激光捕獲顯微切割技術(shù)在皮膚病研究中的應(yīng)用

鄭雨潔 魯 嚴(yán)

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院江蘇省人民醫(yī)院皮膚科,南京，210000

激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection, LCM)是在不破壞組織結(jié)構(gòu)、保持要捕獲的細(xì)胞和其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋的組織切片中獲取靶細(xì)胞。激光捕獲顯微切割技術(shù)通過捕獲人表皮細(xì)胞，并與實(shí)時定量PCR、質(zhì)譜分析等技術(shù)相結(jié)合，提取并研究正常表皮基因組及蛋白質(zhì)等。通過激光捕獲顯微切割技術(shù)抓取熒光標(biāo)記后的腫瘤細(xì)胞、黑素細(xì)胞等對皮膚老化、皮膚腫瘤、銀屑病、白癜風(fēng)等常見皮膚疾病的特征細(xì)胞精準(zhǔn)分析，從而得到不同疾病皮膚特征細(xì)胞的基因特異性表達(dá)，為皮膚病學(xué)研究提供了更為靈敏快速的研究方法。本文綜述了LCM技術(shù)的原理、技術(shù)流程及其在皮膚病學(xué)研究中應(yīng)用。

1 激光捕獲顯微切割技術(shù)簡介

激光捕獲顯微切割技術(shù)是一種在顯微可視化下從組織標(biāo)本中分離純細(xì)胞群體的先進(jìn)技術(shù)。它可以精確地找到并捕獲感興趣的細(xì)胞，以進(jìn)行廣泛的下游分析。1986年初，Monajembashi提出用激光微束對人類染色體進(jìn)行顯微切割，首次描述了激光微束顯微切割技術(shù)的概念。1996年，Emmert-Buck詳細(xì)描述了LCM技術(shù)的概念及操作。與此同時，Palm MicroBeam和Leica LMD6000激光捕獲顯微切割系統(tǒng)也迅速發(fā)展起來。由于這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，使得疾病病理過程的分子分析方法有了顯著的突破[1，2]。

2 激光捕獲顯微切割技術(shù)的原理及技術(shù)流程

LCM有兩大類：紅外激光捕獲系統(tǒng)和紫外激光切割系統(tǒng)。紅外激光捕獲系統(tǒng)的工作原理是可視化下在目標(biāo)細(xì)胞上方的LCM帽上附著一層熱塑性轉(zhuǎn)移膜，低功率脈沖激光通過LCM帽的頂部，擊中熱塑性轉(zhuǎn)移膜，然后熱塑性轉(zhuǎn)移膜結(jié)合到目標(biāo)細(xì)胞或區(qū)域，吸收激光輻射，形成一種非破壞性的顯微切割，從而保持捕獲材料的完整性。而紫外激光切割系統(tǒng)則是將固定好的組織轉(zhuǎn)移到聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜玻片上，用紫外光激光切割目標(biāo)區(qū)域，使其掉落到放置在組織載玻片下面的管帽中。雖然這樣會損壞位于切割區(qū)域周邊的細(xì)胞，干擾最終的下游分析，但相比起紅外激光捕獲系統(tǒng)操作過程中附著在粘合劑薄膜上的目標(biāo)組織，紫外激光切割系統(tǒng)的直接切割對組織的污染更小。顯微切割完成后，將靶細(xì)胞放入含有適當(dāng)緩沖液的試管中，用于提取DNA、RNA或蛋白質(zhì)，并回收生物分子用于下游分析[2,3]。

3 激光捕獲顯微切割技術(shù)在皮膚病研究領(lǐng)域的應(yīng)用

LCM技術(shù)在病理學(xué)、傳染病學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，而在皮膚病學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用較少。

3.1 正常皮膚研究 LCM技術(shù)在正常皮膚基因組學(xué)的研究中起到了不可替代的作用。Gulati等[4]利用LCM技術(shù)分離了正常皮膚真皮網(wǎng)狀層、表皮基底層和基底層上(棘層、顆粒層和角質(zhì)層)三個區(qū)域，發(fā)現(xiàn)LCM捕獲到的表皮全層與基底層上表皮的基因表達(dá)截然不同，這表明LCM技術(shù)在捕獲基底層細(xì)胞時有很好的靶向性。研究通過結(jié)合LCM技術(shù)和二代測序(NGS)技術(shù)，從新鮮冷凍皮膚人體活檢中獲得可靠的RNA測序數(shù)據(jù)，形成cDNA文庫，為下游分析提供可靠的數(shù)據(jù)，也為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了擴(kuò)大樣本量的機(jī)會[5]。

