免疫熒光技術(shù)在皮膚活檢組織真菌染色中的應(yīng)用

陳學(xué)超 于永翔 王建文 暴芳芳 周桂芝 陳聲利 盧憲梅 劉永霞

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院)，山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

真菌感染是皮膚科常見(jiàn)皮膚病之一，分為淺部真菌病和深部真菌病。真菌病原學(xué)檢查是診斷真菌病的根本依據(jù)，真菌病原學(xué)檢測(cè)手段一直以來(lái)也是臨床最為迫切的需求。目前真菌檢測(cè)方法主要包括直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查等。組織病理學(xué)檢查方法主要有蘇木素-伊紅(HE)染色、過(guò)碘酸-雪夫氏液染色(Periodic acid-Schiff stain，PAS)、Gomori六胺銀染色(Gomorig methenamine silver stain, GMS)等。

近年來(lái)又出現(xiàn)了真菌免疫熒光染色技術(shù)[1]，其熒光染料的主要成分是熒光增白劑(calcofluor white, CFW)，能與多種植物以及真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)和纖維素親和，在350～400 nm波長(zhǎng)下發(fā)出亮藍(lán)色熒光；因真菌細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)和纖維素的β葡聚糖成分，在熒光顯微鏡視野中能清晰觀察真菌形態(tài)。我們對(duì)43例皮膚真菌感染其中深部真菌感染病例41例石蠟包埋切片進(jìn)行免疫熒光染色，并與傳統(tǒng)的PAS染色法進(jìn)行比較，以期為病理技術(shù)中真菌的檢測(cè)提供一種新的輔助方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧研究山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院2019年1月至2020年12月臨床確診的43例皮膚真菌感染患者，其中男19例，女24例，平均年齡59.3歲；感染部位：面部10例，上肢13例，手14例，指甲1例，胸部2例，背部2例， 下肢1例。其中包括：孢子絲菌37例，著色真菌1例，花斑癬1例，馬拉色菌1例，其他真菌感染3例。入選標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿(mǎn)足以下條件：(1)病理活檢組織學(xué)上明確診斷感染性肉芽腫或淺部真菌??；(2)真菌鏡檢與培養(yǎng)證實(shí)為真菌感染。

1.2 檢測(cè)試劑 熒光染色劑工作液(濟(jì)南德亨醫(yī)學(xué)科技有限公司)；PAS染色劑：自配(堿性品紅：上海試劑三廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將入選的43例真菌病患者的石蠟包埋組織塊2 μm連續(xù)切8片，每張載玻片撈片4張，脫蠟至水洗，分別進(jìn)行免疫熒光染色和PAS染色。

PAS染色：滴加高碘酸室溫孵育10分鐘；蒸餾水洗，滴加shiff氏液，室溫孵育20分鐘，流水沖洗，蘇木素襯染，脫水、透明、封片；光學(xué)顯微鏡下觀察。

免疫熒光染色：在暗室內(nèi)，將免疫熒光染色劑直接滴加在待檢標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，立即放置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩種真菌檢測(cè)法陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下表現(xiàn) PAS染色：需每個(gè)視野仔細(xì)查找，耗時(shí)長(zhǎng)；鏡下表皮基底膜呈紅色線狀或帶狀，真菌孢子呈圓形或橢圓形，孢子壁呈紅色圓環(huán)狀；真菌菌絲呈紅色棒狀或條狀；背景為藍(lán)紫色(圖1)。

免疫熒光染色：低倍鏡即可快速發(fā)現(xiàn)孢子或菌絲，耗時(shí)短；鏡下真菌孢子呈圓形或橢圓形，呈亮藍(lán)色或藍(lán)綠色；真菌菌絲呈亮藍(lán)色棒狀或條狀；背景呈暗藍(lán)色(圖1)。

1a:PAS染色示淺部真菌病角質(zhì)層內(nèi)見(jiàn)紫紅色真菌菌絲、孢子(×200);1b、1c：免疫熒光染色角質(zhì)層見(jiàn)較多亮藍(lán)色菌絲、孢子(×200)；1d:PAS染色示真皮多核巨細(xì)胞內(nèi)圓形孢子(藍(lán)色箭頭所示)(×400);1e、1f：免疫熒光染色真皮內(nèi)見(jiàn)多個(gè)亮藍(lán)色圓形孢子(紅色箭頭所示)(1e:×200;1f:×400)

