血漿病毒滅活技術(shù)的研究進(jìn)展

李艷

富川瑤族自治縣人民醫(yī)院 廣西 賀州 542700

以往應(yīng)用采血塑料袋、抗凝劑與血細(xì)胞保存方式不斷改進(jìn)，血庫(kù)可充分滿足用血需求。近日，醫(yī)學(xué)的進(jìn)步下，臨床用血不斷提高，成分輸血比例漸漸增長(zhǎng)，公眾對(duì)醫(yī)學(xué)認(rèn)知水平得到大幅度提升，法律意識(shí)也不斷增強(qiáng)，對(duì)血液的安全性更加重視。為保障血液安全性，血液檢測(cè)項(xiàng)目漸漸增加時(shí)，血液檢測(cè)技術(shù)得到明顯改進(jìn)[1]。截至目前，輸血傳播病毒的測(cè)定方式不僅僅局限在血清學(xué)的測(cè)定上，很多發(fā)達(dá)國(guó)家已有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如：核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT），我國(guó)部分血站同樣在實(shí)驗(yàn)室開展此項(xiàng)目。血漿占全血55%，血漿輸注在各類血液成分輸注中占比較大[2]。另外，因輸血傳播病毒在多種血液成分中分布不夠均勻，多種血液成分傳播病毒危險(xiǎn)性不同，白細(xì)胞病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)高，接下來即血漿，相對(duì)安全的是紅細(xì)胞與血小板。所以，科學(xué)預(yù)防血漿輸注風(fēng)險(xiǎn)，提高血漿輸注安全性，一直是輸血醫(yī)學(xué)中極為關(guān)注的問題，有助于提高輸血安全性。

1 新鮮冰凍血漿/冰凍血漿定義

（1）新鮮冰凍血漿：采集后保存在冷藏環(huán)境中全血，在6h-8h內(nèi)完成血漿分離，速凍，自血液采集到完成血漿分離最長(zhǎng)時(shí)間不得超過18h，分離出血漿后，速凍呈固態(tài)成分血，若制備冷沉淀新鮮冰凍血漿，新鮮冰凍血漿采集后10h內(nèi)完成速凍[3]。

（2）冰凍血漿：用物理方式在全血有效期中，分離出血漿，速凍呈固態(tài)的成分血。

2 血漿制備、熱合、包裝、速凍

2.1 血漿制備

（1）觀察血漿外觀標(biāo)簽顏色是否符合要求，血漿可不開展2次離心，排除血漿中氣泡后，用塑料夾夾緊轉(zhuǎn)移袋導(dǎo)管[4]。接著在電子稱上稱取對(duì)應(yīng)規(guī)格的血漿。將血漿袋放在計(jì)重稱重，容量依據(jù)血漿100ml/袋，血漿150/袋，血漿200ml/袋，血漿100mg/袋，連袋重118-138g，取118-138g，血漿150ml/袋，連袋重164-195g，取164-138g，血漿150ml/袋，連袋重在164-195g，取164-195g，血漿200ml/袋，連袋重210-252g，取210-252g[5]。

（2）若血漿中紅細(xì)胞混入量較多，經(jīng)2次重離心后，將原血漿袋置入在分漿夾中，松開塑料夾，分離出上層清液，將其轉(zhuǎn)移至空的聯(lián)袋重。

2.2 熱合

血漿袋近端導(dǎo)管上大約5cm-7cm處熱合和聯(lián)袋分開，用手?jǐn)D壓檢查熱合口是否有滲漏后斷離。仔細(xì)檢查每袋血漿信息，隔離不合格品，填寫《不合格品申請(qǐng)?zhí)幚韱巍烽_展評(píng)估判斷[6]。

2.3 包裝

為每袋血漿經(jīng)嚴(yán)格目測(cè)，確定無滲漏無損壞等跡象，用藍(lán)色油性筆于血漿袋下角簽上檢查者工作號(hào)，用不容種類的專用盒分別包裝，放置在速凍機(jī)速凍[7]。

