肝衰竭合并侵襲性真菌病的診斷策略*

李 麗 李秀惠 陳 煜

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心 (北京， 100069) 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難重癥肝病及人工肝中心

肝衰竭是由多種原因引起的嚴(yán)重肝功能損傷，病死率高。肝衰竭患者在病程中常常出現(xiàn)免疫功能抑制[1]，且應(yīng)用抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素也很常見，侵襲性真菌病(IFD)的發(fā)生機會顯著增加。由于真菌感染臨床癥狀不典型，且常與細(xì)菌感染并存，診斷困難，治療周期長、難度大，病死率更高。早期診斷、及時治療成為改善肝衰竭合并IFD預(yù)后的關(guān)鍵。筆者梳理了肝衰竭合并IFD的診斷策略，為臨床醫(yī)生提供參考。

1 肝衰竭合并IFD的流行情況

IFD是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷的感染性疾病[2]，文獻報道肝衰竭合并IFD的發(fā)生率為2%～15%[3]，病原學(xué)以白色念珠菌和曲霉菌為主[4]，感染部位以肺部和口腔為主[5]。最近國內(nèi)有報道分析了2008至2017年某醫(yī)院3 233例符合肝衰竭診斷的患者，其中合并真菌感染患者372例(11.5%)，病原學(xué)主要菌屬為念珠菌(占55.92%，其中白色念珠菌占35.92%)和曲霉菌(占42.85%，其中煙曲霉菌占34.69%)，隱球菌和毛孢子菌僅分別占0.82%和0.41%。呼吸道感染占60.05%，口腔感染占29.91%，其次依次為泌尿道(4.34%)、腹腔(2.97%)、消化道(1.14%)、胸腔(0.68%)、血液(0.68%)、膽道(0.23%)[6]，國內(nèi)其他報道的感染部位分布結(jié)果類似。肝衰竭合并IFD的28 d病死率達56%，90 d病死率可達71%，預(yù)后極差[7]。

2 肝衰竭合并IFD的危險因素

對于重癥患者，目前公認(rèn)的IFD危險因素包括宿主和治療方面[8, 9]。宿主方面的危險因素包括：①年齡>65歲；②合并重要臟器功能不全，如肝硬化、腎功能不全、腸功能減退、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病等；③存在念珠菌定植。治療方面的危險因素包括：①侵入性操作：機械通氣、動靜脈置管、留置尿管及其他引流管、血液凈化治療等；②藥物治療：長期使用3種以上廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素治療等。

需要指出的是，在歐美國家的指南中，上述危險因素不被認(rèn)為是診斷IFD的依據(jù)[9]。作為臨床診斷條件的宿主因素主要包括存在免疫缺陷或免疫抑制的以下情況：①中性粒細(xì)胞減少<0.5×109/L 持續(xù)超過10 d；②過去60 d內(nèi)采用糖皮質(zhì)激素治療(≥0.3 mg/kg)3周以上；③過去90 d內(nèi)接受T細(xì)胞免疫抑制治療；④接受B細(xì)胞免疫抑制治療；⑤血液??；⑥干細(xì)胞或?qū)嶓w器官移植受體；⑦先天性嚴(yán)重免疫缺陷；⑧移植物抗宿主反應(yīng)(Ⅲ或Ⅳ級累及消化道、肺、肝且一線糖皮質(zhì)激素治療無效)。

包括肝衰竭在內(nèi)的重癥或終末期肝病普遍被認(rèn)為存在免疫缺陷[10]，但尚不能作為診斷IFD的宿主因素。越來越多證據(jù)表明，肝衰竭自身特點是發(fā)生IFD的獨立危險因素，包括腹水白蛋白水平<1 g/dl、高MELD評分、高CTP評分、合并腎功能損傷、ICU治療、血管或腹腔內(nèi)置管等[10]。以上情況需要警惕患者發(fā)生IFD的可能性，并及時尋找證據(jù)，早識別、早診斷、早治療。

3 肝衰竭患者的早期識別

當(dāng)肝衰竭患者臨床出現(xiàn)以下情況時應(yīng)考慮IFD發(fā)生的可能性[10]：①使用廣譜抗菌素治療后體溫得到控制而后復(fù)升，或使用廣譜抗菌素治療48～72 h無效；②口腔黏膜真菌感染伴全身感染癥狀；③外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例升高，廣譜抗菌素治療無效；④肝硬化患者病情遷延或加重；⑤肺實變及肺浸潤性改變、抗菌素治療無效。需進一步尋找真菌感染證據(jù)。

