空卵泡綜合征的最新研究進(jìn)展

鄭明明 魏超峰 連方

空卵泡綜合征(empty follicle syndrome，EFS)是一種在體外受精(in vitro fertilization，IVF)過(guò)程中經(jīng)過(guò)控制性超促排卵但沒(méi)有成熟的卵母細(xì)胞被取出的現(xiàn)象。1986年由Coulam等[1]最早報(bào)道，在輔助生殖技術(shù)的促排卵周期中，卵泡大小和體內(nèi)激素水平均正常，但通過(guò)重復(fù)沖洗和操作仍不能從成熟的卵泡中獲取卵母細(xì)胞。2008年，Stevenson等[2]首次將這一現(xiàn)象具體分型，提出真性空卵泡綜合征(genuine empty follicle syndrome，GEFS)與假性空卵泡綜合征(false empty follicle syndrome，F(xiàn)EFS)的概念。GEFS比較復(fù)雜且預(yù)后不佳，是一個(gè)受多種因素影響的棘手問(wèn)題。FEFS通常被認(rèn)為是由于取卵日β-人體絨膜促性腺激素(β-HCG)較低(<40 mU/mL)導(dǎo)致不能取到卵母細(xì)胞，往往由外界因素如人為或藥物使用不當(dāng)所造成。因此，對(duì)于臨床工作者需要在IVF周期中盡量消除諸類因素從而避免FEFS的發(fā)生。本文就兩種不同性質(zhì)的空卵泡的病因、治療、預(yù)防及預(yù)后等方面進(jìn)展論述。

一、EFS病因

1. GEFS病因：目前對(duì)于EFS病因有很多研究，但確切的機(jī)制仍不清楚，研究發(fā)現(xiàn)GEFS的發(fā)生與以下因素有關(guān)。

(1)年齡。對(duì)于女性來(lái)說(shuō)，研究顯示[3]生育力與年齡成反比，流產(chǎn)率、畸形率和空卵泡發(fā)生率隨著年齡增大也會(huì)增加，尤其是年齡大于44歲的女性。據(jù)報(bào)道GEFS的復(fù)發(fā)率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[4]。Baum[5]回顧性研究了大量EFS患者，包括復(fù)發(fā)性患者，評(píng)估了該群體隨后的生育情況，發(fā)現(xiàn)GEFS的出現(xiàn)與年齡增長(zhǎng)有密切關(guān)系，同時(shí)也與某些激素水平的異常相關(guān)。

(2)卵巢老化。卵巢功能和卵泡儲(chǔ)備是一個(gè)女性生育功能的體現(xiàn)，其生育能力的下降與卵巢功能的變化密切相關(guān)，卵巢老化表現(xiàn)出卵泡不斷耗竭的狀態(tài)、卵泡池的卵泡數(shù)目下降等，這都是生殖能力下降的表現(xiàn)。卵巢作為重要的生殖器官受各種因素的影響[6]：遺傳學(xué)因素、免疫因素、醫(yī)源性因素和環(huán)境因素都可能對(duì)卵巢產(chǎn)生損害，在這些諸多不良因素作用下卵巢逐步老化。Zreik[4]認(rèn)為卵巢老化以及卵泡耗竭的卵泡發(fā)育異常可能是導(dǎo)致EFS出現(xiàn)的一個(gè)重要因素。

(3)卵巢儲(chǔ)備功能降低。卵巢儲(chǔ)備是評(píng)價(jià)生育力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，除了竇卵泡數(shù)目的減少，卵泡質(zhì)量的下降也是卵巢儲(chǔ)備功能降低的重要表現(xiàn)，這可能導(dǎo)致在IVF過(guò)程中即使對(duì)卵巢進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇碳ず笕圆荒軓某墒炻雅葜谐槲雎涯讣?xì)胞。Madani等[7]回顧性分析了58例EFS患者，其中48例診斷為GEFS，該研究發(fā)現(xiàn)這些患者血清抗繆勒激素(AMH)低，成熟卵泡少。Yakovi等[8]的前瞻性研究也得出同樣的結(jié)論，由此分析卵巢儲(chǔ)備低可能是EFS的一種發(fā)病原因。但也有研究[9]結(jié)論相反，該研究涉及的患者中只有4.25%有卵巢儲(chǔ)備功能(diminished ovarian reserve，DOR)下降，但31.9%的EFS病例有多囊卵巢綜合征和不明原因的不孕癥，且AMH水平為(4.47±3.54)ng/mL，竇卵泡計(jì)數(shù)(antral follicle count，AFC)為(15.30±8.07)，表明卵巢儲(chǔ)備減少不是EFS的主要因素。

