胚胎發(fā)育生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

謝聰聰，王雪瑩，安 卓，姚勝杰，馬 婧，王樹松,*

(1.河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院 河北省生殖醫(yī)院 國家衛(wèi)生健康委員會計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071； 2.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院， 河北 石家莊 050017)

自1978年世界首例采用體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)的嬰兒誕生以來，相關(guān)的輔助生殖技術(shù)得到迅速的發(fā)展，全球運(yùn)用輔助生殖技術(shù)已經(jīng)誕生了500 多萬人，但輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)的妊娠率亟需提高。體外受精的最終目的是植入具有最高發(fā)育潛能的胚胎，而影響卵子受精、胚胎發(fā)育和植入的因素有很多。胚胎質(zhì)量直接影響體外受精的結(jié)局，如何評估胚胎的發(fā)育潛能是研究的熱點(diǎn)。目前，對胚胎質(zhì)量的評估方法主要有形態(tài)學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等。代謝組學(xué)主要通過對生物新陳代謝過程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律進(jìn)行研究，揭示生物體生理和病理狀態(tài)下生長及發(fā)育各個環(huán)節(jié)的特點(diǎn)。代謝組學(xué)在ART方面具有很重要的意義，胚胎代謝物與胚胎發(fā)育之間有著密切的關(guān)系。將形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)結(jié)合，有望確定胚胎生長發(fā)育的生物標(biāo)志物，快速、非侵入性的鑒別優(yōu)質(zhì)胚胎，提高ART的妊娠率?，F(xiàn)將胚胎發(fā)育生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 氨基酸是胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控參數(shù)

整個機(jī)體氨基酸的生物利用度和代謝與其他營養(yǎng)物質(zhì)相互作用，對生殖的生理過程至關(guān)重要，包括配子發(fā)生、受精、植入、胎盤，胎兒生長和發(fā)育。氨基酸是培養(yǎng)基的重要組成部分，用于體外培養(yǎng)受精卵到囊胚階段，培養(yǎng)液中添加氨基酸可增加胚胎體外培養(yǎng)的妊娠率[1]。

氨基酸代謝是卵母細(xì)胞發(fā)育所必需的。已發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂缺陷、細(xì)胞器功能障礙和表觀遺傳改變與細(xì)胞中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降低和糖/脂含量的增加密切相關(guān)[2]。雖然胚胎形態(tài)相似，但是不同發(fā)育階段胚胎氨基酸代謝確有不同，胚胎發(fā)育是否阻滯與其氨基酸的代謝利用率有明顯不同。通過分析不同發(fā)育階段胚胎的氨基酸代謝情況，第2～3天發(fā)育潛能較好的胚胎對谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸攝取量少，分泌丙氨酸和天冬酰胺較少；8細(xì)胞到桑椹胚階段對絲氨酸攝取量少，而丙氨酸、甘氨酸釋放量少[3]。整個胚胎發(fā)育過程中持續(xù)產(chǎn)生丙氨酸，持續(xù)攝取亮氨酸。高發(fā)育潛能的胚胎處于低氨基酸代謝狀態(tài)。胚胎攝取天冬酰胺、甘氨酸和亮氨酸與臨床妊娠和活產(chǎn)顯著相關(guān)，胚胎培養(yǎng)液中妊娠組天冬酰胺的量較未妊娠者明顯增加，而甘氨酸和亮氨酸明顯減少，發(fā)育潛能較好的胚胎氨基酸代謝明顯低于發(fā)育阻滯的胚胎[1]。采用高效液相色譜檢測培養(yǎng)液，結(jié)果表明培養(yǎng)液中谷氨酰胺和丙氨酸水平與妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)[4]。并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有6種氨基酸(天門冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、天絲氨酸、亮氨酸和賴氨酸)代謝在整倍體和非整倍體胚胎之間存在明顯差異[5]。

因此，氨基酸是胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵的調(diào)控參數(shù)，其利用率可作為檢測胚胎發(fā)育潛能的合理指標(biāo)，但是需要大量循證醫(yī)學(xué)的結(jié)果，根據(jù)培養(yǎng)液氨基酸濃度指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)胚胎的篩選。

