致瀉性大腸埃希氏菌檢驗(yàn)操作要點(diǎn)及質(zhì)量控制探究

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）于2021年11月22日實(shí)施，該標(biāo)準(zhǔn)修改了肉制品和即食果蔬制品的致病菌指標(biāo)，刪除了大腸埃希氏菌O157:H7/NM項(xiàng)目，新增加了致瀉大腸埃希氏菌項(xiàng)目[1]，引起了檢驗(yàn)工作者的廣泛關(guān)注，也對(duì)該項(xiàng)目的檢測(cè)提出了更高的要求。本文通過(guò)對(duì)食品中致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)原理進(jìn)行解讀，對(duì)檢驗(yàn)操作要點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)歸納，對(duì)質(zhì)量控制要求進(jìn)行探討，為致瀉大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)工作提供參考。

1 致瀉大腸埃希氏菌概述

1.1 簡(jiǎn)介

致瀉大腸埃希氏菌是一類(lèi)能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌。致瀉大腸埃希氏菌分為5種，包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌和腸道集聚性大腸埃希氏菌。

1.2 污染源

致瀉大腸埃希氏菌常見(jiàn)的污染食品為生禽畜肉、熟肉制品、水產(chǎn)品、蔬菜以及水果等[2]。致瀉大腸埃希氏菌可通過(guò)污染水源或土壤，進(jìn)而污染食品。

1.3 致瀉大腸埃希氏菌與大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希菌的區(qū)別

大腸菌群，是指在36 ℃培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，包括埃希菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸菌屬和克雷伯菌屬等；糞大腸菌群，又稱(chēng)耐熱大腸菌群，是一群在44.5 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，主要由大腸埃希菌組成，還包括與糞便污染無(wú)直接相關(guān)性的其他菌株，如肺炎克雷伯菌；大腸埃希菌隸屬腸桿菌科埃希菌屬，其廣泛存在于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道中，是革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，能夠在44.5 ℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMVC生化試驗(yàn)結(jié)果為“++--”或“-+--”；致瀉大腸埃希氏菌是一類(lèi)能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希菌。

2 檢驗(yàn)操作要點(diǎn)

2.1 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及限量要求

食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)執(zhí)行《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.6—2016）[3]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)肉制品和即食果蔬制品的致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行了限量規(guī)定?！鄂r、凍四分體牛肉》（GB/T 9960—2008）、《鮮凍胴體羊肉》（GB/T 9961—2008）等標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定了需對(duì)致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2 檢驗(yàn)步驟及流程解讀

致瀉大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)流程可概括為樣品處理→營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌培養(yǎng)→腸道菌增菌肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)→麥康凱瓊脂（MAC）和伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）進(jìn)行分離→對(duì)典型或可疑菌落進(jìn)行生化鑒定→取生化反應(yīng)符合特征的菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)（選做）→報(bào)告每25 g樣品中是否檢出致瀉大腸埃希氏菌，并報(bào)告樣品中檢出的某類(lèi)致瀉大腸埃希氏菌的血清型別。

2.3 操作注意事項(xiàng)