(4)卵母細(xì)胞過(guò)早閉鎖。卵母細(xì)胞的發(fā)育需要顆粒細(xì)胞支持，Inan[10]利用Affymetrix基因芯片分析復(fù)發(fā)性EFS患者顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GC)的全基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)空卵泡患者的顆粒細(xì)胞基因表達(dá)出現(xiàn)明顯改變，差異表達(dá)基因水平的變化可能預(yù)示著其封閉卵母細(xì)胞的質(zhì)量，凋亡基因的異常增加以及與卵泡正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物的減少都有可能造成卵母細(xì)胞的缺失。由此認(rèn)為GEFS患者的卵母細(xì)胞在早期就發(fā)生了閉鎖。

(5)基因和遺傳因素。人卵子透明帶(zona pellucida，ZP)是包裹在卵母細(xì)胞周圍的一層半透明的由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四種糖蛋白構(gòu)成的膜狀結(jié)構(gòu)。由于ZP蛋白的密度、結(jié)構(gòu)和相互作用與卵泡質(zhì)量有關(guān)，所以卵母細(xì)胞質(zhì)量異?？梢酝ㄟ^(guò)ZP形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常來(lái)預(yù)測(cè)。Sun等[11]通過(guò)對(duì)來(lái)自同一家庭的兩位患EFS的姐妹使用HCG和/或GnRHa進(jìn)行三個(gè)周期的標(biāo)準(zhǔn)的卵巢刺激后，通過(guò)測(cè)試將全外顯子組測(cè)序和共分離，發(fā)現(xiàn)其均存在ZP1基因突變，進(jìn)一步分析證實(shí)ZP1、ZP2和ZP3蛋白會(huì)被突變的ZP1蛋白中斷其之間的相互作用，最終破壞卵母細(xì)胞透明帶的形成，由此提出ZP1基因的特定突變可能為EFS的病因。這種觀點(diǎn)在Yuan等的研究[12]中也得到證實(shí)，且發(fā)現(xiàn)了ZP1基因上新的突變點(diǎn)c.181C>T (p.Arg61Cys)。此外，Dai等[13]又發(fā)現(xiàn)了ZP1基因上的6個(gè)新的突變點(diǎn)，進(jìn)一步推測(cè)ZP1的缺失可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞變性或在濾泡穿刺過(guò)程中卵母細(xì)胞脆性增加，最終導(dǎo)致EFS。Chen等[14]對(duì)復(fù)發(fā)性EFS女性全基因組連鎖分析和全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在ZP3基因上存在 c.400 G>A (p.Ala134Thr) 突變，認(rèn)為ZP3突變使ZP的組裝受阻和卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的通訊受阻，導(dǎo)致卵母細(xì)胞變性。Zhou等[15]發(fā)現(xiàn)了新的突變點(diǎn)，包括 ZP1中的3個(gè)純合突變 (c.1708G>A,p.Val570Met；c.1228C>T，p.Arg410Trp；c.507del，p.His170Ilefs*52)，ZP1中的2個(gè)復(fù)合雜合突變(c.1430+1G>T，p.Cys478X 和c.1775-8T>C，p.Asp592Glyfs*29)，ZP2中的1個(gè)純合突變(c.1115G>C，p.Cys372Ser)，以及ZP3中的1個(gè)雜合突變 (c.763C>G，p.Arg255Gly)，并提出ZP1，ZP2和ZP3中的突變可能影響相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，分泌和相互作用，從而為EFS提供了新的機(jī)制解釋，并擴(kuò)展了ZP基因突變的范圍，進(jìn)一步闡釋了ZP基因突變的致病機(jī)制。由此認(rèn)為基因突變的異常對(duì)卵泡發(fā)育過(guò)程中物質(zhì)表達(dá)的影響會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。