2.4 速凍

血漿制品經(jīng)迅速冷凍在60min內(nèi)使血漿核心溫度下降-30℃，按照操作規(guī)程執(zhí)行速凍。

電腦信息錄入：落實(shí)《血液產(chǎn)品包裝系統(tǒng)與血液處理與加工系統(tǒng)操作規(guī)程》。

3 血漿病毒滅活的意義

輸血是治療諸多疾病的重要方法，同時(shí)輸血也可傳播一些疾病，而如何避免輸血傳播疾病，是目前醫(yī)務(wù)工作者和廣大患者共同關(guān)注的話題。血漿輸注存在的風(fēng)險(xiǎn)較大，容易傳播病毒、細(xì)菌等。一般認(rèn)為，HBV、HCV、CMV、逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)血漿輸注傳播。從美國(guó)的一份報(bào)告中得出，輸注一個(gè)單位全血血液成分病毒感染率：HBV大約1/63000；HCV大約1/100000；HIV大約1/680000[8]。部分微生物，如：錐蟲屬、巴貝蟲屬類病毒微生物可經(jīng)血漿傳播。

4 現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)不足

一些病毒對(duì)血液成分安全存在威脅，檢測(cè)血液技術(shù)不斷改進(jìn)，然而，檢測(cè)技術(shù)也有不足之處，感染病毒學(xué)依然可能逃避檢測(cè)系統(tǒng)，是傳播疾病的根源。很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)血液病毒的檢測(cè)依然在血清學(xué)水平停留，對(duì)HBV、HCV、HIV檢測(cè)用病毒標(biāo)志物酶白技術(shù)完成[9]。因存在“窗口期”，已經(jīng)感染病毒的血液病毒標(biāo)志物的測(cè)定呈陰性，容易漏檢。

美國(guó)曾報(bào)道，大約90%漏檢血液是因“窗口期”原因，我國(guó)上海經(jīng)研究表示我國(guó)同樣如此。部分實(shí)驗(yàn)室開發(fā)病毒核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT），病毒檢出率較高，但是HBV、DNA在56d“窗口期”間含量低下，檢測(cè)NAT難度高[10]。對(duì)HCV，同樣有這樣的問題。有報(bào)道稱：輸注通過NAT檢測(cè)合格血液后感染HCV病例。接著，NAT費(fèi)用較高，是推廣路上的障礙。

不僅這樣，CMV、HAV、HEV，較小病毒B19，細(xì)菌、微生物選擇未列到常規(guī)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，同樣是輸注血液中的安全問題。

5 血漿病毒滅活技術(shù)

5.1 亞甲基藍(lán)化學(xué)法

亞甲基藍(lán)化學(xué)法是現(xiàn)階段血漿病毒滅活最常用的方法，其對(duì)病毒的滅活效果，和亞甲基藍(lán)濃度之間存在密切聯(lián)系。亞甲基藍(lán)是酚噻嗪類染料，是一種解毒劑，其通常在氰化物中毒、亞硝酸鹽中毒患者中國(guó)應(yīng)用。這一方法對(duì)血漿病毒的滅活機(jī)制為：亞甲基藍(lán)為多把點(diǎn)光致敏劑，其于600～700nm波長(zhǎng)的可見光照射下，可形成單線態(tài)氧等自由基狀態(tài)，這一類活性氧能夠促使核酸鏈上鳥嘌呤發(fā)生變化，形成8-羥鳥嘌呤，致使托嘌呤與核酸鏈徹底斷開；同時(shí)，促使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、核酸與蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)交聯(lián)，同時(shí)這一物質(zhì)還可結(jié)核病毒脂雙層，導(dǎo)致病毒莫發(fā)生損傷，且這一損傷不可逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而達(dá)到病毒滅活的效果。

