miRNA對肝細(xì)胞癌微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用*

曹 妮 孫建飛 魏海梁△ 李京濤 閆曙光 肖 剛

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 2018級碩士研究生班 (陜西 咸陽, 712046) 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟腫瘤,也是世界癌癥死亡的第3大原因,且發(fā)病率逐年增加，主要原因是臨床早期診斷困難,確診時(shí)多已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。miRNA作為一種在惡性腫瘤發(fā)生中起到非常重要作用的短鏈非編碼RNA,通過與其靶基因的特異性結(jié)合從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[1]。自miRNA被發(fā)現(xiàn)以后，在多種生物體中發(fā)現(xiàn)并調(diào)查了更多的miRNA,目前，miRNA被公認(rèn)為可以影響幾乎所有生物過程的關(guān)鍵中介，包括發(fā)育、免疫反應(yīng)、分化、增殖、凋亡、入侵和轉(zhuǎn)移。本文從miRNA對HCC的免疫微環(huán)境、炎癥微環(huán)境、血管生成微環(huán)境等的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜述。

1 miRNA對肝星狀細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)

肝癌微環(huán)境中存在著大量的肝星狀細(xì)胞(HSC)及肌成纖維細(xì)胞(MFC)，HSC是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源，HSC激活并轉(zhuǎn)化為MFC，各種致纖維化因素把HSC作為最終靶細(xì)胞。正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，HSC被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腍SC。激活的HSC一方面通過增生和分泌ECM參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高。多種細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)的肝損傷可以激活HSC，產(chǎn)生α-smooth平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和引起肝纖維化后導(dǎo)致肝硬化，繼而形成HCC。miRNA通過不同的機(jī)制參與HSC的活化過程調(diào)節(jié)，從而造成不同的影響。

1.1 miRNA對HSC的活化過程的抑制 Han等[2]發(fā)現(xiàn)miR-206是HSC活化和肝纖維化背景下組蛋白去乙?；?抗體(HDAC4)的另一個(gè)下游靶點(diǎn)，miR-206可能通過抑制肌鈣蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-A(MRTF-A)表達(dá)來抑制HSC的活化。Khanizadeh等[3]的研究結(jié)果表明，丙型肝炎病毒(HCV)中非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)蛋白不同于無蛋白酶功能的NS3蛋白，可以誘導(dǎo)人造血干細(xì)胞的成纖維狀態(tài)。miR-122可能直接調(diào)節(jié)纖維化，但其表達(dá)在纖維化狀態(tài)受到明顯抑制，在轉(zhuǎn)染NS3的完整和突變形式的HSCs后，對LX-2(人肝癌細(xì)胞的一種)細(xì)胞中miR-122的基因表達(dá)分析表明，與正常細(xì)胞或熒光蛋白對照質(zhì)粒相比，兩種NS3蛋白均可導(dǎo)致HSCs中miR-122表達(dá)下調(diào)，但NS3的感受態(tài)形式對miR-122的抑制作用更強(qiáng)。

1.2 miRNA對HSC的活化過程的促進(jìn) Si等[4]的研究首次顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是肝纖維化的調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)控靶向RNA結(jié)合蛋白(如Igf2 bp3)的miRNAs(如Let7)來驅(qū)動造血干細(xì)胞的成肌成纖維細(xì)胞分化，它調(diào)節(jié)數(shù)千個(gè)基因表達(dá)的協(xié)調(diào)變化，使HSC能夠避免靜止，促進(jìn)(并保持)增殖肌纖維蛋白。此外，miR-140-3p通過刺激蛋白同源(PTEN)基因的沉默促進(jìn)p-AKT和p-mTOR的水平改善了細(xì)胞增殖以及α-SMA和結(jié)蛋白的表達(dá)，減少了細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)纖維形成[5]。

2 miRNA對線粒體微環(huán)境的調(diào)節(jié)

線粒體是細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，在能量代謝和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起多種作用，包括通過呼吸和氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)，活性氧的產(chǎn)生，代謝穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行，產(chǎn)生能量的電子傳遞鏈或三羧酸循環(huán)都位于線粒體內(nèi)。miRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，miRNA通常通過蛋白復(fù)合物阻止其mRNA 靶點(diǎn)的翻譯，從而引起線粒體的一系列功能異常。

