嘔吐毒素的致病機制及防控措施研究進(jìn)展

劉義華，譚會澤,2，苗麗萍，陳 丹，彭運智，劉松柏，楊 露，黎鴻彬

(1.溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527400；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖學(xué)重點實驗室，廣東 云浮 527400)

嘔吐毒素屬于單端孢霉烯族毒素，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)[1]，主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生，因動物采食被DON污染的飼料后，容易產(chǎn)生采食量降低、拒食，甚至發(fā)生嘔吐現(xiàn)象而得名[2]。DON最早是在1970年日本香川縣暴發(fā)的赤霉病大麥中被發(fā)現(xiàn)，并在兩年后被首次分離得到[3]。它廣泛分布于小麥、玉米、大豆等糧食中，是谷物原料和飼料中較常見的霉菌毒素之一[4]。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在pH7、120℃、60 min的處理條件下，僅有少量被破壞降解，因此，在經(jīng)過飼料加工、儲藏和運輸過程后DON仍能穩(wěn)定存在，很容易進(jìn)入人類和動物食物鏈，也因此成為世界上污染最為嚴(yán)重的霉菌毒素之一[5]。DON進(jìn)入動物腸道后，能通過影響免疫細(xì)胞因子生成和免疫細(xì)胞增殖從而降低機體的免疫力，還可抑制調(diào)節(jié)蛋白激酶活性和mRNA翻譯[6-7]，從而加速細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重危害動物健康。因此，采取有效措施去除飼料中的DON，對保障食品和飼料安全以及人和動物健康都具有十分重要的意義。

1 我國飼料和飼料原料中嘔吐毒素污染現(xiàn)狀

DON主要存在于小麥、大麥、玉米等谷物中，尤其在小麥中的污染最為普遍。我國地域遼闊、作物收獲季節(jié)氣候復(fù)雜多變，在東北、西南及華北糧食主產(chǎn)區(qū)，在農(nóng)作物收獲季節(jié)若遇連續(xù)陰雨天氣，空氣濕度增加，適宜生長的霉菌將會由干生性霉菌(白曲霉、灰綠曲霉)向濕生性霉菌改變，這將導(dǎo)致農(nóng)作物DON檢出率和超標(biāo)率顯著升高[8]。溫度和濕度是各種霉菌生長繁殖的重要因素，當(dāng)谷物含水量為22%，溫度為20℃，濕度達(dá)85%左右時，霉菌即可產(chǎn)生大量的DON[9]。丁燕玲等[10]通過整理分析“中國知網(wǎng)”等2015～2020年發(fā)布的30份調(diào)查報告發(fā)現(xiàn)，我國大部分地區(qū)飼料中存在霉菌毒素污染情況，DON在小麥及麩皮、玉米及加工副產(chǎn)品、豆粕，包括全價飼料中均存在較高的檢出率，其中小麥及其副產(chǎn)品中DON檢出率連續(xù)多年高達(dá)90%以上，2020年甚至高達(dá)100%。

2 嘔吐毒素致病機制

2.1 腸道毒性

腸道是動物最大的消化器官，同時也是最大的免疫器官與微生態(tài)環(huán)境。腸道內(nèi)營養(yǎng)吸收面積與轉(zhuǎn)運載體的轉(zhuǎn)運能力是決定腸道營養(yǎng)吸收效率的關(guān)鍵因素，研究表明家禽攝入DON后，腸道絲氨酸轉(zhuǎn)運載體、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2/5(glucosetransporters 2/5)以及鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium-dependentglucosetransporters1，SGLT-1)基因表達(dá)量顯著降低[11]，導(dǎo)致小腸內(nèi)糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運吸收發(fā)生障礙[12]。這類未吸收的糖類、氨基酸到達(dá)后腸段后，經(jīng)過發(fā)酵會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，可能是導(dǎo)致畜禽發(fā)酵型腹瀉甚至嘔吐的原因之一[13]。DON進(jìn)入腸道后刺激腸壁黏膜，導(dǎo)致小腸出現(xiàn)炎癥、潰瘍，甚至引起腸黏膜出血及壞死性腸炎，原因可能是DON經(jīng)腸上皮吸收后，破壞動物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)[14]。小腸絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)以及二者比值(VH/CD)是反應(yīng)腸道營養(yǎng)吸收能力的關(guān)鍵指標(biāo)[15]，腸絨毛、隱窩等部位高蛋白周轉(zhuǎn)率高，更容易受到DON的影響[16]。大量研究表明，DON可以顯著改變小腸VH、CD和杯狀細(xì)胞密度，從而降低腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[17-18]。腸道同時也是動物機體最大的免疫器官，腸道黏膜是其中重要的組成部分。離體和在體試驗均表明，DON可導(dǎo)致腸上皮緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin和E-cadherin的表達(dá)量下降[19-20]。另外，楊婉瑩[21]研究發(fā)現(xiàn)，DON還能通過誘導(dǎo)上游信號因子造血細(xì)胞激酶(Hck)、雙鏈RNA蛋白活化激酶(PKR)的表達(dá)，誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p38-ERK1/2)磷酸化，調(diào)節(jié)p38-ERK1/2通路基因和蛋白的表達(dá)，影響小腸各段炎癥因子(IL-1β、IL-2和IL-8)的表達(dá)和分布，從而誘導(dǎo)腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成腸道黏膜損傷。

