男男性行為者CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4基因多態(tài)性與HIV-1感染關(guān)聯(lián)性分析

蔣紅偉 田洪青

1臨沂市疾病預(yù)防控制中心,山東臨沂,276001；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院)，山東省皮膚病性病防治研究所,山東濟(jì)南,250022

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的慢性傳染病，近年來，男男性行為者(men who have sex with men, MSM)多性伴、無保護(hù)性行為較為普遍，已成為HIV傳播的重點(diǎn)人群[1-4]，進(jìn)一步從源頭上探索對(duì)該人群有效的防控措施至關(guān)重要，大量研究表明趨化因子及其受體作為HIV感染的重要輔助受體，參與HIV感染宿主細(xì)胞甚至?xí)绊懓滩〉募膊∵M(jìn)程[5-8]。關(guān)于MSM人群趨化因子及其受體多態(tài)性與HIV感染相關(guān)文獻(xiàn)較少，工作中發(fā)現(xiàn)不是所有暴露于HIV的人都會(huì)被感染，少數(shù)有暴露史的MSM多性伴無保護(hù)性行為一直未被感染，這種抵抗現(xiàn)象與宿主基因多態(tài)性的關(guān)系有待進(jìn)一步明確，本調(diào)查通過檢測山東漢族MSM人群CCR5、CCR2、CXCR4、SDF1基因多態(tài)性變化，分析病例組和對(duì)照組基因型差異與HIV-1感染的關(guān)系，以更好地為本地區(qū)艾滋病防控工作提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 193例調(diào)查對(duì)象全部為山東漢族MSM，均有過MSM不安全性行為，依據(jù)是否感染HIV病毒分成病例組和對(duì)照組，病例組收集102例經(jīng)HIV-1抗體確證檢測陽性的患者，對(duì)照組納入91例HIV抗體篩查檢測呈陰性者。所有樣本來源于臨沂市各縣、區(qū)疾控中心、抗病毒治療定點(diǎn)醫(yī)院和艾滋病自愿咨詢檢測門診收集，經(jīng)過個(gè)案流行病學(xué)調(diào)查、填寫問卷并采集血液標(biāo)本，由臨沂市疾病預(yù)防控制中心按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范(2015年修訂版)》[9]的要求進(jìn)行的樣品檢測，陽性患者均經(jīng)臨沂市艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室蛋白印跡法(western blot，WB)確認(rèn)的HIV-1抗體陽性病例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 在知情同意的前提下填寫調(diào)查問卷，采集外周靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血DNA提取 基因組DNA提取使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行，所提取DNA產(chǎn)物經(jīng)濃度和純度測定合格后置-20℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng) 基因擴(kuò)增儀 ETC811由東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)由上海天能科技有限公司生產(chǎn)；ABI3730XL型DNA 測序儀為Applied Biosystems；試劑為BGI 2×Super PCR Mix(with dye)BGI。

引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中人類CCR5基因rs333和rs1799987位點(diǎn)、CCR2、SDF1、CXCR4外顯子序列設(shè)計(jì)合成引物，引物序列和大小見表1。擴(kuò)增條件為96℃預(yù)變性5 min，96℃變性20 s，52-62touchdown退火30 s，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min保存。

表1 CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4擴(kuò)增位點(diǎn)上下游引物

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化和測序 全程委托華大基因公司對(duì)樣品進(jìn)行基因重測序。產(chǎn)物純化按照Millipore公司96純化板操作流程進(jìn)行。測序反應(yīng)體系為2 μLMix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、 H2O)，2 μL純化后的PCR產(chǎn)物，1 μL引物(5 mmol/L)。測序反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán)條件為：95℃15s→(95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s)×3 5cycles→終止反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，群體代表性采用哈-溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢驗(yàn)，若P>0.05,則認(rèn)為各基因型的分布符合HWE平衡。等位基因頻率(allelic frequency, AF)分布差異應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，多因素分析采用二分類Logistic回歸模型，分析比值比和95%置信區(qū)間(CI)，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)和行為學(xué)特征 193例均為男性，年齡中位數(shù)為31歲(17～62歲)；其中未婚98例(50.7%)，已婚68例(35.2%)，離異或喪偶27例(13.9%)；小學(xué)文化程度8例(4.1%)，初中81例(41.9%)，高中或中專47例(24.3%)，大專及以上57例(29.5%)； 商業(yè)服務(wù)40例(20.7%)，農(nóng)民60例(31%)，學(xué)生12例(6.2%)，自由職業(yè)者63例(32.6%)，干部工人18例(9.3%)；與性伴發(fā)生性行為時(shí)使用安全套頻率：從未使用56例(29%)，有時(shí)使用117例(60.6%)，每次都用20例(10.3%)；性伴數(shù)>3個(gè)94例(48.7%)，性伴數(shù)≤3個(gè)99例(51.2%)；無保護(hù)性行為次數(shù)>3次116例(60.1%)，無保護(hù)性行為次數(shù)≤3次77例(39.8%)。