2.1 對呼吸鏈的影響 呼吸鏈又稱電子傳遞鏈(ETC)是一系列具有遞氫、遞電子作用的氫載體和電子載體蛋白，由還原型輔酶I、琥珀酸還原酶、細(xì)胞色素b-c1還原酶、細(xì)胞色素c氧化酶4種復(fù)合物組成。線粒體有內(nèi)、外兩層膜，位于膜間隙中的電子傳遞鏈由幾個(gè)蛋白復(fù)合物(包括細(xì)胞色素c氧化酶)組成，它們產(chǎn)生質(zhì)子梯度，通過ATP合酶驅(qū)動ATP合成。miRNA通過多種方式影響細(xì)胞核和線粒體基因的蛋白表達(dá)及ETC活性。①miR-338-5p能夠影響細(xì)胞色素c氧化酶IV和ATP合酶復(fù)合物亞基的表達(dá)；②在Hela細(xì)胞中進(jìn)行的基因敲除實(shí)驗(yàn)顯示，其蛋白水平降低了70%，miR-101-3p序列在人、大鼠和小鼠中均具有保守性，在小鼠肝臟的線粒體中也發(fā)現(xiàn)了成熟的miR-101-3p；③miR-127-5p調(diào)控ATP5B(ATP合成酶β5抗體)，可以使ATP5B蛋白的含量降低50%[6]。

2.2 對三羧酸循環(huán)的影響 糖酵解產(chǎn)生丙酮酸作為最終產(chǎn)物，它被丙酮酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,在線粒體基質(zhì)中，乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)。這導(dǎo)致了氧化還原當(dāng)量的產(chǎn)生，它們進(jìn)入ETC并驅(qū)動電化學(xué)質(zhì)子梯度。檸檬酸合酶將乙酰輔酶A與草酸融合，催化三羧酸循環(huán)的起始步驟。anti-mir-122-5p處理小鼠可使脂肪酸生物合成降低40%，同時(shí)使β氧化增加2倍，通過平衡醛縮酶A的表達(dá)，mir-122-5p還參與控制糖酵解的破壞。而miR- 210-5p可以在TCA的多個(gè)點(diǎn)發(fā)揮負(fù)作用，對TCA循環(huán)代謝產(chǎn)生重要影響[6]。

2.3 對線粒體膜電位的影響 在電子傳遞過程中, 伴隨著質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜的里層向外層轉(zhuǎn)移, 形成跨膜的氫離子梯度,這種勢能驅(qū)動了氧化磷酸化反應(yīng), 合成ATP。Lin等[7]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-548b-3p的表達(dá)低于正常組織。miR-548b-3p模擬物和抑制劑分別轉(zhuǎn)染Huh7和SK-Hep-1(HCC細(xì)胞系中的一個(gè))細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-548b-3p模擬下調(diào)的線粒體膜電位，而miR-548b-3p抑制劑在SK-Hep-1細(xì)胞中顯示相反的作用。miR-548b-3p通過直接靶向蛋白磷酸酶2A癌性抑制劑(CIP2A)下游靶蛋白c-myc基因發(fā)揮抑癌作用。CIP2A的消耗部分降低了miR-548b-3p模擬物/抑制劑對c-myc的影響。miR-548b-3p在HCC中被下調(diào)，而miR-548b-3p抑制劑上調(diào)了線粒體膜電位(MMP)。

2.4 對線粒體分裂/融合的影響 線粒體是動態(tài)的細(xì)胞器，其分裂和融合的平衡影響線粒體的形態(tài)，也幫助線粒體改變胞質(zhì)定位，比如在需要大量ATP的組織積累，或Ca2+信號需要調(diào)節(jié)的地方積累。Mitofusin-2錨定在線粒體外膜上，參與線粒體分裂和融合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些miRNA可以影響線粒體動力學(xué)[8]。①miR-761被發(fā)現(xiàn)通過靶向線粒體裂變因子抑制線粒體裂變和凋亡，miR-761對于維持線粒體分裂和融合之間的平衡以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Mitofusin-2是miR-761的直接靶點(diǎn)，它的過表達(dá)可通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+流入線粒體而誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡。此外，miR-761抑制劑通過上調(diào)Mitofusin-2而損害線粒體功能，并在體內(nèi)和體外抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。②miR-30家族成員通過靶向線粒體裂變介質(zhì)Drp-1.25調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。③miR-140通過靶向Mitofusin-1促進(jìn)線粒體裂變和凋亡。

3 miRNA對血管微環(huán)境的調(diào)節(jié)

惡性腫瘤的生長、滲透和轉(zhuǎn)移需要血管生成，包括HCC[9]。作為一種重要的多功能血管生成因子，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過專門作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)表面的受體來發(fā)揮其作用，這不僅促進(jìn)血管ECs的線粒體增殖和分化，而且提高了毛細(xì)血管滲透性。目前諸多研究發(fā)現(xiàn)miRNA對腫瘤微血管有雙向調(diào)節(jié)作用。