2.2 細(xì)胞毒性

DON具有強烈的細(xì)胞毒性，其C12，13-環(huán)氧基基團會導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激、造成細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和組織損傷[22-23]，能作用于粘膜上皮細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞等，造成細(xì)胞程序性死亡。線粒體是DON細(xì)胞毒性的重要靶點，DON可以抑制核糖體60S亞基上的肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心，破壞核糖體的結(jié)構(gòu)以損傷其功能，從而影響細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成過程。DON還可結(jié)合到核糖體28S肽?；D(zhuǎn)移酶位點，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6、COX-2等)的表達(dá)，引起機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并能夠迅速激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，而MAKP作為細(xì)胞核心信號，又可以調(diào)控下游細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[24-25]。趙呈祥[26]發(fā)現(xiàn)，DON可誘導(dǎo)導(dǎo)致豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)細(xì)胞全基因組DNA甲基化水平升高，從而影響核苷酸生物合成、細(xì)胞代謝、蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理學(xué)過程。近幾年的研究表明，DON能大量誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA損傷[27]，李若楠等[28]研究發(fā)現(xiàn)，用2.0 μg/ml DON處理IPEC-J2 24 h后，能夠誘發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡比例和ROS顯著升高(P<0.01)。此外，DON還可以通過抑制卵丘擴張和紡錘體畸形、干擾微管動力學(xué)，影響豬卵母細(xì)胞正常發(fā)育[29]，在公豬上DON能導(dǎo)致豬睪丸支持細(xì)胞線粒體膜電位極顯著下降(P<0.01)，并擾亂細(xì)胞周期，使細(xì)胞停留在G2期，導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞凋亡[30]，從而影響種畜禽動物的繁殖性能。

2.3 神經(jīng)毒性

DON具有神經(jīng)毒性，會導(dǎo)致動物產(chǎn)生厭食及嘔吐反應(yīng)。DON可以穿過血腦屏障到達(dá)大腦，促進(jìn)大腦內(nèi)部血清素含量的升高，干擾腦干最后區(qū)的調(diào)控功能[31]，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生味覺厭惡，從而使得動物產(chǎn)生拒食甚至嘔吐的行為[32]。不同動物受DON產(chǎn)生的厭食影響差異較大，影響從大到小依次為豬、小鼠、大鼠、家禽和反芻動物[33]。DON還能刺激大腦各區(qū)域組織，導(dǎo)致大腦發(fā)生病變，影響雛雞腦部的脂質(zhì)過氧化水平，從而擾亂鈣穩(wěn)態(tài)的平衡以及神經(jīng)遞質(zhì)分泌[34]。同樣，朱雷等[31]研究發(fā)現(xiàn)，DON能使仔豬腦組織中Ca2+含量以及5-羥色胺(5-HT)顯著增加，同時使乙酰膽堿及多巴胺的含量顯著下降，還能使小腦組織中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ基因(CaMKⅡ)及鈣調(diào)蛋白基因(CaM)表達(dá)降低，降低CaM蛋白表達(dá)水平，說明DON可影響神經(jīng)遞質(zhì)分泌，對斷奶仔豬產(chǎn)生有一定的神經(jīng)毒性作用。

2.4 免疫毒性

DON對多種免疫細(xì)胞具有毒性作用，主要體現(xiàn)在對免疫細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象、對免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的影響以及啟動免疫細(xì)胞凋亡的程序等。研究表明，DON可以抑制動物的免疫機能，誘導(dǎo)小鼠小腸黏膜和胸腺的T、B淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，降低γ干擾素(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)，抑制動物體內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖。張婭菲等[35]研究表明，DON能使仔豬血清補體3(C3)及補體4(C4)、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量均顯著降低(P<0.05)，且小腸各段腸黏膜中免疫球蛋白表達(dá)水平隨DON含量的增加而顯著降低(P<0.05)，表明DON可降低斷奶仔豬的腸道黏膜免疫及體液免疫水平，進(jìn)而改變仔豬的免疫功能。劉雙雙等[36]研究表明，DON在終濃度為0.5、1、2 μmol/L時均極顯著地降低了刀豆球蛋白A(ConA)介導(dǎo)的T細(xì)胞的相對活性和CD25、CD71的表達(dá)水平(P<0.01)，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，表明DON對動物機體產(chǎn)生免疫抑制作用，與其抑制T淋巴細(xì)胞的活化有關(guān)[37]。

