方向活性呈顯著正相關，但在低糖品種中呈負相關[13]。因此，明確作物糖分積累與蔗糖代謝相關酶的關系，對選育優(yōu)良食用品種具有重要的指導意義。

本研究以不同蔗糖含量的花生品種為試驗材料，分析其籽仁發(fā)育過程中糖分積累及蔗糖代謝相關酶活性的變化差異，旨在探討花生籽仁的糖代謝積累機制，為培育高含糖量的優(yōu)質(zhì)食用型花生品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用了3個不同蔗糖含量的花生品種作為實驗材料，分別是高蔗糖含量的‘冀花甜1號’（以下簡稱‘冀甜’），較高蔗糖含量的‘臨花16號’（以下簡稱‘臨花’），以及普通品種‘蘇農(nóng)花1號’（以下簡稱‘蘇花’）。其中‘冀甜’由河北省農(nóng)林科學院選育，‘臨花’由山東省臨沂市農(nóng)業(yè)科學院選育，‘蘇花’由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院選育。

1.2 方法

將上述材料于2020年5月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院本部試驗田進行播種，常規(guī)田間管理，待進入結莢期后每隔10天收集各品種代表性莢果樣品。從中選取發(fā)育均勻一致的莢果，快速剝?nèi)∽讶?，并根?jù)籽仁發(fā)育的大小及狀態(tài)細分為發(fā)育初期、中期、后期。各時期的樣品一部分及時烘干，用粉碎機粉碎成粉末，過0.64 mm孔徑篩，置于密閉容器中保存，用于可溶性總糖、蔗糖、果糖及葡萄糖等糖組分含量的測定；另一部分液氮冷凍，-80℃冰箱保存，用于SPS、SSⅠ（SS分解方向）、SSⅡ（SS合成方向）、NI、SAI等蔗糖代謝酶活力測定。

1.2.1 糖組分含量測定 可溶性總糖含量采用蒽酮比色法測定[14]。蔗糖、果糖及葡萄糖含量的測定采用高效液相色譜法，色譜型號為Aglient1260，示差折光檢測器檢測，色譜柱為氨基柱(Kromasil，4.6 mm×250 mm，5 μm)。參考國標GB/T 30390-2013的方法制備樣品提取液，用0.45 μm微孔濾膜過濾至上樣瓶中待測；按照國標GB 5009.8-2016的方法設置色譜條件：流動相為70:30(v/v)乙腈/水溶液，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，進樣量20 μL；以色譜級的蔗糖、果糖和葡萄糖標準品等比例混合配制0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/g的標準工作液，進行色譜分析，記錄不同濃度標準溶液的峰面積，以峰面積對濃度進行線性回歸，制作標準曲線；根據(jù)各測試樣品最終測得的目標峰面積，從標準曲線中折算出樣品所含蔗糖、果糖和葡萄糖的濃度。

1.2.2 蔗糖代謝相關酶活性測定 采用蘇州科銘生物技術有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行SPS、SSⅠ、SSⅡ、NI、SAI等蔗糖代謝酶活性測定。分別稱取1.0 g左右的冷凍樣品放入預冷的研缽中；加入10 mL相應的提取緩沖液，快速冰浴研磨成均勻糊狀，轉(zhuǎn)入預冷的離心管中；4℃，12000 g離心10 min，上清液即為粗酶液。根據(jù)酶的種類選擇不同的反應介質(zhì)及反應條件，具體步驟參照試劑盒說明書進行。利用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒進行樣品粗酶液的蛋白濃度測定。使用SparkTM10M多功能酶標儀測量不同波長的吸光度，并折算出酶的活性值。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Microsoft Office Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行多重比較及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 糖組分含量比較分析

如圖1所示，分別將各品種發(fā)育不同時期的籽仁進行烘干處理后，‘冀甜’、‘臨花’的種皮為紅色，‘蘇花’的種皮為淺紅色。發(fā)育初期的籽仁主要來自果針入土后10～20天左右的雞頭狀幼果；發(fā)育中期是果針入土后約30～40天、果殼表面光滑、網(wǎng)紋不明顯的莢果籽仁；發(fā)育后期是果針入土后50～60天左右的莢果籽仁，此時莢果趨于成熟，果殼網(wǎng)紋清晰，內(nèi)果殼可見褐斑。