4 肝衰竭合并IFD的診斷方法

考慮到IFD感染的可能性，可進行以下檢測方法尋找病原。

4.1 實驗室檢查

4.1.1 真菌抗原檢測 真菌抗原檢測是真菌感染無創(chuàng)、早期診斷的重要血清學(xué)篩選指標(biāo)，主要包括1,3-β-D葡聚糖(BDG)、半乳甘露聚糖(GM)。①BDG試驗(G試驗)。BDG廣泛存在于各類真菌(毛霉菌和隱球菌除外)細(xì)胞壁，占胞壁成分50%以上。當(dāng)真菌進入人體，經(jīng)吞噬細(xì)胞吞噬、消化后，釋放BDG，血液或其他體液中即可檢測到BDG[11]。G試驗對除隱球菌和毛霉菌以外的所有深部真菌感染的早期診斷非常有幫助，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。G試驗檢測陽性最早可于臨床癥狀出現(xiàn)前4 d，或發(fā)熱前5 d被檢測到，是早期檢測的重要手段[12-15]。目前文獻報道中常用的BDG檢測試劑盒包括Fungitell、Glucatell 試劑盒(主要用于歐美國家)，F(xiàn)ungitec-G 、Wako 試劑盒(主要用于日本)，Dynamiker Fungus試劑盒(主要用于中國)。最近一項系統(tǒng)綜述對不同試劑盒檢測免疫缺陷或危重患者真菌感染的準(zhǔn)確性進行了分析，根據(jù)推薦的截斷值(cut-off)水平，真菌檢測的敏感性為 27%～100%，特異性0% ～100%。各研究之間產(chǎn)生異質(zhì)性的原因包括試驗設(shè)計、目標(biāo)人群、真菌類型、抽樣誤差、檢測截斷值等因素，未來需要更多研究改善異質(zhì)性，提供可靠的敏感性和特異性結(jié)果[16]。②GM試驗。GM分布于大多數(shù)曲霉及青霉屬真菌胞壁中，是曲霉菌檢測的特異性分子標(biāo)志物。GM試驗方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，是IFD尤其是侵襲性曲霉菌病(IA)的篩選試驗，適用于具有IFD高危因素的成人或兒童患者。IA患者血清GM陽性早于臨床表現(xiàn)和影像學(xué)改變，連續(xù)GM試驗動態(tài)監(jiān)測具有早期診斷價值。肺泡灌洗液的GM試驗比血的GM試驗數(shù)值對診斷曲霉菌感染具有更高的特異性和敏感性[17, 18]。GM>0.5時敏感性可達100%，特異性超過75%[19, 20]。

4.1.2 熒光定量PCR檢測真菌DNA 熒光定量PCR檢測血液中的真菌已經(jīng)有大量報道[21, 22]，實時熒光PCR檢測血清樣本曲霉DNA可協(xié)助診斷肝衰竭合并IA。新鮮組織標(biāo)本可用于毛霉核糖體DNA(rDNA)小亞基半巢式 PCR 檢測，呼吸系統(tǒng)活檢標(biāo)本PCR 結(jié)果的敏感性優(yōu)于組織病理檢查和真菌培養(yǎng)[23]。由于實驗室檢查PCR的技術(shù)尚未標(biāo)準(zhǔn)化，商業(yè)檢測試劑盒還未得到廣泛應(yīng)用，目前PCR檢測沒有被納入EORT/MSG的推薦意見。

4.1.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)檢測真菌胞內(nèi)核糖體蛋白 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，簡稱飛行質(zhì)譜技術(shù)，是臨床微生物鑒定領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。其機制在于每種微生物自身具有獨特的肽/蛋白質(zhì)，MALDI-TOF MS用來檢測微生物胞內(nèi)核糖體蛋白，經(jīng)系統(tǒng)處理后得到與蛋白成分對應(yīng)的質(zhì)譜峰圖，然后與數(shù)據(jù)庫內(nèi)菌株的參考質(zhì)譜峰圖進行比對，根據(jù)譜圖相似程度對微生物進行菌種鑒定。MALDI-TOF MS已應(yīng)用于細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌菌種的鑒定，可在幾分鐘之內(nèi)完成對微生物種、屬水平的鑒定[24-26]。MALDI-TOF MS具有快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本的優(yōu)勢[27, 28]。由于真菌本身的復(fù)雜性以及現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫內(nèi)真菌菌種涵蓋范圍有限，其鑒定能力還有待提高。