①樣品為帶骨肉制品時(shí)，取可食用部位（肌肉或組織）。對(duì)易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類(lèi)）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液。②取前增菌液接種腸道菌增菌肉湯后，需在（42±1）℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，該溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)有助于抑制非腸道菌生長(zhǎng)。③分離劃線(xiàn)用直徑3 mm的接種環(huán)（1環(huán)約10 μL）；可疑菌落的選取應(yīng)是每個(gè)瓊脂平板上分別取10～20個(gè)（10個(gè)以下的全選）乳糖發(fā)酵和不發(fā)酵的菌落；生化試驗(yàn)和PCR確認(rèn)試驗(yàn)均應(yīng)挑取單個(gè)可疑菌落的純培養(yǎng)物。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，必要時(shí)可進(jìn)行二次純化。④在培養(yǎng)箱中，為了防止中間培養(yǎng)皿過(guò)熱，平板的疊放高度不宜超過(guò)6個(gè)培養(yǎng)皿。⑤在三糖鐵試驗(yàn)時(shí)，要保證三糖鐵瓊脂斜面部分和管下部瓊脂的長(zhǎng)度，一般要求瓊脂底部和斜面最低點(diǎn)的距離應(yīng)不少于4 cm，穿刺時(shí)宜穿刺至培養(yǎng)基底部3～5 mm處；在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)將試管口松開(kāi)，保持管內(nèi)有充足的氧氣，否則由于氧氣不足，斜面酸性產(chǎn)物不能氧化恢復(fù)紅色，而影響結(jié)果的判斷。⑥在氰化鉀試驗(yàn)時(shí)，由于氰化鉀是劇毒藥品，應(yīng)注意小心操作，切勿沾染。⑦增菌后的所有操作均應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，操作時(shí)應(yīng)有防污染的措施；在進(jìn)行可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時(shí)，均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成。⑧在血清學(xué)試驗(yàn)時(shí)，首先要進(jìn)行菌體的自凝性檢查。大腸埃希氏菌H抗原在傳代中容易丟失或發(fā)育不良，需在半固體上傳代3次，觀察生長(zhǎng)情況。如不擴(kuò)散，則表示H抗原丟失，無(wú)法做H抗原凝集試驗(yàn)。⑨按照標(biāo)準(zhǔn)要求，需要先對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，生化鑒定為大腸埃希氏菌后，再進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)，判定致瀉大腸埃希氏菌的種類(lèi)。因?yàn)樵谀c桿菌科中，一些致病菌也存在相同的毒力基因，所以不能對(duì)可疑菌落直接進(jìn)行毒力基因檢測(cè)來(lái)判定致瀉大腸埃希氏菌的種類(lèi)。⑩一般情況下，根據(jù)特征毒力基因檢測(cè)結(jié)果可確認(rèn)樣品中致瀉大腸埃希菌的型別，不需要進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。在食源性疾病暴發(fā)溯源調(diào)查時(shí)，血清學(xué)分型簡(jiǎn)便易行。在確定了致瀉大腸埃希菌型別后，可以快速對(duì)不同來(lái)源菌株的同源性進(jìn)行初步判斷，利于溯源調(diào)查。

3 質(zhì)量控制要求

在食品微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法，嚴(yán)格按照食品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理要求進(jìn)行檢驗(yàn)[4]。

3.1 人員要求

①微生物實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)掌握微生物檢驗(yàn)方面的基礎(chǔ)操作，如培養(yǎng)基制備、消毒滅菌、無(wú)菌操作、倒平板和菌種傳代等。經(jīng)考核合格后持證上崗，并制定繼續(xù)教育計(jì)劃，不斷更新知識(shí)和技能。②檢驗(yàn)人員必須熟悉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、檢驗(yàn)程序、方法和結(jié)果評(píng)價(jià)。③檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室生物安全方面的培訓(xùn)，熟悉生物安全操作知識(shí)和消毒滅菌知識(shí)，保證自身安全，防止污染擴(kuò)散。

3.2 環(huán)境控制要求

①PCR確認(rèn)試驗(yàn)的試驗(yàn)環(huán)境和試驗(yàn)操作應(yīng)符合食品分子生物學(xué)檢測(cè)的要求，注意預(yù)防污染。使用和處理有毒有害物質(zhì)時(shí)，注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)和對(duì)環(huán)境的保護(hù)。②為了控制環(huán)境污染，每次檢驗(yàn)過(guò)程中，于檢驗(yàn)臺(tái)上打開(kāi)兩塊平板計(jì)數(shù)瓊脂平板，并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15 min，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗(yàn)過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗(yàn)環(huán)境的污染。③定期對(duì)生物安全實(shí)驗(yàn)室和生物安全柜進(jìn)行潔凈度監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)項(xiàng)目包括懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、溫濕度和照度等。