籽仁研磨成粉末后分別測定可溶性總糖、蔗糖、果糖及葡萄糖含量（表1），結果顯示3個品種的糖組分變化規(guī)律相似，含量都是隨著種子的發(fā)育呈下降趨勢：發(fā)育初期＞發(fā)育中期＞發(fā)育后期?；ㄉ讶手锌扇苄蕴且哉崽菫橹?，含量變化范圍在18.14～97.01 mg/g，而果糖和葡萄糖的含量較低，分別僅為0.77～3.81 mg/g和0.39～3.28 mg/g。糖組分含量在發(fā)育早期下降迅速，在中后期變化相對緩慢，如‘冀甜’籽仁的蔗糖、果糖、葡萄糖含量分別從初期到中期，含量下降了26.1%、44.6%、52.4%；從中期到后期，含量僅下降12.1%、10.9%、7.7%。

表1 參試品種不同發(fā)育階段的糖組分含量

在參試的3個品種中，各發(fā)育時期的糖組分都以‘冀甜’含量最高，其次為‘臨花’，‘蘇花’的含量最低，多重比較顯示除了‘冀甜’和‘臨花’在籽仁發(fā)育中期的蔗糖含量沒有顯著性差異，其余都為極顯著差異。蔗糖含量較低的品種，其籽仁發(fā)育過程中蔗糖含量的下降速率高于蔗糖含量較高的品種，如：‘蘇花’的籽仁從發(fā)育初期到中期、中期到后期，蔗糖含量的下降速率分別為57.6%、41.7%；而‘臨花’的僅為23.6%、20.6%。

2.2 蔗糖代謝相關酶活性分析

根據(jù)酶的不同功能，將參與蔗糖代謝的關鍵酶進一步劃分為合成方向和分解方向。合成方向上主要是蔗糖磷酸合酶SPS和蔗糖合酶（合成方向）SSⅡ，其中SSⅡ的活性值較大，活性變化區(qū)間介于0.226～0.656 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-B）；SPS的活性變化區(qū)間為0.043～0.153 μmol/(mg·protein·min)（圖2-A）；這兩種酶的活性都隨著籽仁的發(fā)育呈下降趨勢，其中各品種籽仁發(fā)育初期的SPS活性為發(fā)育后期的2.3～2.6倍，SSⅡ活性為發(fā)育后期的2.2～2.7倍。

圖2 各參試品種發(fā)育不同階段蔗糖代謝相關酶活性分析

分解方向上主要分析了蔗糖合酶（分解方向）SSⅠ、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI和中性轉(zhuǎn)化酶NI。其中SSⅠ活性值相對最高，在0.051～0.253 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-E）；S-AI和NI的活性值都較低，變化區(qū)間分別介于0.002～0.007、0.004～0.021 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-C/D）；分解方向上的酶活性隨著籽仁的發(fā)育總體上呈上升趨勢，其中NI活性值從初期到后期上升了2.2～3.3倍，SAI和SSⅠ的活性值分別上升了2.2～2.9倍和2.2～4.0倍。

不同品種的酶活性變化趨勢基本相似。多重比較顯示，3個品種在不同發(fā)育時期的酶活性差異大部分達到了顯著或極顯著水平；除了可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI在發(fā)育初期和中期的差異不顯著；‘臨花’籽仁中NI活性在發(fā)育中期和后期差異不顯著；‘蘇花’籽仁中SSⅠ活性在發(fā)育中期和后期差異不顯著。發(fā)育初期以‘冀甜’的SPS、SSⅡ、SSⅠ活性最高，‘蘇花’對應的酶活性最低，這與品種的糖組分含量差異趨勢一致；發(fā)育中期品種間的差異變小，尤其是‘臨花’和‘蘇花’，兩者僅在SSⅡ活性方面的差異達到顯著水平，‘冀甜’在SPS、SSⅡ、NI活性方面都與剩余2個品種呈極顯著差異；發(fā)育后期不同品種間僅NI活性差異達到極顯著水平，‘冀甜’品種的蔗糖合酶SS無論是合成還是分解方向都極顯著高于其他品種。