2013年，研究則采用LCM技術(shù)分離正常人下肢和乳房部位皮膚組織基底膜、真皮乳頭層和網(wǎng)狀層區(qū)域，獲取細(xì)胞外基質(zhì)。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，真皮乳頭層和網(wǎng)狀層的亞蛋白質(zhì)組、腿部皮膚與乳房皮膚的蛋白質(zhì)組之間的差異不大。這項(xiàng)研究為LCM用于皮膚病學(xué)蛋白質(zhì)的相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的依據(jù)[6]。

3.2 皮膚老化研究 LCM技術(shù)在研究皮膚老化方面也有應(yīng)用，研究采用LCM技術(shù)和實(shí)時定量PCR相結(jié)合的方法，檢測了青年和老年人皮膚中肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HGF主要在人皮膚真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)，老年人皮膚中HGF表達(dá)升高伴隨著Hippo 抑癌基因信號通路相關(guān)基因表達(dá)降低,進(jìn)一步揭示了成纖維細(xì)胞表達(dá)的HGF在衰老皮膚中的作用機(jī)制[7]。

3.3 皮膚腫瘤研究 從染色的組織切片中利用LCM技術(shù)分離出僅包含數(shù)十個細(xì)胞的單個微腫瘤巢，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)急性黑素瘤基因組異質(zhì)性廣泛存在，且分支進(jìn)化發(fā)生在急性黑素瘤發(fā)展的早期。進(jìn)而可以在早期將黑色素瘤與良性痣?yún)^(qū)分開[8]。近期研究利用LCM技術(shù)分離黑素瘤組織與鄰近正常組織，分析發(fā)現(xiàn)由威羅非尼(Vemurafenib)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在黑色素瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)微小核糖核酸MiR-410-3P下調(diào)。它驅(qū)動腫瘤轉(zhuǎn)向侵襲性表型，并抵抗腫瘤細(xì)胞中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶編碼基因的抑制作用。這項(xiàng)研究提示了黑色素瘤耐藥性的一種新機(jī)制[9]。

3.4 銀屑病 在研究銀屑病時，用LCM技術(shù)和二代測序(NGS)技術(shù)研究了銀屑病患者表皮和真皮炎性浸潤物中miRNA的特異性表達(dá)譜。與銀屑病患者正常皮膚相比，銀屑病斑塊表皮中有24個miRNAs表達(dá)下調(diào)，真皮炎性浸潤物中有37個miRNAs表達(dá)下調(diào)[10]。此研究證明miRNAs可能與銀屑病的發(fā)病有關(guān)，LCM結(jié)合NGS技術(shù)是一種探索銀屑病皮膚表皮和真皮中miRNA的整體表達(dá)的有效方法。采用LCM技術(shù)分別對尋常銀屑病患者皮損與非皮損區(qū)的真皮和表皮進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)表皮中circRNA表達(dá)較非皮損區(qū)顯著下調(diào)[11]。

3.5 白癜風(fēng) Goldstein等[12-14]先使用NKI-beteb抗體標(biāo)記人皮膚組織分化的和前體的黑素細(xì)胞，后經(jīng)LCM技術(shù)，捕獲原位黑素細(xì)胞提取RNA。LCM技術(shù)可以直接從黑素細(xì)胞和相鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞群體中分離出高質(zhì)量RNA進(jìn)一步擴(kuò)增，并通過實(shí)時定量PCR進(jìn)行分析。與角質(zhì)形成細(xì)胞相比，經(jīng)窄譜紫外線處理的黑素細(xì)胞樣本中黑素細(xì)胞特異性基因酪氨酸酶蛋白基因等顯著上調(diào)，角質(zhì)形成細(xì)胞特異性基因角蛋白5和角蛋白14的表達(dá)顯著高于黑素細(xì)胞樣本。此外，研究還發(fā)現(xiàn)毛囊隆突的黑素細(xì)胞與表皮黑素細(xì)胞相比，毛囊隆突的黑素細(xì)胞特異性基因的表達(dá)顯著降低，而三個黑素細(xì)胞干細(xì)胞基因：Y染色體性別轉(zhuǎn)錄基因盒轉(zhuǎn)錄因子9，WNT抑制因子1和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1的表達(dá)顯著增強(qiáng)。將LCM技術(shù)提取的毛囊隆突黑素細(xì)胞前體進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行測序后，發(fā)現(xiàn)與正常皮膚相比經(jīng)窄譜紫外線治療的白癜風(fēng)皮膚毛囊隆起黑素細(xì)胞中特異性基因的表達(dá)顯著增加。而這些信號是白癜風(fēng)重新著色過程中毛囊隆突的黑素細(xì)胞前體激活的潛在因素。