2 碳水化合物是胚胎發(fā)育的主要能量來源

胚胎培養(yǎng)液中碳水化合物主要是葡萄糖和丙酮酸。胚胎發(fā)育所需的ATP有兩個主要途徑分別是有氧糖酵解和無氧糖酵解。在胚胎發(fā)育的早期階段(致密化前)，丙酮酸和乳酸是其主要能量來源。到了胚胎發(fā)育晚期，葡萄糖攝取穩(wěn)步上升，從桑椹胚到囊胚的過渡期，葡萄糖的利用率顯著增加。葡萄糖可以通過線粒體的作用發(fā)揮其早期的有益效應(yīng)，丙酮酸作為胚胎培養(yǎng)液底物的能源之一，它能夠抑制卵母細(xì)胞的老化[6]。

2.1 丙酮酸與胚胎發(fā)育

丙酮酸對哺乳動物的發(fā)育潛力是必需的。在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，豬培養(yǎng)基中添加丙酮酸可以提高受精率(metaphase Ⅱ，MⅡ)和囊胚率，進(jìn)而提高早期胚胎發(fā)育潛能[7]。通過對第4天胚胎培養(yǎng)液分析，發(fā)現(xiàn)丙酮酸攝取量高的胚胎更容易形成囊胚[1]。植入率高的胚胎對丙酮酸吸收波動是相對較小的。然而2～8細(xì)胞的胚胎，丙酮酸的吸收與胚胎活力和妊娠呈負(fù)相關(guān)[1]。

2.2 葡萄糖與胚胎發(fā)育

糖是胚胎培養(yǎng)液中主要的能源物質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中糖主要以糖酵解途徑、己糖胺生物合成途徑和磷酸戊糖途徑等發(fā)揮作用。因此，通過檢測胚胎培養(yǎng)液中糖的吸收和代謝可以作為預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的重要標(biāo)記。對葡萄糖攝取高的囊胚發(fā)育潛能更高，優(yōu)質(zhì)胚胎對葡萄糖攝取量多[8]。妊娠組胚胎對培養(yǎng)液中葡萄糖的攝取顯著高于未妊娠組[9]。葡萄糖與囊胚發(fā)育有著緊密聯(lián)系，可以作為囊胚發(fā)育的一個生物標(biāo)志物。

胚胎對葡萄糖及丙酮酸的攝取與妊娠結(jié)局的關(guān)系受到多因素的影響，如：研究對象的不同、周期特征、刺激方案、胚胎培養(yǎng)條件、儀器設(shè)備等。因此，把葡萄糖和丙酮酸作為胚胎發(fā)育生物標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)研究需要進(jìn)一步完善。

3 細(xì)胞因子是胚胎發(fā)育和植入潛能的標(biāo)志

細(xì)胞因子是指由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成并分泌的一類生物活性分子，它們介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息交換與相互調(diào)節(jié)，參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)過程?？扇苄匀税准?xì)胞抗原因子-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)、β-人絨毛促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)、血小板活性因子(platelet activating factor，PAF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、瘦素(leptin)等內(nèi)源性“調(diào)節(jié)因子”可以作為胚胎發(fā)育和植入潛力的指標(biāo)[10]。胚胎和子宮內(nèi)膜分泌的細(xì)胞因子調(diào)控植入過程，在植入期間專注于母胎對話，現(xiàn)在對生物標(biāo)志物的關(guān)注越來越多，因?yàn)樗鼈兛赡茉谥踩牒腿焉镞^程中具有很好的預(yù)后特性。