3.1 miRNA對HCC血管生成的抑制作用 Ghosh等[10]發(fā)現(xiàn)在HCC組織中觀察到miR-199a-3p的表達(dá)明顯較低，并且其過表達(dá)顯著抑制了小鼠體內(nèi)的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。miR-199a-3p通過干擾HSCs和CACs之間的血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)、位于ECs上的VEGFR2分泌的促血管生成因子VEGFA，以及VEGFR2減弱的VEGF受體介導(dǎo)的下游信號血管生成素2之間的串?dāng)_和TME的基質(zhì)成分抑制HCC的轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成。此外，該miRNA對肝臟微環(huán)境中多個(gè)信號分子的沉默表明miR-199a-3p限制了HCC的轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成。在人類HCC組織中，miR-26b的表達(dá)明顯下調(diào)。miR-26b顯著抑制磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt和核因子-κB(NF-κB)/MMP-9/VEGF通路，繼而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡以及增加肝癌細(xì)胞系Bax和caspase-3/9蛋白表達(dá)的作用[11]。miR-144-3p在HCC中經(jīng)常被下調(diào)，可以通過PI3K獨(dú)立信號通路調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素激酶3激活來抑制增殖、遷移和抑制血管生成，并作為HCC患者的預(yù)后因子[12]。

3.2 miRNA對HCC血管生成的促進(jìn)作用 Tong等[13]證實(shí)miR-338-3p在HCC組織和HCC細(xì)胞系中均被抑制。細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)和絨膜尿囊膜檢測，表明miR-338-3p的下調(diào)可以急劇增加，而上調(diào)則可以顯著抑制HCC細(xì)胞的血管生成。在HCC患者中，高miR-210表達(dá)與不良預(yù)后，無腫瘤生存期和總生存期顯著相關(guān)。此外，HCC中miR-210的表達(dá)與微血管密度顯著正相關(guān)，體內(nèi)、外的研究均確定缺氧誘導(dǎo)的miR-210通過纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)信號介導(dǎo)靶向調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFRL1)表達(dá)和分泌促進(jìn)HCC血管生成[14]。miR-195通過負(fù)調(diào)控，F(xiàn)GF2和VEGFA促進(jìn)HCC的肺轉(zhuǎn)移[15]。miR-520f通過調(diào)節(jié)FGF16的表達(dá)促進(jìn)HCC侵襲性[16]。

4 miRNA對免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)

目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA對HCC的發(fā)生、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程中免疫系統(tǒng)的影響主要分為促進(jìn)免疫應(yīng)答與抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及逃避免疫監(jiān)測，促進(jìn)腫瘤發(fā)生與惡化兩方面。

4.1 參與免疫抑制的miRNA Ponsuksili等[17]研究豬肝miRNA表達(dá)的遺傳調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)let-7家族mRNA的表達(dá)與血糖水平呈負(fù)相關(guān)，與紅細(xì)胞呈正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。它還調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-13(IL-13)表達(dá)，并抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的免疫逃避。miR-146a的表達(dá)是由異常激活轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在肝癌細(xì)胞和施加負(fù)面影響抗腫瘤免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的,從而導(dǎo)致TGF-β、IL-17、VEGF等細(xì)胞因子上調(diào)，Ⅰ型γ-干擾素(IFN-γ)則下調(diào)，從而產(chǎn)生了免疫抑制性微環(huán)境[18]。miR-200c的過度表達(dá)直接針對CD274的3'非翻譯區(qū)域(3′-UTR)，從而對抗乙型肝炎病毒(HBV)介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)抗病毒CD8+T細(xì)胞耗盡從而抑制了HBV逃避宿主免疫監(jiān)測[19]。miR-362-3p可作為介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中TGF-β途徑與腫瘤細(xì)胞中四聚體之間串?dāng)_的核心因子，從而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[20]。

4.2 參與免疫應(yīng)答的miRNA miR-19a-3p通過靶向抑制Fra-1并抑制其下游基因VEGF、STAT3和p-STAT3來抑制M2巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)而抑制細(xì)胞免疫逃逸及HCC的惡變[21]。miR-26b-5p導(dǎo)致分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、IL-6和2在CD4+和CD8+細(xì)胞，且miR-26b-5p通過靶向HCC中的pim2增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答，通過重新激活免疫系統(tǒng)來抑制HCC的發(fā)生[22]。miR-570可抑制HCC增殖、血管生成和免疫逃逸[23]。