Chen等[16]首次報(bào)道在同一家系中2例EFS的發(fā)生是由于促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因突變導(dǎo)致。最近國(guó)內(nèi)的研究[17]也進(jìn)一步證實(shí)LHCGR基因突變與EFS的關(guān)系。也有報(bào)道[18]研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)來(lái)自中國(guó)的非近親家庭的GEFS患者循環(huán)LH水平正常，盡管卵巢儲(chǔ)備和反應(yīng)令人滿意，但在兩次IVF循環(huán)后仍未取得卵母細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其和父母LHGR基因皆出現(xiàn)一個(gè)新的純合突變，對(duì)其信號(hào)研究發(fā)現(xiàn)該突變對(duì)LHCGR在不同濃度下對(duì)hCG或LH的反應(yīng)具有不同的影響，具體而言，在濃度<1 IU / mL時(shí)，該突變體被hCG刺激激活，但部分抵抗LH刺激。在較高濃度(>1 IU / mL)下，突變體被hCG和LH激活。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)LHCGR基因突變的篩查可能有助于GEFS患者的診斷。

同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素如染色體的異常也會(huì)影響女性的生育力。目前可知某遺傳物質(zhì)如核型異?？捎绊懪缘纳芰?，Onalan等[19]報(bào)道了2例原發(fā)性不育的耳聾姐妹，經(jīng)過(guò)3次IVF或卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的周期，盡管再次注射HCG，且測(cè)定其注射日的E2、P、LH無(wú)異常，但FES仍然復(fù)發(fā)。Vujisic等[20]報(bào)道一例有過(guò)自然流產(chǎn)史的32歲繼發(fā)性不孕女性，后雖多次行輔助生殖周期治療包括自然周期和促排卵周期仍不能成功獲得卵母細(xì)胞，行染色體核型檢查為2號(hào)染色體臂間倒位：46，XX，inv(2)，(p11q21)；男方染色體正常。由此認(rèn)為遺傳物質(zhì)缺失導(dǎo)致出現(xiàn)的遺傳體征可能會(huì)影響生殖細(xì)胞的正常發(fā)育功能，這為EFS的遺傳學(xué)基礎(chǔ)和不育個(gè)體的遺傳學(xué)診斷提供了新的證據(jù)。

2. FEFS病因：FEFS通常由于人為因素或藥物應(yīng)用不當(dāng)導(dǎo)致。積極探究其機(jī)理并尋找有效干預(yù)措施和解決方法以改變患者結(jié)局十分重要。研究發(fā)現(xiàn)FEFS發(fā)生與下列諸多因素有關(guān)。

(1)HCG生物活性異常。卵泡排出需要LH峰的出現(xiàn)，排卵前LH峰會(huì)使得卵母細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)學(xué)改變包括卵母細(xì)胞重新啟動(dòng)減數(shù)分裂以及顆粒細(xì)胞發(fā)生黃素化，隨后在卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)擴(kuò)張和黏液化基礎(chǔ)上卵泡壁破裂、卵子排出。HCG與LH結(jié)構(gòu)及生物活性相似,若使用的HCG的生物活性異常，也會(huì)造成卵泡成熟和排卵障礙而導(dǎo)致FEFS的發(fā)生。

(2)HCG的用量不當(dāng)。有學(xué)者[21]研究患者的三個(gè)IVF周期，在前兩次失敗后第三個(gè)周期通過(guò)雙重觸發(fā)超正常劑量的人絨毛膜促性腺激素(HCG)結(jié)合延遲的卵母細(xì)胞回收方法來(lái)誘導(dǎo)排卵，重組HCG和尿HCG，結(jié)局取卵10枚，受精2枚，成胚2枚。排卵需要卵冠丘復(fù)合體及顆粒細(xì)胞從卵泡壁上脫離，一定劑量的HCG在這個(gè)過(guò)程發(fā)揮重要作用。顆粒細(xì)胞上LH受體的適量表達(dá)支持著卵泡的發(fā)育，這使得LH完全取代FSH作用[22]。若卵泡發(fā)育不良，卵母細(xì)胞周圍的卵丘早期萎縮退化或出現(xiàn)自發(fā)性LH峰均可出現(xiàn)排卵障礙。目前LH峰的正常范圍不確定，使得排卵前注射HCG的最小有效劑量也尚不清楚，當(dāng)前臨床一般推薦最小劑量為5 000 IU。但在最新的病例報(bào)道[23]，1名38歲的女性扳機(jī)時(shí)不慎使用了2 000 IU的HCG，最終獲得14枚卵母細(xì)胞，其中12枚處于MII期，經(jīng)卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)后9枚受精，形成8個(gè)囊胚，PGS顯示有3枚為整倍體，移植1枚D6胚胎，目前為宮內(nèi)妊娠，此病例提示低劑量的HCG也有可能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，且受精和妊娠情況良好。