任何一種病毒滅菌方法，都或多或少會(huì)對(duì)血漿制品的質(zhì)量造成影響，這是難以避免的，而亞甲基藍(lán)化學(xué)法對(duì)血漿制品的質(zhì)量影響相對(duì)較小。苑玉鳳[11]等人選取10份新鮮血漿，分別應(yīng)用亞甲基藍(lán)光化學(xué)法和巴斯德液態(tài)濕熱法來對(duì)病毒進(jìn)行滅活，之后對(duì)比滅活后血漿中各項(xiàng)有效成分的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)亞甲藍(lán)光化學(xué)法進(jìn)行病毒滅活后血漿中纖維蛋白原、總蛋白和凝血因子Ⅷ的含量均顯著高于巴斯德液態(tài)濕熱法(p＜0.05)，作者得出結(jié)論，亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活病毒的血漿,對(duì)血漿成分的影響較小。正因如此，亞甲基藍(lán)化學(xué)法在病毒滅活中的應(yīng)用十分廣泛。

5.2 亞甲基藍(lán)（MB）結(jié)合光照（Light）方式

除亞甲基藍(lán)化學(xué)法之外，光照方法也是病毒滅活的一種常用方法，且這兩種方法常結(jié)合起來應(yīng)用。最近幾年，有研究用MB/光照對(duì)部分RNA/DNA病毒滅活，取得效果良好[12]。因?yàn)镸B為正電荷，陽離子和核酸親和力較高，特別是鳥嘌呤殘基親和作用良好。在這期間，因MB帶正電荷，經(jīng)一定波長(zhǎng)會(huì)發(fā)現(xiàn)光照射，步入激發(fā)狀況。自激發(fā)態(tài)返回初態(tài)時(shí)，大量釋放能量，向周圍氧分子傳遞，氧分子是活躍的氧原子，將病毒脂包膜破壞，消滅病毒。所以，這種方式對(duì)包膜病毒極為有效。

在我國(guó)，有研究用MB/光照對(duì)血漿開展病毒滅活，經(jīng)研究得出：MB/光照病毒滅活血漿中，幾乎全部所有包膜病毒均會(huì)被滅活，但對(duì)無包膜的病毒無效果[13]。

這種方式滅活病毒，操作方便，僅需將無菌MB直接添加在融化的冰凍血漿中，借助適當(dāng)波長(zhǎng)光照干預(yù)，達(dá)到滅活病毒效果。MB/光照對(duì)血漿干預(yù)后，血漿中VSV病毒滴度會(huì)大幅度降低，上升到國(guó)際公認(rèn)的血漿病毒滅活有效指標(biāo)。滅活條件不同，滅活效果不同。如：MB濃度、光照強(qiáng)度不同，滅活病毒效果存在差異。

這種方式能夠完成對(duì)單人份血漿病毒滅活，無需像S/D干預(yù)的血漿自病毒滅活后自血漿分離去污劑，全部操作均簡(jiǎn)單易行。

但是，這種方式依然有難以克服的缺點(diǎn)，利用這種方式滅活病毒后，血漿蛋白的含量、活性會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變。另外，有研究表示：人體中聚集大量的MB，容易造成潛在的突變。美國(guó)，這種方式無法取得FDA認(rèn)可[14]。所以，這一方式在世界范圍中未被所有國(guó)家采用。

5.3 按核酸為靶點(diǎn)的光化學(xué)技術(shù)

這類滅活病毒技術(shù)即核酸打靶技術(shù)，一般用核酸特異性加合形成實(shí)現(xiàn)病毒滅活的介導(dǎo)。最近幾年，補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)光化學(xué)技術(shù)漸漸發(fā)展成熟。目前，這一技術(shù)還比較新穎，在臨床中的應(yīng)用相對(duì)較少，要想在臨床中真正運(yùn)用這一技術(shù)，還有賴于相關(guān)裝置的研發(fā)及技術(shù)的不斷進(jìn)步。

5.4 補(bǔ)骨脂素聯(lián)合紫外線（UVA）照射滅活病毒技術(shù)