3 嘔吐毒素防治措施

3.1 預(yù)防田間嘔吐毒素的產(chǎn)生

為了預(yù)防DON對谷物的污染，應(yīng)防止其在田間的產(chǎn)生和累積，同時在谷物收割后保持良好的運輸及儲存條件[38]。選擇具有毒素抗性的作物品種、加強種植環(huán)節(jié)的管理、注意收獲時的天氣情況等也能有效減少谷物DON的積累。還可以通過對土壤進(jìn)行深耕的方式對秸稈進(jìn)行深埋處理，減少殘留于土地表面的霉菌數(shù)量，為來年的種植提供相對安全的土壤環(huán)境。此外，張升等[39]通過研究發(fā)現(xiàn)，不同氮源對禾谷鐮刀菌產(chǎn)DON毒素的作用差異較大，賴氨酸、酪氨酸作為氮源對禾谷鐮刀菌產(chǎn)DON毒素的促進(jìn)作用顯著強于硝態(tài)氮(P<0.05)，纈氨酸、蛋氨酸弱于硝態(tài)氮。使用生物殺蟲劑四霉素能顯著降低小麥赤霉病指數(shù)和DON積累水平，并且與美康唑表現(xiàn)出協(xié)同作用[40]。因此選擇合適的氮肥、農(nóng)藥也有助于減少田間DON的產(chǎn)生。

3.2 物理脫毒

通過水洗、脫殼加工、機械挑除、高溫滅菌、吸附等物理方式均能對霉菌毒素產(chǎn)生一定的清除效果。小麥中的DON主要分布于麩皮，其含量高于芯粉，通過去皮加工可去除部分DON[41]。孫寶勝[42]研究發(fā)現(xiàn)，DON與小麥不完善粒及赤霉病粒之間存在顯著正相關(guān)性。當(dāng)前飼料行業(yè)廣泛使用的機械挑除法，可通過色選的方式剔除被DON污染較重的不成熟玉米粒和破碎玉米粒[43]。蒙脫石(硅鋁酸鹽)是一類常用的霉菌毒素吸附劑，其硅氧四面體和鋁氧八面體通過共用氧聯(lián)結(jié)形成的含氧酸鹽礦物質(zhì)具有較強的離子極性，加上范德華力，對同樣具有離子極性的霉菌毒素具有較為良好的吸附效應(yīng)，但這類吸附劑對玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1吸附效果較好，對DON吸附效果欠佳，并會吸附飼料中的維生素等營養(yǎng)成分。然而，經(jīng)過改性處理的蒙脫石可以極顯著提高對DON的吸附率[44]。酵母細(xì)胞壁也是一種常見的霉菌毒素吸附劑，主要由甘露聚糖和β-葡聚糖通過離子鍵、氫鍵和疏水作用力與霉菌毒素結(jié)合起到吸附作用。雖然酵母細(xì)胞壁對DON的吸附效率較低，但能夠緩解DON對豬生長性能的負(fù)面影響[45]。乳酸菌細(xì)胞表面具有疏水性，可通過細(xì)胞壁多糖、肽聚糖和磷壁酸對DON產(chǎn)生吸附作用，據(jù)報道，某些乳酸菌對DON的吸附效率為10%～55%[46]，并能在一定程度上緩解由DON引起的肉雞肝臟毒性和肝臟損傷[47]。

3.3 化學(xué)脫毒

對霉菌毒素的化學(xué)脫毒主要集中于強酸、強堿處理法，或使用某些化學(xué)制劑如氨水、臭氧等。霉菌毒素對弱酸具有抵抗性，但在堿性環(huán)境下，其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使其毒性下降。氫氧化鈉(NaOH)和氨(NH3)是食品工業(yè)中常用的堿，在室溫條件下，發(fā)霉小麥在NaOH和NH3中分別處理1 h和18 h后，DON濃度分別降低了9%和85%[48]。臭氧能夠攻擊單端孢霉烯族毒素的雙鍵，與DON的功能性基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而達(dá)到脫毒目的[49]，且反應(yīng)產(chǎn)物為氧氣，不會產(chǎn)生有害殘留物，對環(huán)境無不良影響。任東亮[50]研究發(fā)現(xiàn)在用14 g/m3濃度臭氧氣體處理180 min后，小麥麩皮中DON降解率可以達(dá)到76.23%；臭氧對溶液中的DON降解率更高，在用10.84 g/m3濃度臭氧氣體處理9 min后，溶液中DON降解率可達(dá)到98.30%。化學(xué)脫毒法雖能在一定程度上降解DON，但在脫毒過程中難以避免地的產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)的殘留，并降低飼料營養(yǎng)價值，因而限制了該方法在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用[51]。