2.2 哈-溫平衡檢驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)HWE平衡檢驗(yàn)，除CCR2基因rs777084052、rs369723235、rs993589500、SDF1和CXCR4基因rs1299134173及第一外顯子位點(diǎn)外，病例組和對(duì)照組CCR5、CCR2和CXCR4基因rs1799987、rs1799864、rs1799865、rs2228014位點(diǎn)基因型及其相對(duì)應(yīng)的預(yù)測值如下，所研究群體符合HWE平衡(P>0.05)(表2)，調(diào)查對(duì)象具有群體代表性和可比性。

2.3 CCR5測序結(jié)果 193例樣本未發(fā)現(xiàn)rs333位點(diǎn)存在插入缺失突變，參考序列為GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACA；rs1799987A/G位點(diǎn)檢出三種基因型(表2)，分別為AA占18.1%(35例)、AG占44.6%(86例)和GG占37.3%(72例)，A/G突變頻率為59.6%，對(duì)照組、病例組等位基因A、G發(fā)生頻率分別為43.41%、56.59%和37.75%、62.25%，兩組不同年齡、職業(yè)和安全套使用頻率進(jìn)行比較，基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，將基因型AA與其他(AG、GG)兩類基因型作為因變量(突變=0,未突變=1)，將病例組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的變量作為自變量，進(jìn)行非條件二分類 Logistic 回歸分析，顯示rs1799987A/G位點(diǎn)變異可能為影響HIV-1感染的風(fēng)險(xiǎn)因素[比值比(OR)=2.998，95%可信區(qū)間(CI)：1.034～8.696]，結(jié)果見表3。

表2 CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4多態(tài)性位點(diǎn)測序分析

表3 rs1799987位點(diǎn)基因型分布二分類Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 CCR2測序結(jié)果 共擴(kuò)增兩個(gè)外顯子，發(fā)現(xiàn)5個(gè)已知多態(tài)性位點(diǎn)(rs1799864、rs1799865、rs777084052、rs369723235、rs993589500)。第2外顯子T>C突變82例，其中病例組47例，對(duì)照組35例；病例組發(fā)現(xiàn)C>T突變1例；G>A突變71例，其中病例組38例，對(duì)照組33例；發(fā)現(xiàn)CC純合子17例，其中病例組10例，對(duì)照組7例；AA純合子8例，病例組2例，對(duì)照組6例。第3外顯子發(fā)現(xiàn)復(fù)等位基因9組，SNP位點(diǎn)堿基均為雜合突變，發(fā)現(xiàn)A>T突變23例，病例組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2；將基因型AA與其他(AG、GG)兩類基因型作為因變量(突變=0,未突變=1)，將年齡、職業(yè)、婚姻狀況、文化程度、安全套使用頻率、性伴數(shù)等納入多因素Logistic回歸模型分析，均顯示無明顯相關(guān)。

2.5 SDF1測序結(jié)果 193例樣本SDF1共擴(kuò)增4個(gè)外顯子，發(fā)現(xiàn)2個(gè)已知多態(tài)性位點(diǎn)(rs1444139047、rs17880170)，第1外顯子對(duì)照組發(fā)現(xiàn)T>C突變1例；第2外顯子病例組發(fā)現(xiàn)G>A突變1例；第3外顯子未發(fā)現(xiàn)插入缺失突變；第4外顯子對(duì)照組發(fā)現(xiàn)C>A、G>A突變各1例、病例組發(fā)現(xiàn)G>T突變1例，見表2。