補(bǔ)骨脂素分子會(huì)可逆插入DNA、RAN螺旋體重。經(jīng)UVA照射后，補(bǔ)骨脂素分子、核酸分子中嘧啶堿基共價(jià)聯(lián)合。若補(bǔ)骨脂素分子插進(jìn)相鄰嘧啶堿基之間，核酸鏈共價(jià)交叉相連。若交叉連接DNA、RNA螺旋體難以得到及時(shí)修復(fù)，無法繼續(xù)精準(zhǔn)復(fù)制，DNA、RNA病毒會(huì)滅活。因DNA、RNA存在各細(xì)胞核中，血漿中無科學(xué)的有核細(xì)胞治療成分，血漿自身不適成為補(bǔ)骨脂素技術(shù)的打靶點(diǎn)，通過上述病毒滅活技術(shù)干預(yù)后，血漿治療功能會(huì)完好無損。

5.5 核黃素介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)

核黃色，即維生素B2，其分子是多環(huán)共價(jià)聯(lián)合的平面結(jié)構(gòu)，存在一條糖基側(cè)鏈，具有水溶性[14]。平面構(gòu)造是確保核黃插進(jìn)DNA或RNA的堿基構(gòu)造基礎(chǔ)。核黃色易穿透病毒細(xì)胞膜，與DNA、RNA聯(lián)合，經(jīng)短暫的波長(zhǎng)光照后，DNA螺旋、RNA上鳥嘌呤堿基斷裂，DNA、RNA受損，從而對(duì)病毒、細(xì)菌等病毒的轉(zhuǎn)錄與翻譯進(jìn)行抑制，遏制其持續(xù)復(fù)制，發(fā)揮滅活病毒作用。因血小板、紅細(xì)胞無DNA，所以維生素B2對(duì)其無破壞效用。維生素B2有水溶性，易穿透細(xì)胞膜，會(huì)直接穿透細(xì)胞膜，作用在諸多無包膜病毒、細(xì)胞中病毒。

早于1965年，即有學(xué)者開展維生素B2聯(lián)合會(huì)發(fā)現(xiàn)光或紫外線光照滅活病毒研究，其數(shù)據(jù)說明此技術(shù)極為可行。

一般狀況下，人體需自外界取得維生素B2，保持紅細(xì)胞細(xì)胞膜完整，加入新陳代謝。有研究表明：維生素B2介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)滅活病毒后，維生素B2降解產(chǎn)物、攝取的維生素B2自人體正常代謝產(chǎn)物一致。

核黃素滅活血漿病毒研究尚處在初期環(huán)節(jié)，迄今為止，依舊未發(fā)現(xiàn)公開發(fā)表的言論，互聯(lián)網(wǎng)與部分專業(yè)雜志對(duì)應(yīng)報(bào)道較少。有研究用維生素B2是光敏劑，添加在猴子體內(nèi)的血小板中，此血小板懸浮在30%血漿、70%添加液中，波長(zhǎng)＞350nm可見光與紫外線混合照射后，立即在猴子體內(nèi)輸注，血小板中病毒被激活[15]。將新鮮冰凍血漿（FFP）融化后，將其與模型病毒孵育，添加核黃色，借助紫外線照射，照射期間搖晃均勻?？刂茰囟葹?0℃。由結(jié)果得出：這種方式可實(shí)現(xiàn)血漿中模型病毒滅活，且對(duì)有包膜、無包膜病毒均有一定作用。[16]

6 小結(jié)

綜上所述，在輸血治療中，血漿病毒滅活過程是必不可少的，是降低疾病傳播的關(guān)鍵方法。病毒滅活技術(shù)的成功下，臨床血漿輸注會(huì)更為安全，開辟血漿輸注的新路徑。目前，血漿病毒滅活技術(shù)取得進(jìn)步較大，如核黃素介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)，為血液安全性供應(yīng)可靠路徑。在后續(xù)研究中，還有待于相關(guān)技術(shù)及相關(guān)裝置的不斷發(fā)展，才能為輸血安全提供有力保障。