3.4 生物脫毒

生物脫毒主要是利用微生物產(chǎn)生的酶對霉菌毒素進(jìn)行降解，或者是通過菌體自身的吸附作用并結(jié)合其代謝產(chǎn)物對霉菌毒素進(jìn)行脫毒處理[52]。這種脫毒方法能夠防止被破壞的霉菌毒素在動物腸道內(nèi)進(jìn)行二次釋放，同時也能避免動物腸道內(nèi)霉菌毒素隨排泄物進(jìn)入自然環(huán)境，起到保護環(huán)境的作用[53]。Yu等[54]從雞腸道中分離出10株菌，它們可將DON轉(zhuǎn)化成為毒性更低的脫環(huán)氧嘔吐毒素(DOM-1)。田祖光等[55]從小麥土壤中篩選出一株暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，其上清液中的活性物質(zhì)對DON的降解能力可達(dá)到84.6%，相對于已報道的多株DON降解菌株，該菌降解效率達(dá)到較高水平。Eliana等[56]發(fā)現(xiàn)米根霉和米曲霉能利用過氧化物酶活性來降解DON。進(jìn)年來，伴隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究人員針對不同種類霉菌毒素的主要功能基團，培育出一系列專用的酶，以單端孢霉烯族毒素為例，氯酶可以通過破壞環(huán)氯基團、環(huán)氧基酶可以通過破壞C12和C13位點上的環(huán)氧化物，起到降低其毒性作用[57]。熱休克蛋白70(Hsp70)已被證實具有分子伴侶功能，可提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性、減輕細(xì)胞過氧化、抗細(xì)胞凋亡等功能[58]，董永芳等[59]研究發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素脫毒菌(sp.WJ106)可以調(diào)節(jié)Hsp70蛋白的異常表達(dá)，能在一定程度上緩解DON對豬腸道損傷和生產(chǎn)性能下降的影響。

3.5 抗氧化解毒

大量研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑能在一定程度上緩解DON產(chǎn)生的影響。白藜蘆醇作為一種天然抗氧化劑，可有效緩解DON對豬腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和損傷作用[60]。谷氨酰胺(Gln)也具有抗氧化功能，能夠促進(jìn)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)基因的表達(dá)，還能抑制一氧化氮的合成速率，調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)過程中細(xì)胞凋亡酶的活性，并參與抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的合成和由TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用[61]。研究發(fā)現(xiàn)，Gln還可以降低IPEC-J2細(xì)胞由DON導(dǎo)致的過量ROS，這可能是由于谷胱甘肽促進(jìn)了GSH-Px的合成，提高了細(xì)胞抗氧化能力，清除過量的氧自由基，從而緩解了由 DON 引起的細(xì)胞損傷。氯喹(CQ)是一種抗瘧疾藥物，具有明顯的抗氧化功能[62]，能顯著提高血漿谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px活性和總抗氧化能力(T-AOC)，并能緩解DON造成的仔豬生長抑制作用，表明CQ抑制自噬能提高機體抗氧化酶活性和抗氧化能力，起到緩解DON誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用[63]。研究發(fā)現(xiàn)，魚皮明膠酶解物能促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)，并能促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)，有效降低活性氧水平，從而起到抑制DON誘導(dǎo)的氧化損傷。童雅琪[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母活性肽可以激活機體抗氧化調(diào)節(jié)機制，調(diào)節(jié)胞漿肌動蛋白伴侶分子-核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子E2(Keap1-Nrf2)信號通路下游抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，緩解DON導(dǎo)致的豬腸道上皮細(xì)胞毒性損傷。朱雷[64]研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸可顯著降低ZEA與DON對仔豬睪丸支持細(xì)胞的細(xì)胞器造成的損傷，極顯著降低MDA、ROS的表達(dá)量(P<0.01)，并極顯著降低睪丸支持細(xì)胞的凋亡率(P<0.01)。

4 小結(jié)

隨著各種飼料原料價格的攀升，糧食副產(chǎn)物被大量使用，尤其是小麥、玉米價格持續(xù)倒掛，大量小麥、小麥混合物用于飼料，造成DON污染范圍、程度不斷擴大，使飼料中DON含量大幅增長。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對DON的脫毒方法進(jìn)行了大量研究，各種脫毒方法也得到了廣泛的應(yīng)用。但還需進(jìn)一步研究和了解相關(guān)的脫毒機制，為DON脫毒產(chǎn)品的研發(fā)和畜禽健康養(yǎng)殖提供理論和實踐依據(jù)。