2.3 蔗糖和蔗糖代謝酶活性的相關性分析

將不同品種或不同發(fā)育階段的蔗糖含量及其相應的蔗糖代謝酶活性進行相關性分析。如表2所示，不同品種的蔗糖含量與酶活性的相關性趨勢相同，表現(xiàn)為與蔗糖合成方向的酶SPS、SSⅡ及兩者總和(SPS+SSⅡ)呈正相關；與蔗糖分解方向的酶SAI、NI、SSⅠ及三者總和(SAI+NI+SSⅠ)呈負相關；除‘冀甜’的蔗糖含量與SAI活性的相關性不顯著外，其他都達到了顯著或極顯著水平。不同發(fā)育階段的蔗糖含量與酶活性的相關性存在一定的差異，發(fā)育初期的蔗糖含量與SPS、SSⅡ、SSⅠ、SPS+SSⅡ及SAI+NI+SSⅠ呈極顯著正相關，與SAI成正相關，與NI成負相關，但相關值較小，未能達到顯著水平；發(fā)育中期的相關值其絕對值都低于0.8，僅與SSⅡ和SPS+SSⅡ呈顯著正相關；發(fā)育后期的蔗糖含量與NI的相關性最高，為極顯著負相關(R=-0.945)，其次與SPS、SAI顯著正相關，其他指標不顯著。

表2 蔗糖含量與蔗糖代謝酶活性相關性分析

3 討論與結論

花生作為世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物，具有重要的營養(yǎng)價值。近年來，除含油量[15]、蛋白質(zhì)[16]、脂肪酸[17]等品質(zhì)性狀外，含糖量的相關研究報道也明顯增多。在花生籽仁蔗糖含量測定方法上，通過利用不同類型的近紅外光譜儀不斷建立和完善花生蔗糖含量測定的近紅外模型[18-19]，實現(xiàn)了蔗糖含量的無損、快速、高效預測。秦利等[20]通過對花生籽仁蔗糖含量進行遺傳分析，揭示該性狀受2對加性主基因+多基因控制，且具有明顯的母體效應。郭建斌等[21]通過分析不同油酸花生品種籽仁中營養(yǎng)成分的變化，認為蔗糖含量胚中顯著高于子葉，且蔗糖含量和油脂含量變化呈負相關，與高糖品種往往具有較低含油量的特征相符。相信隨著越來越多有關花生含糖量性狀的深入研究，將進一步加快優(yōu)質(zhì)食用型花生品種的選育進程。

糖分積累是個復雜的過程，由多種酶調(diào)控，探明蔗糖代謝相關酶活性與蔗糖積累的關系，可以為高糖品種的選育提供理論依據(jù)，但目前花生中相關研究報道較少。從本研究結果來看不同品種籽仁發(fā)育過程中的糖組分含量及酶活性變化規(guī)律基本相似；含糖量高的品種籽仁發(fā)育各時期糖組分含量始終高于含糖量低的品種；并證實了蔗糖是花生籽仁中最主要的可溶性糖；果糖、葡萄糖含量較低且呈下降趨勢，在發(fā)育后期達到了極低的水平。酶活性方面，無論是合成方向的蔗糖合酶SSⅡ或是分解方向的蔗糖合酶SSⅠ，其相對酶活性值都較高，尤其是分解方向，是蔗糖轉(zhuǎn)化酶的10倍以上，與前人研究結果一致[14]。表明蔗糖合酶在花生蔗糖代謝途徑中起著重要作用。此外，相關性分析顯示籽仁發(fā)育后期蔗糖含量與中性轉(zhuǎn)化酶NI呈極顯著負相關，與蔗糖磷酸合酶SPS呈顯著正相關。即蔗糖含量高的品種，其SPS活性越高，NI活性越低，推測兩者在花生籽仁發(fā)育后期起重要作用，可以通過抑制NI活性，減少蔗糖向葡萄糖和果糖的分解，并調(diào)控SPS活性來促進花生籽仁蔗糖積累，提高品種的含糖量。不足之處，文中僅測定比較了3個不同花生品種，樣本量較小，可能不能充分反映出品種在糖組分含量及蔗糖代謝相關酶活性變化趨勢方面的差異。

綜上所述，花生籽仁中的可溶性糖以蔗糖為主，果糖、葡萄糖含量較低；蔗糖含量較高的品種其籽仁發(fā)育各時期相對糖組分含量也較高；酶活性方面，蔗糖合酶(SS)在花生蔗糖代謝途徑關鍵酶中活性值最高；籽仁發(fā)育后期蔗糖含量與中性轉(zhuǎn)化酶NI負相關，與蔗糖磷酸合酶SPS正相關。