(3)HCG的使用時(shí)間不當(dāng)。臨床一般在注射HCG后34～36 h取卵，過(guò)早注射或過(guò)遲使用都可能造成顆粒細(xì)胞對(duì)HCG不能做出恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，使卵母細(xì)胞不能在合適的時(shí)間排出，導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)最合適的受精時(shí)機(jī)。雌激素對(duì)于排卵也有重要影響，當(dāng)雌激素達(dá)到一定水平后，LH峰沒(méi)有采取恰當(dāng)?shù)囊种拼胧?，則可能會(huì)發(fā)生卵子“逃逸”，使卵丘復(fù)合物從卵泡壁上脫落。不同患者可能對(duì)于HCG的作用時(shí)間不同，對(duì)于需要HCG作用時(shí)間較長(zhǎng)的仍按常規(guī)注射后34～36 h取卵，就可能導(dǎo)致FEFS的發(fā)生。Song等[24]在GnRH-拮抗劑方案中，使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑扳機(jī)后6 h實(shí)施了雙觸發(fā)給藥，結(jié)果獲得11個(gè)卵母細(xì)胞行IVF。18 h后，7個(gè)卵母細(xì)胞顯示正常受精，72 h后形成2個(gè)胚胎，說(shuō)明卵母細(xì)胞成熟和排卵是時(shí)間依賴性過(guò)程，需要根據(jù)不同患者情況來(lái)調(diào)整時(shí)間間隔。

(4)HCG代謝清除率速度。HCG體內(nèi)代謝清除速度在不同患者之間是有一定差異的，肥胖患者與正常人群有一定差異。不同給藥途徑的HCG代謝率也不同，當(dāng)發(fā)生FEFS時(shí)，還要將這些因素考慮進(jìn)去。

(5)促排卵方案。促排卵方案與FEFS之間的關(guān)系尚不明確。但 Singh等[9]基于醫(yī)院的研究中心進(jìn)行的一項(xiàng)回顧性研究中，對(duì)2010年1月至2016年8月的IVF周期進(jìn)行了研究。GnRH激動(dòng)劑、拮抗劑和微刺激方案用于IVF周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EFS的發(fā)生率為2.38%(47/1 968周期)，其中拮抗劑方案組(占76.59%，36/47)的EFS發(fā)生率(6.69%)最高。但關(guān)于促排卵方案可能會(huì)受到其他因素影響，目前不能確定其與空卵泡的關(guān)系。

(6)扳機(jī)藥物的影響。關(guān)于不同的扳機(jī)藥物與FEFS發(fā)生的相關(guān)性尚存在爭(zhēng)議。Castillo等[25]的大型回顧性研究分析表明，HCG觸發(fā)和GnRHa觸發(fā)相比，F(xiàn)EFS發(fā)生率無(wú)顯著性差異(3.5%vs3.1%)。

二、治療及預(yù)防

GEFS的病因研究尚未完全清楚，這給臨床的預(yù)防與治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)于卵巢原因及基因異常導(dǎo)致的會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)可能性且預(yù)后不良者，贈(zèng)卵可作為一種選擇。Deepika等[26]報(bào)道了1名診斷為GEFS的患者，連續(xù)2個(gè)周期均未獲得卵子，第3個(gè)周期中運(yùn)用了GnRH-a和HCG雙扳機(jī)以后，獲得了11枚卵，移植了2枚囊胚，最終成功妊娠及分娩。但該研究?jī)H1例患者，雙扳機(jī)能否改善GEFS的結(jié)局尚不明確。最近報(bào)告了一例復(fù)發(fā)性EFS患者，在兩個(gè)不同的體外受精周期中，使用兩種不同的方案均未獲得卵母細(xì)胞，且第二周期在第二次注射HCG補(bǔ)救后，經(jīng)過(guò)24 h后抽吸一側(cè)卵巢仍未獲得卵母細(xì)胞，提示改變治療方案或重復(fù)HCG給藥不太可能改變GEFS的結(jié)局[27]。對(duì)于人為因素或藥物作用導(dǎo)致的FEFS可從以下方面挽救：