4.1.4 體液直接鏡檢、涂片和真菌培養(yǎng) 各種體液可進行直接鏡檢、涂片或培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)真菌。體液標(biāo)本包括血液、正常無菌部位的穿刺液、呼吸道分泌物、尿液、各種引流液(胸腹水、腦室引流液)。對于血液、無菌腔液或組織液進行涂片并染色，可快速發(fā)現(xiàn)真菌[29, 30]。毛霉素鏡下特征表現(xiàn)為寬度不一、無隔或少隔的絲帶狀菌絲體。雙相真菌(如馬爾尼菲藍狀菌)鏡下可見“臘腸樣”菌體，不著色橫隔是馬爾尼菲藍狀菌的典型特征。懷疑隱球菌腦膜炎者，應(yīng)進行腦脊液的印度墨汁染色，鏡下未染色的莢膜是隱球菌的特征。卡氏肺孢子菌不能通過體外培養(yǎng)獲得，主要依靠肺泡灌洗液直接涂片進行六胺銀染色診斷。體液真菌培養(yǎng)陽性者，需進一步進行真菌屬、種的鑒定。

4.2 組織病理學(xué)檢查 感染部位病理組織找到真菌病原體是診斷IFD的金標(biāo)準(zhǔn)。通過切片、染色觀察真菌的形態(tài)和組織反應(yīng)。常用染色方法包括革蘭染色、HE染色、姬姆薩染色、PAS染色、嗜銀染色(GMS)、黏蛋白卡紅(MCS)染色、Gridly真菌染色(GF)等[31]。根據(jù)組織中發(fā)現(xiàn)的病原體及局部組織反應(yīng)判別是致病菌或定植菌，組織反應(yīng)的基本病理改變包括急慢性化膿性炎癥、非化膿性炎癥、肉芽腫形成、干酪樣壞死、血管炎等。凝固性壞死較多見于曲霉菌和念珠菌感染，毛霉菌和新生隱球菌肺炎常出現(xiàn)楔形梗死灶[32]。臨床懷疑 IFD 時，盡量多次抽血、無菌腔液進行真菌培養(yǎng)，盡可能行組織病理檢查協(xié)助診斷。但重癥肝病患者常由于凝血時間延長難以獲得組織標(biāo)本，同時真菌培養(yǎng)時間長、陽性率低，早期確診仍是挑戰(zhàn)。

4.3 影像學(xué)檢查 影像學(xué)檢查是診斷IFD的重要手段，有助于判斷感染部位、感染類型、病灶數(shù)量、大小、局部浸潤，可在CT引導(dǎo)下行穿刺活檢。高分辨CT(HRCT)對于IA有重要意義。典型表現(xiàn)為伴或不伴暈征的結(jié)節(jié)病灶(>1 cm)或楔形壞死病灶，結(jié)節(jié)中出現(xiàn)新月征和空洞形成，是曲霉菌侵犯肺部的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。感染還可累及肺泡和細(xì)支氣管壁，表現(xiàn)為支氣管周圍實變影、支氣管擴張征、小葉中心型微小結(jié)節(jié)影、樹芽征和毛玻璃樣改變等表現(xiàn)，為曲霉菌氣道侵襲的特征性表現(xiàn)[32]。毛霉病患者影像學(xué)檢查可出現(xiàn)反暈輪征，有研究表明，19%的毛霉病患者出現(xiàn)反暈輪征，而僅<1% 的曲霉病患者出現(xiàn)類似的改變。

5 肝衰竭合并IFD的診斷

目前國內(nèi)外尚無關(guān)于肝衰竭合并IFD診斷標(biāo)準(zhǔn)的指南或共識，可參考2007年中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會制訂了《重癥患者侵襲性真菌病診斷與治療指南(2007)》[8]，以及國外《EORTC/MSG侵襲性真菌病指南》2019年更新版[9，33]。國內(nèi)外均將IFD的診斷分3個級別：確診、臨床診斷、擬診，診斷依據(jù)包括宿主因素、臨床特征、微生物學(xué)檢查、組織病理學(xué)4部分。上述國內(nèi)外指南對于宿主因素的界定有所不同，國外診斷標(biāo)準(zhǔn)對宿主因素做了嚴(yán)格限定，國內(nèi)指南則將危險因素、宿主因素合并成為危險(宿主)因素，而肝衰竭發(fā)生IFD的獨立危險因素是否應(yīng)當(dāng)列入指南仍有待于形成統(tǒng)一意見。

5.1 確診

5.1.1 霉菌感染 具有以下情況之一可確診為霉菌感染。①針吸或活檢獲得的組織病理、細(xì)胞病理或直接鏡檢，可見菌絲或產(chǎn)黑色素酵母樣真菌并伴有組織損傷證據(jù)；②正常無菌部位由臨床或影像學(xué)發(fā)現(xiàn)感染病灶，無菌操作下獲得標(biāo)本培養(yǎng)得到透明或黑色霉菌(不包括肺泡灌洗液、鼻旁竇、乳突竇、尿液)；③血培養(yǎng)得到真菌，如鐮孢菌等(曲霉菌多為污染菌)；④石蠟病理切片發(fā)現(xiàn)霉菌，行PCR真菌DNA擴增及DNA測序確定。