3.6 其他皮膚疾病 在皮膚其他疾病方面，2015年研究采用LCM技術(shù)分離特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)、非皮損區(qū)皮膚和健康志愿者正常皮膚的表皮和真皮，并進(jìn)行基因表達(dá)和免疫染色研究。研究發(fā)現(xiàn)了新的免疫和屏障基因，并發(fā)現(xiàn)了在陣列研究上通常無法檢測到的特應(yīng)性皮炎關(guān)鍵基因，如白介素22、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素、巨噬細(xì)胞來源趨化因子和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子3表達(dá)的增加[15]。

在面部播散性粟粒性狼瘡患者皮膚肉芽腫性病變病因?qū)W研究方面，研究發(fā)現(xiàn)使用LCM技術(shù)從患者皮膚肉芽腫性病變中提取目的細(xì)胞及其DNA。發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌在面部播散性粟粒性狼瘡患者的肉芽腫性病變中起致病作用。為面部播散性粟粒性狼瘡患者的肉芽腫性病變病因?qū)W研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[16]。

2017年，Jumper等[17]首次通過結(jié)合LCM技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩(keloid disease，KD)中可能存在癌樣干細(xì)胞群體，這種細(xì)胞群在KD中的存在似乎與炎性浸潤有關(guān)，為這種疾病所特有的持續(xù)生長，復(fù)發(fā)和多藥耐藥性提供了合理的解釋。LCM技術(shù)提取細(xì)胞和基因譜分析相結(jié)合的方法為不同KD區(qū)域的基因特征提供了更好的定義，從而更好地鑒別KD與其他皮膚纖維疾病。

4 研究前景展望

構(gòu)成皮膚的細(xì)胞多種多樣，分離特定的細(xì)胞類型對于皮膚病學(xué)研究是一種至關(guān)重要的研究方法。經(jīng)典的方法是用酶將真表皮進(jìn)行分離。但是這種方法不能區(qū)分型別不同的細(xì)胞。此外，早期發(fā)育階段的表皮極薄，不易剝離。皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)為分析提供了一種有效的替代方法，但由于生長條件的改變和缺乏正常的上皮-間充質(zhì)相互作用，結(jié)果導(dǎo)致培養(yǎng)的細(xì)胞與真實(shí)的體內(nèi)細(xì)胞基因表達(dá)不同。近年來，基于各種表面標(biāo)記的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)已成為分離不同群體皮膚細(xì)胞的研究方法。但熒光標(biāo)記有很大的局限性。還有用流式細(xì)胞儀分離所需的細(xì)胞類型。這些方法通常涉及復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因小鼠品系的培育、給藥，以實(shí)現(xiàn)時空方式精確控制GFP的表達(dá)，操作較為繁瑣[18]。

激光捕獲顯微切割(LCM)可直接從組織切片收集所需的目的細(xì)胞，來比較不同類型皮膚細(xì)胞各個時期的基因表達(dá)，且不需要依賴已知的細(xì)胞表面標(biāo)記或進(jìn)行復(fù)雜而昂貴的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。LCM技術(shù)允許在活檢組織切片中分離細(xì)胞，這為皮膚病學(xué)研究提供了一種更為便利的分離不同類型細(xì)胞的研究方案。

然而，LCM技術(shù)還存在一些如提取細(xì)胞的樣本量小、存在一定程度RNA降解、鄰近細(xì)胞的核糖核酸物質(zhì)的污染、對于蛋白質(zhì)的捕獲精度不高等缺陷，相信隨著技術(shù)的發(fā)展，LCM技術(shù)將會更加完善，應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)一步拓寬。