1.再次注射hCG 24～36 h取卵：Revelli等[28]提出HCG的給藥時(shí)間是導(dǎo)致取卵周期失敗的重要因素。諸多研究關(guān)于取卵日血β-HCG的水平臨界值有不同報(bào)道，Stevenson等[2]提出血β-HCG<40 mIU/mL為是否再次注射HCG的判定指標(biāo)。Christopoulos等[29]報(bào)道6名患者在使用GnRHa觸發(fā)后發(fā)生EFS，5例患者經(jīng)注射HCG搶救后36 h再次穿刺獲得成熟卵母細(xì)胞。

2. 調(diào)整穿刺時(shí)間：臨床一般在注射HCG后36～40 h取卵，注射HCG與取卵的時(shí)間需要合適的間隔以助于卵母細(xì)胞在HCG下更充分暴露并對(duì)其做出恰當(dāng)反應(yīng)使卵母細(xì)胞成熟排卵。臨床研究中發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞重新啟動(dòng)減數(shù)分裂需要HCG峰值濃度持續(xù)14～18 h左右，成熟卵母細(xì)胞的獲得則而在HCG峰28 h之后。Sahebkashaf等[30]對(duì)108個(gè)患者的119個(gè)FEFS周期進(jìn)行分析，正常卵巢刺激取卵失敗后停止采卵，6 h后重新穿刺，取卵成功。有學(xué)者[31]提出適當(dāng)延長(zhǎng)HCG暴露時(shí)間對(duì)于PCOS患者可促使卵母細(xì)胞復(fù)合物與卵泡壁充分分離促進(jìn)卵子最終成熟，提高卵子質(zhì)量和臨床妊娠率。

3. 取卵技術(shù)的改善：取卵和撿卵速度要一致，這個(gè)對(duì)于臨床醫(yī)生的實(shí)踐技術(shù)操作和相互配合提出更高的要求。若穿刺數(shù)個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)現(xiàn)無(wú)卵子且顆粒細(xì)胞少時(shí)，應(yīng)停止操作重新取卵，積極尋找原因采取補(bǔ)救措施以爭(zhēng)取挽救周期。

4. 換用不同批次的HCG：由于HCG的生物活性降低造成的卵泡成熟或排出障礙而發(fā)生FEFS的可能與藥品在生產(chǎn)、包裝或儲(chǔ)存中存在偏差有關(guān)，因此出現(xiàn)諸類情況可考慮換用不同批次藥物以挽救周期。

三、結(jié)語(yǔ)

目前EFS在臨床中是一個(gè)棘手問(wèn)題，受諸多因素影響且復(fù)發(fā)可能性較大。無(wú)論從心理、情感、身體、還是經(jīng)濟(jì)方面對(duì)患者來(lái)說(shuō)都是創(chuàng)傷性的。因此，評(píng)估患有EFS的患者在未來(lái)治療中是很有意義的?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展為臨床診療提供了輔助手段以便動(dòng)態(tài)檢測(cè)相關(guān)激素水平和卵泡發(fā)育。基本資料的完善對(duì)于醫(yī)生和患者都尤為重要，通過(guò)對(duì)其資料的分析以及建立資料庫(kù)與各學(xué)科分工來(lái)幫助進(jìn)一步研究GEFS和FEFS，這對(duì)空卵泡綜合征的診治和發(fā)病機(jī)理探究有重大意義?？傊?，了解EFS病因，掌握EFS的預(yù)防措施和有效補(bǔ)救措施是十分必要的，這有利于減輕患者的心理壓力和減少經(jīng)濟(jì)損失、促進(jìn)醫(yī)學(xué)進(jìn)步。由于受影響因素較多使得EFS的研究 仍然困難重重，阻力較大，還要走相當(dāng)長(zhǎng)的探索之路。