5 miRNA對炎癥微環(huán)境的調(diào)節(jié)

通過流行病學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪占臄?shù)據(jù)顯示慢性炎癥與各種類型的癌癥之間的聯(lián)系，使炎癥在癌癥發(fā)展中的作用已得到公認(rèn)。大多數(shù)癌癥組織表現(xiàn)出特定類型的炎癥反應(yīng)，并被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要組成部分。在80%～90%的HCC患者中發(fā)現(xiàn)了HBV和丙型肝炎病毒(HCV)。HBV是一種帶有雙鏈環(huán)狀DNA的包膜DNA病毒[24]。HBV整合到宿主基因組中，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。在大多數(shù)有HBV或HCV感染的HCC患者中都觀察到肝硬化，一些信號通路將炎癥和癌癥聯(lián)系起來，miRNA也在這些炎癥信號通路[如 NF-κB 、腫瘤蛋白(TP53)、AQP5和Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號通路]中被觀察到，miRNA通過這些機(jī)制對HBV-HCC的過程產(chǎn)生不同的影響。

5.1 miRNA對JAK/STAT通路的影響 PI3Ks信號參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B所組成的信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)誘導(dǎo)Il-6介導(dǎo)的STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-21的上調(diào)通常會在炎癥纖維化軸的早期阻斷腫瘤抑制因子(如PTEN和PDCD4)，并在HBV-HCC階段繼續(xù)[25]。miR-124 還通過直接靶向STAT3和PIK3來抑制體外和體內(nèi)HCC模型中的細(xì)胞增殖和腫瘤生長，從而抑制JAK/STAT和PI3K/AKT通路[25]。HBx下調(diào)Let-7，后者也可通過未能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)而激活STAT3信號，從而影響miRNA介導(dǎo)的關(guān)鍵腫瘤抑制因子的抑制[25]。

5.2 miRNA對AQP5通路的影響 水通道蛋白5(AQP5)高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，重置細(xì)胞周期，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移。與HBV相關(guān)的Huh7-1.3(正常細(xì)胞)和HepG2.2.15(HBV-HCC細(xì)胞)細(xì)胞中AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于Huh7和HepG2細(xì)胞，HCC細(xì)胞生長需要AQP5。而過表達(dá)miR-325-3p抑制了HBV抗原的分泌，包括HBeAg和HBsAg，以及病毒cccDNA復(fù)制和細(xì)胞增殖，促進(jìn)Huh7-1.3和HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡[26]。

5.3 miRNA對Wnt/β-catenin通路的影響 在早期HCC中，Wnt/β-catenin通路的上調(diào)是一種常見事件，它產(chǎn)生一種與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和存活有關(guān)的侵襲表型。抑制miR-181可顯著抑制肝腫瘤肝細(xì)胞(CSCs)的致瘤性，該miRNA通過激活包括caudal homeobox基因2和GATA6在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，從而調(diào)控肝臟CSCs的分化潛能[27]。而HBx上調(diào)miR-155則阻斷了WNT通路中的APC腫瘤抑制因子，并通過阻斷增強(qiáng)子11抑制HBV復(fù)制，潛在地將病毒隱藏在宿主免疫系統(tǒng)之外[27]。

5.4 miRNA對NF-κB通路的影響 NF-κB信號通路是由細(xì)胞外的刺激引起的，NF-κB細(xì)胞對外界刺激以細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等方式起到關(guān)鍵性作用。miR-127-5p通過直接與HCC細(xì)胞的膽綠素還原酶B(BLVRB)3′-UTR結(jié)合抑制NF-κB的活性，進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞的生長和集落形成，降低BLVRB的表達(dá)[28]。

6 總結(jié)

HCC腫瘤微環(huán)境極其復(fù)雜，筆者此次僅查閱了其中的部分內(nèi)容，除上述外還有如miRNA對DNA甲基化、腫瘤的Warburg效應(yīng)、端粒酶等的調(diào)節(jié)[29-31]?？傊壳癏CC仍是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病,我國肝癌新發(fā)和死亡病例均占全球半數(shù)以上[32]，由于HCC具有極大的異質(zhì)性、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，雖然手術(shù)治療是最佳的治療方案，但根治切除率低且復(fù)發(fā)率高,而現(xiàn)在全球肝移植因技術(shù)及患者自身等因素，尚不能廣泛開展。近年來廣大學(xué)者對miRNA的深入研究涉及HCC的診治、預(yù)后，與臨床療效密切相關(guān)，所以重視針對腫瘤微環(huán)境與miRNA的研究,有助于進(jìn)一步提高HCC的臨床療效。