3.1 sHLA-G與胚胎發(fā)育和植入潛能

白細(xì)胞抗原-G(human leukocyte antigen G，HLA-G)是一種具有限制性表達(dá)模式的非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，HLA-G主要由母胎界面外滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的主要組織相容性復(fù)合分子，sHLA-G是HLA-G的蛋白產(chǎn)物，可結(jié)合NK 細(xì)胞抑制受體，保護(hù)胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的殺傷，對維持正常的妊娠過程起著重要的作用。sHLA-G 在早期的胚胎培養(yǎng)液中存在表達(dá)，并且與胚胎的早期發(fā)育和種植密切相關(guān)[11]。大部分妊娠患者組HLA-G的濃度顯著高于非妊娠組，針對卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracyto-plasmic sperm injection,ICSI)患者移植sHLA-G呈陽性的胚胎妊娠率和種植率顯著高于移植sHLA-G 陰性組，因此sHLA-G 可以作為評價胚胎質(zhì)量和獲得更好臨床結(jié)局的指標(biāo)[10]。59.73 IU/mL sHLA-G是區(qū)分妊娠和持續(xù)妊娠患者與未妊娠或流產(chǎn)患者的最敏感和特異的閾值[12]。sHLA-G具有明確定義范圍和標(biāo)準(zhǔn)單位可提供一種非侵入性方法來鑒定最適合移植的胚胎，可用作胚胎篩選的標(biāo)志物。

3.2 β-hCG與胚胎發(fā)育和植入潛能

β-hCG在胚胎培養(yǎng)液中的定量被認(rèn)為是滋養(yǎng)外胚層分化和囊胚活力的一個有力指標(biāo)[10]。利用培養(yǎng)液中β-hCG水平來評價胚胎質(zhì)量是輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。胚胎培養(yǎng)液中總β-hCG水平能夠區(qū)分形態(tài)相似的同級別胚胎哪個更適合移植。β-hCG在早期胚胎發(fā)育的各個階段幾乎均有表達(dá)，胚胎分泌β-hCG含量與胚胎種植潛能顯著相關(guān)，并且單囊胚分泌β-hCG含量可預(yù)測囊胚質(zhì)量，優(yōu)質(zhì)囊胚的β-hCG分泌量顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚和發(fā)育阻滯的胚胎[13]。

3.3 PAF與胚胎發(fā)育和植入潛能

PAF是一種脂質(zhì)介質(zhì)，具有多效生物學(xué)特性的信號磷脂。PAF在調(diào)控生殖生理各個方面起著重要作用，外源PAF與起始形成肌醇三磷酸和二?；视偷募?xì)胞表面受體結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)鈣的水平，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育。人類、小鼠、綿羊、兔、豬等多個物種在植入前胚胎分泌PAF，在擴(kuò)張囊胚的培養(yǎng)液中可檢測PAF的含量。胚胎分泌的PAF在胚胎代謝，生長和發(fā)育過程中具有重要作用，外源性添加PAF可刺激胚胎代謝和分裂，提高胚胎生長和發(fā)育，胚胎分泌PAF含量增加，相應(yīng)的妊娠率也會增加[14]。因此，PAF可以作為篩選胚胎和預(yù)測妊娠結(jié)局的標(biāo)志物。

3.4 IGFs與胚胎發(fā)育

IGFs是一種具有多功能細(xì)胞增殖調(diào)控的多肽物質(zhì)， IGF-1和IGF-2是目前發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子家族中僅有的成員。胚胎分泌的IGF-1可刺激對葡萄糖的攝取，并且對胚胎細(xì)胞增殖和分化起著重要調(diào)控作用。多囊卵巢綜合征患者卵泡液中高水平IGF-1其獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率高于低IGF-1水平組[15]。在胚胎培養(yǎng)液中補(bǔ)充IGF-1可能會通過脂質(zhì)代謝、卵母細(xì)胞功能和線粒體功能相關(guān)基因的差異表達(dá)而影響胚胎的能力[16]。IGF-2對胚胎的發(fā)育速度起著調(diào)控作用。胚胎培養(yǎng)液中IGF-2的濃度隨著胚胎的生長而增加，并且在桑椹胚到囊胚轉(zhuǎn)化時濃度較高，可很好地檢測到，在人胚胎培養(yǎng)液中添加IGF-2后滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率降低[17]。IGFs對胚胎的發(fā)育具有一定的作用，但是否是胚胎植入前的重要因素需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5 其他生物標(biāo)志與胚胎發(fā)育和植入潛能