3.3 設(shè)備、設(shè)施要求

①檢驗(yàn)中所用設(shè)備必須是經(jīng)過(guò)檢定的設(shè)備。檢驗(yàn)所用耗材，如吸管、培養(yǎng)基、平皿必須完全滅菌。重復(fù)使用的耗材應(yīng)徹底清洗干凈，不得殘留抑菌物質(zhì)。②非簡(jiǎn)單壓力容器操作人員需持特種作業(yè)人員上崗證。高壓蒸汽滅菌器，應(yīng)用化學(xué)指示膠帶、指示卡或生物指示劑，驗(yàn)證滅菌效果。③監(jiān)測(cè)恒溫培養(yǎng)箱溫度是否恒定，溫度變化不可超過(guò)±1 ℃。建議安裝溫度監(jiān)控系統(tǒng)，對(duì)恒溫培養(yǎng)箱的溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。④對(duì)于一些容易污染微生物的儀器設(shè)備，如培養(yǎng)箱、水浴鍋、冰箱、生物安全柜和層流超凈工作臺(tái)等，定期進(jìn)行清潔、消毒。

3.4 培養(yǎng)基、試劑要求

①實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基和試劑按照GB 4789.28—2013的規(guī)定進(jìn)行驗(yàn)收和性能測(cè)試，做好記錄。不應(yīng)使用結(jié)塊、顏色發(fā)生變化或其他物理性狀發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基。②培養(yǎng)基溶解和滅菌后分別測(cè)定pH值，以保證細(xì)菌培養(yǎng)所需pH值符合要求。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)明配制日期，不宜放置過(guò)久。采用經(jīng)驗(yàn)證的滅菌程序滅菌；已滅菌的培養(yǎng)基可在4～10 ℃存放7 d，存放時(shí)應(yīng)避免陽(yáng)光直射、液體蒸發(fā)和雜菌侵入；當(dāng)液體顏色變化、體積變化時(shí)，應(yīng)廢棄、不用。③檢測(cè)試劑盒和診斷血清驗(yàn)收時(shí)注意查看批號(hào)、有效期、血清效價(jià)、透明度與色澤，及時(shí)冷藏（2～8 ℃）儲(chǔ)存。使用過(guò)程中，盡量縮短脫離冷藏環(huán)境的時(shí)間。

3.5 內(nèi)外部質(zhì)量控制

①實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要做空白對(duì)照，如果空白對(duì)照板上出現(xiàn)菌落時(shí)，應(yīng)廢棄本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并從實(shí)驗(yàn)環(huán)境、培養(yǎng)基、平皿和吸管等方面分析污染來(lái)源。②每次進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)使用腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌/腸出血性大腸桿菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。同時(shí)使用大腸埃希氏菌ATCC 25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對(duì)照，以滅菌去離子水為空白對(duì)照，控制PCR污染體系。腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌/腸出血性大腸桿菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)從專(zhuān)業(yè)微生物保藏機(jī)構(gòu)、同行認(rèn)可的專(zhuān)業(yè)權(quán)威機(jī)構(gòu)或有資質(zhì)的商業(yè)派生菌株生產(chǎn)廠家等認(rèn)可的途徑獲得，菌株經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后使用。CICC 10667、CICC 24186、CICC 24188和CICC 24189分別屬于產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸道集聚性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌和腸道致病性大腸埃希氏菌。CICC 10670和CICC 24187屬于腸道出血性大腸埃希氏菌[5]。③定期使用致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或相應(yīng)定量活菌參考品，在陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽(yáng)性試驗(yàn)驗(yàn)證，染菌量應(yīng)控制在每25 g樣品中含10～100 CFU活菌，并進(jìn)行記錄，質(zhì)控頻次至少每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行1次。④通過(guò)參加該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)或能力驗(yàn)證，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，及時(shí)發(fā)現(xiàn)自身存在的問(wèn)題和與其他實(shí)驗(yàn)室間的差距。

4 結(jié)語(yǔ)

食品微生物檢驗(yàn)受諸多因素的影響，如樣品中微生物分布的不均勻性、環(huán)境帶來(lái)的污染、培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量不符合要求和人員操作帶來(lái)的偏差等。生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)人員在進(jìn)行致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)程序操作，掌握操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)，從人、機(jī)、料、法和環(huán)等方面進(jìn)行質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。