5.1.2 酵母菌感染 具有以下情況之一可確診為酵母菌感染。①正常無菌部位針吸或活檢取得的標(biāo)本進行組織病理、細(xì)胞病理或直接鏡檢可見酵母菌細(xì)胞，如帶有莢膜、出芽的隱球菌，有菌絲或假菌絲的念珠菌；②無菌部位由臨床或影像學(xué)發(fā)現(xiàn)感染病灶，無菌操作下獲得標(biāo)本(包括24 h內(nèi)引流液)，培養(yǎng)得到酵母菌；③血培養(yǎng)：酵母菌(如隱球菌或念珠菌)或酵母樣菌(毛孢子菌)培養(yǎng)陽性；④腦脊液或血清隱球菌抗原陽性；⑤石蠟病理切片發(fā)現(xiàn)酵母菌，行PCR真菌DNA擴增及DNA測序確定。

5.1.3 其他真菌感染 ①肺孢子菌：組織、肺泡灌洗液、痰液進行傳統(tǒng)或免疫熒光染色可見肺孢子菌；②地方性真菌?。焊腥静课粯?biāo)本的病理學(xué)或直接鏡檢可見特征性真菌；感染部位標(biāo)本培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)特異性真菌；血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)特異性真菌。

5.2 臨床診斷 做出臨床診斷需要綜合宿主因素、臨床特征、真菌微生物學(xué)檢測結(jié)果。要求至少具有1項宿主因素，具有可能感染部位的臨床特征(包括癥狀、體征、影像學(xué)表現(xiàn))，并同時具備至少1項以下真菌微生物學(xué)檢測結(jié)果陽性[8]。①血液、胸腹水等針吸無菌體液涂片發(fā)現(xiàn)隱球菌以外的真菌；②留置導(dǎo)尿、連續(xù)2份尿檢見念珠菌管型或尿培養(yǎng)呈酵母菌陽性；③直接導(dǎo)尿獲得的尿樣培養(yǎng)呈酵母菌陽性(尿念珠菌>103CFU/ml)；④更換尿管前后2份尿樣培養(yǎng)呈酵母菌陽性(尿念珠菌>103CFU/ml)；⑤氣道分泌物(包括經(jīng)口、氣管插管、支氣管肺泡灌洗、保護性標(biāo)本刷獲取的標(biāo)本)直接鏡檢/細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)菌絲/孢子或真菌培養(yǎng)陽性；⑥經(jīng)胸、腹、盆腔引流管等留取的引流液直接鏡檢/細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)菌絲/孢子或真菌培養(yǎng)陽性；⑦經(jīng)腦室引流管留取的標(biāo)本直接鏡檢/細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)菌絲/孢子或真菌培養(yǎng)陽性；⑧連續(xù)2次血液標(biāo)本GM試驗和/或G試驗檢測陽性。

5.3 擬診 具有1項宿主因素，具備1項上述真菌微生物檢測結(jié)果陽性或者僅具有可能感染部位的臨床特征。

6 中醫(yī)對肝衰竭合并IFD的認(rèn)識

目前真菌感染的中醫(yī)辨證報道較少，肝衰竭(重型肝炎)合并IFD辨證分型的報道則更少。中醫(yī)認(rèn)為肺部真菌感染當(dāng)屬“咳嗽”、“肺痿”、“肺脹”、“虛勞”、“風(fēng)溫”等病范疇[34]。關(guān)于其證型，可分為虛實兩證，虛證以陰虛、氣陰兩虛為常見，實證多表現(xiàn)為風(fēng)溫之邪侵襲肺體[35]。肺念珠菌病可分為痰濕郁肺、痰熱蘊肺、肺陰虧虛型等證型[36]；肺霉菌感染可分為溫邪犯肺型及陰虛火旺型[37]。

王靈臺教授團隊對1996至2003年住院治療的74例重型肝炎并發(fā)真菌感染患者的中醫(yī)證候進行了分析，發(fā)現(xiàn)痰熱證、熱毒證及濕熱證與重型肝炎并發(fā)真菌感染有密切關(guān)系，提示中醫(yī)的痰熱證、熱毒證及濕熱證的出現(xiàn)是重型肝炎并發(fā)真菌感染的危險因素[38]。

7 總結(jié)

肝衰竭作為特殊的重癥疾病類型，由于患者凝血機制差，獲取病理確診較為困難，血培養(yǎng)以及臨床診斷更為重要，詳細(xì)分析患者的危險因素、早期識別臨床特征、及時進行血液/體液微生物學(xué)檢測是早期診斷的重要策略。而肝衰竭宿主因素作為真菌感染的診斷依據(jù)國內(nèi)外尚未共識，有必要在未來加強臨床和基礎(chǔ)研究，為指南制定提供依據(jù)。