2.6 CXCR4測序結(jié)果 擴(kuò)增1個(gè)外顯子，發(fā)現(xiàn)2個(gè)已知多態(tài)性位點(diǎn)(rs2228014、rs1299134173)，C>T突變對(duì)照組發(fā)現(xiàn)21例，病例組發(fā)現(xiàn)22例；病例組和對(duì)照組各發(fā)現(xiàn)1例TT純合突變；病例組1例雜合缺失TG插入AT，見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)HIV侵入機(jī)體，除CD4分子介導(dǎo)外，必須有趨化因子受體作為輔助受體參與，HIV-1才能有效感染人體，并在HIV感染及疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5-8,10]，CCR5作為HIV病毒傳播最重要的受體，發(fā)生CCR5△32雜合子或純合子突變的個(gè)體能有效抵御HIV的感染[11]，本組資料測序產(chǎn)物未發(fā)現(xiàn)CCR5△32純合或雜合子突變，結(jié)果不排除與所選樣本量少及入選人群突變率低有關(guān)。研究表明CCR5基因啟動(dòng)子59029A/G位點(diǎn)，歐美人群突變頻率為39%～43%，亞洲人群為55%～61%[12]，本研究MSM人群A/G突變頻率為59.59%，提示山東漢族MSM人群該位點(diǎn)等位基因突變頻率較高。既往研究顯示HIV血清陽性與陰性者GG基因型存在顯著差異，與感染HIV-1的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[6]，本組資料G等位基因頻率病例組(62.25%)高于對(duì)照組(56.59%)，多因素分析也發(fā)現(xiàn)A/G位點(diǎn)等位基因變異可能是HIV-1感染的風(fēng)險(xiǎn)因素，是否與感染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)尚待更多研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。國外研究報(bào)道59029A/G基因突變可減少CCR5的轉(zhuǎn)錄，從而減緩HIV的感染過程，相對(duì)于AA個(gè)體，GG基因型對(duì)感染具有保護(hù)作用[13]，本組資料A的基因頻率病例組低于對(duì)照組，現(xiàn)有數(shù)據(jù)不支持GG基因型對(duì)感染具有保護(hù)作用這一結(jié)論。

王福生等[14]研究發(fā)現(xiàn)中國人群CCR2-64I等位基因突變頻率為19.15%～28.79%,既往報(bào)道白種人該突變頻率9.8%，本研究發(fā)現(xiàn)MSM人群為19.95%，與報(bào)告的中國人群研究數(shù)據(jù)相近，并明顯高于歐美人群。研究表明CCR2最常見的多態(tài)性突變?yōu)镃CR2-64I，本組資料發(fā)現(xiàn)79例樣本存在CCR2-64I突變，為編碼區(qū)第190位核苷酸G→A突變導(dǎo)致第64位的纈氨酸替代為異亮氨酸。本研究也發(fā)現(xiàn)CCR2第3外顯子區(qū)域出現(xiàn)23例A>T突變，為cDNA水平上1109位置發(fā)生的雜合突變，第370位天冬氨酸替代為纈氨酸，病例組和對(duì)照組基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多因素logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)與年齡、職業(yè)等無明顯關(guān)聯(lián)，推測兩組之間差異可能系混雜因素影響所致。

SDF1是CXCR4的主要配體，文獻(xiàn)報(bào)道最常見的突變?yōu)镾DF1-3'A，該突變可延緩AIDS疾病進(jìn)展，另有研究發(fā)現(xiàn)SDF1-3'A等位基因純合子突變可以加速疾病進(jìn)展和死亡[15]，本研究未發(fā)現(xiàn)SDF1-3'A發(fā)生純合子突變，5例突變均為雜合子突變，其中兩例均為HIV感染者,CD4均在500個(gè)/μL以上，感染時(shí)間均在4年以上，暫未證實(shí)SDF1對(duì)HIV感染及感染較長時(shí)間疾病進(jìn)程等方面的保護(hù)作用。研究顯示SDF1-3'A等位基因頻率地域差異明顯，美國白人為21.1%，亞洲人為25.7%[16]，我國人群呈現(xiàn)由南到北頻率呈梯度下降趨勢，最高廣東33.3%，河南21.8%，濟(jì)南21%[17]，Winkler等[18]報(bào)道亞洲人SDF1的突變頻率為0.257%，本研究MSM人群SDF1突變頻率為0.26%，顯示該人群突變頻率與亞洲人群基本一致。

CXCR4是T細(xì)胞嗜性病毒HIV-1感染的主要輔助受體，與更具致病性和更快的艾滋病進(jìn)展相關(guān)，并且由于CD4+T細(xì)胞的進(jìn)行性和定量下降而導(dǎo)致更高的艾滋病相關(guān)死亡率[10]，本組資料發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)rs2228014密碼子138位置C>T雜合突變42例，氨基酸位置無變化，純合子突變病例組和對(duì)照組各1例，病例組和對(duì)照組比較多態(tài)性差異未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組發(fā)現(xiàn)cDNA序列上17-18位置SNP位點(diǎn)發(fā)生雜合突變，缺失TG插入AT1例，既往未見相關(guān)報(bào)道，與HIV感染是否有相關(guān)性尚需更多數(shù)據(jù)進(jìn)一步探討。

綜合現(xiàn)有資料，關(guān)于山東漢族MSM人群CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4基因多態(tài)性與HIV-1感染關(guān)聯(lián)性，可獲得的信息有限，結(jié)論不一，建議納入更多暴露未感染人群，開展不同人群不同地域艾滋病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等方面的HIV相關(guān)基因研究，為進(jìn)一步做好艾滋病防控工作提供更多的參考依據(jù)。