EGF和TGF-α具有相似的氨基酸序列，且均與EGF受體結(jié)合，屬于表皮生長因子家族的成員。EGF受體可能參與胚胎早期發(fā)育和著床過程，在胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮特定作用，胚胎的特定生長因子以自分泌或旁分泌方式參與著床前胚胎發(fā)育和囊胚的形成[18]。在牛胚胎的培養(yǎng)基中同時添加了牛血清白蛋白和EGF，提高了囊胚的孵化能力和囊胚的細(xì)胞總數(shù)，提高了滋養(yǎng)層細(xì)胞的入侵能力[19]。Leptin是一種16 ku的小型營養(yǎng)肽，在人囊胚培養(yǎng)液中可檢測到大量的leptin，囊胚分泌的leptin顯著高于早卵裂的胚胎，leptin通過調(diào)控卵丘激活因子來調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，促進(jìn)囊胚的多能性[20]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)添加到人的胚胎培養(yǎng)液中顯著促進(jìn)了胚胎的發(fā)育，增加了 IL-6濃度與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性可能與囊胚形成時間有關(guān)，D6組囊胚胚胎液中IL-6濃度顯著高于D5組[21]。通過對單個微滴培養(yǎng)液中IL-6分析，結(jié)果表明妊娠囊胚組對IL-6的攝取增加，IL-6在囊胚發(fā)育和植入中具有潛在作用。在胚胎培養(yǎng)液中添加IL-1β顯著增加囊胚質(zhì)量[22]。

細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，基于單個細(xì)胞因子的檢測評估胚胎質(zhì)量相對困難，聯(lián)合檢測多因子，甚至是聯(lián)合形態(tài)學(xué)特征、發(fā)育動力學(xué)特征等綜合評估是十分必要的。目前，實(shí)現(xiàn)單個胚胎培養(yǎng)液中多個細(xì)胞因子的共同檢測具有一定的前景。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的胚胎發(fā)育生物標(biāo)志物

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對人類胚胎分泌物的研究越來越深入。在人類胚胎分泌物的初期研究，主要進(jìn)行單個蛋白質(zhì)或分子的靶向分析。時間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)在第3天胚胎的分泌物中檢測到蛋白，觀察到蛋白質(zhì)表達(dá)譜與胚胎發(fā)育明顯相關(guān)，第一個成功分析人類胚胎分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，并提出通過對胚胎分泌物的分析可提供非侵入性的胚胎評估方法[23]。非整倍體和整倍體胚胎分泌的蛋白等代謝產(chǎn)物之間具有明顯差異，載脂蛋白1(lipocalin-1)確定為非侵入性非整倍體篩選的潛在生物標(biāo)志物。非整倍體囊胚的lipocalin-1的分泌增加可以代表胚胎本身的受損狀態(tài)，反映了非整倍體囊胚的情況[24]。

由于受研究過程的限制，如蛋白質(zhì)濃度低、儀器設(shè)備檢出限低等，目前對植入前胚胎分泌蛋白質(zhì)的認(rèn)識有限。但胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)分析對胚胎發(fā)育選擇是一種比較好的方法，具有很好的發(fā)展前景。

5 問題與展望

本文總結(jié)了近些年與胚胎質(zhì)量有關(guān)的物質(zhì)，都有可能成為篩選胚胎的生物標(biāo)志物。由于胚胎發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，包括卵子受精、胚胎分裂、增殖、植入等多個因素，如何運(yùn)用無創(chuàng)的方法精準(zhǔn)篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎是研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，目前還沒有明確篩選胚胎的唯一標(biāo)準(zhǔn)，但可以通過胚胎發(fā)育的生物標(biāo)志物篩選優(yōu)質(zhì)胚胎和發(fā)育潛能高的胚胎。根據(jù)胚胎的不同發(fā)育階段，在每一階段選擇合適準(zhǔn)確的標(biāo)志物，這是未來輔助生殖技術(shù)的研究方向和熱點(diǎn)。在新技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究標(biāo)志物對胚胎發(fā)育的機(jī)制，使標(biāo)志物評價胚胎發(fā)育成為普遍可行的方法。