2.2 PAS染色與免疫熒光染色兩種方法比較 43例皮膚真菌病患者中PAS染色陽(yáng)性27例(62.8%)，免疫熒光染色陽(yáng)性30例(69.7%)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，PAS染色法陽(yáng)性率與直接免疫熒光染色法陽(yáng)性率比較：χ2=0.468240,P=0.493798，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 免疫熒光與PAS兩種染色方法聯(lián)合使用 43例皮膚真菌病患者PAS染色與免疫熒光染色兩種方法均陽(yáng)性19例(44.2%)，其中有一種方法陽(yáng)性38例(88.4%)，兩種方法均陰性5例(11.6%),見(jiàn)表1。

表1 免疫熒光染色法與PAS染色法結(jié)果比較 例(%)

3 討論

真菌可以引起皮膚、黏膜、皮下組織及其它器官的感染，在感染性疾病中，真菌感染病原菌種類(lèi)最多，發(fā)病率最高、流行也最廣。皮膚是人體的一大器官，真菌感染常先表現(xiàn)在皮膚上，皮膚真菌感染分為淺部真菌病和深部真菌病。真菌的檢出對(duì)臨床的診斷和治療顯得尤為重要。

組織病理對(duì)真菌病的診斷具參考意義，HE染色、六胺銀染色、PAS染色是真菌組織病理最常用的檢測(cè)方法。HE染色對(duì)曲霉和結(jié)合菌、著色芽生菌等染色較好，不掩蓋真菌本身的顏色，是必不可少的染色方法，但大多數(shù)真菌HE染色后，組織顏色與真菌顏色相近，不易分辨，為了更好的顯示組織中的真菌，常需要其他特殊染色方法，如六胺銀、PAS染色。六胺銀能將真菌細(xì)胞壁著棕黑色，可清晰顯示真菌輪廓與形態(tài)，但操作復(fù)雜，染液不能長(zhǎng)期保存，且假陽(yáng)性率較高。PAS染色可使真菌胞壁著色深紅，胞質(zhì)呈淺紅，操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但品紅染液配制過(guò)程復(fù)雜，對(duì)配制器皿清潔度要求極高，極易配制失敗，且染色過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，脫蠟進(jìn)水后的切片，完成PAS染色平均時(shí)長(zhǎng)約40分鐘，且組織中含中性粘多糖的組織和細(xì)胞均著色容易形成共染現(xiàn)象，不易分辨，可能出現(xiàn)漏診現(xiàn)象[2]。

與六胺銀和PAS染色相比，免疫熒光染色檢測(cè)能夠高效、特異性地結(jié)合真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和纖維素的β葡聚糖等，在355 nm紫外光激發(fā)下與真菌結(jié)合的熒光染色劑會(huì)迅速發(fā)出亮藍(lán)色熒光，與周?chē)尘皩?duì)比強(qiáng)烈，從而可以在熒光顯微鏡快速查找到真菌。國(guó)外免疫熒光染色早已廣泛應(yīng)用于真菌檢測(cè)[3]。 而國(guó)內(nèi)由于熒光顯微鏡的缺乏等，免疫熒光染色法在真菌病診斷上的應(yīng)用起步較晚，目前應(yīng)用石蠟包埋組織切片的檢測(cè)研究較少[4，5]。本研究將臨床確診的43例皮膚真菌感染病例石蠟包埋切片進(jìn)行免疫熒光染色，在皮膚組織中免疫熒光染色可以快速清晰顯示真菌菌絲、孢子結(jié)構(gòu)，較PAS染色陽(yáng)性病例略有提高，但兩者之間結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但將兩種方法聯(lián)合使用可明顯提高真菌檢出率(表2)。

表2 免疫熒光染色與PAS染色主要特點(diǎn)對(duì)比

為提高真菌免疫熒光染色的檢出率，在免疫熒光染色過(guò)程中應(yīng)注意：(1)需要有一定閱片經(jīng)驗(yàn)的病理診斷醫(yī)師結(jié)合HE染色正確判讀，勿將背景中的膠原纖維或雜質(zhì)誤認(rèn)為真菌菌絲孢子，可加入KOH溶液降低背景；(2)需多個(gè)切面觀察，在操作過(guò)程中容易脫片，建議使用防脫切片且多切幾個(gè)切面；(3)熒光染料試劑需避光保存，常溫保存期一般為半年至一年；(4)熒光染色后容易發(fā)生減退或淬滅，染色后應(yīng)立即放熒光顯微鏡下讀片、拍照，切片無(wú)法長(zhǎng)期保存。

綜上所述，真菌免疫熒光染色在皮膚活檢組織中是一種高效、快速、準(zhǔn)確顯示真菌菌絲孢子的檢測(cè)方法，與PAS染色聯(lián)合使用可明顯提高真菌檢出率，是提高皮膚真菌病真菌檢出的重要補(bǔ)充方法，值得在皮膚真菌病檢測(cè)中推廣應(yīng)用。