CRISPER/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點修飾及作物遺傳育種中的應(yīng)用研究進展

權(quán) 瑩，張曉娟，趙 輝，孫曉敏，馬秀奇

（1陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2陜西理工大學(xué)體育學(xué)院，陜西漢中 723001；3陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西漢中 723001）

0 引言

基因組編輯技術(shù)是通過特定核酸酶對基因組特定位點進行編輯和修飾的一項技術(shù)。CRISPR/Cas9即規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9[1]，是目前最先進也是應(yīng)用最廣泛的一項高效、簡便的基因定點編輯技術(shù)，較之前的兩種基因編輯技術(shù)（ZFNs和TALENs)具有較大的優(yōu)勢。CRISPR/Cas9是根據(jù)細菌防御外界噬菌體侵染的分子機制構(gòu)建的體系。它是由RNA介導(dǎo)，借助Cas9蛋白對基因組進行定點切割，然后通過機體的修復(fù)機制將DNA重新連接，或?qū)⑿禄虿迦氲交蚪M中的一項基因編輯技術(shù)[2]。該技術(shù)在基礎(chǔ)研究、作物育種、基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9應(yīng)用于植物領(lǐng)域，具有特異性較高、脫靶率低的特點[3-4]，是作物育種改良快速、有效、安全的途徑，它可對多個基因同時編輯，促進育種向高效、快速、低成本方向發(fā)展。近年來，該系統(tǒng)已在高粱[5]、玉米[6]、番茄[7]、油菜[8]、大麥[8]、矮牽牛[9]、葡萄[10]、甜橙[11]、大豆[12]、棉花[13]、楊樹[14]、甘蔗[15]等多種作物中取得成功應(yīng)用，發(fā)展前景廣闊。

1 CRISPR/Cas9的原理及優(yōu)點

CRISPR/Cas普遍存在于古生菌和細菌中，其作為細菌/古生菌的獲得性免疫系統(tǒng)，能夠特異識別并降解再次入侵的外源DNA分子（如噬菌體等）[16-17]。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)組成包括兩部分，即高度保守的重復(fù)序列以及位于其間的間隔序列，間隔序列的作用是特異性識別外源DNA分子。外源DNA分子入侵宿主時，前者DNA中的原型間隔序列被Cas9蛋白特異切割，之后整合到宿主的CRISPR位點，成為CRISPR間隔序列。當(dāng)其再次入侵時，宿主DNA中的“重復(fù)-間隔”序列轉(zhuǎn)錄、加工成小的crRNA，然后與tracrRNA(trans-activating crRNA)配對結(jié)合，之后識別、結(jié)合Cas9蛋白并最終形成RNA-蛋白復(fù)合體[18]。該復(fù)合體特異識別入侵DNA分子中的原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)，PAM的存在是導(dǎo)致其上游的原間隔序列被切割的先決條件。crRNA中的間隔序列通過與入侵DNA上的原間隔序列互補配對，介導(dǎo)Cas9蛋白對外源DNA特異性切割[19-20]，引起DNA雙鏈斷裂，接著由宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)進行修復(fù)[21-22]，從而形成基因組定點插入、缺失等編輯。

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型。其中，Ⅱ型系統(tǒng)僅有1個Cas蛋白，也就是Cas9蛋白，其核酸酶切割功能域由Ruv C和HNH結(jié)構(gòu)域組成，可分別切割靶DNA雙鏈[23]。II型系統(tǒng)組成簡單，CRISPR/Cas9技術(shù)就是由該系統(tǒng)改造而來的。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢。首先，該技術(shù)非常簡便、經(jīng)濟。其載體構(gòu)建簡單，研究者只需要設(shè)計合成20 bp的sgRNA。其次，CRISPR/Cas9系統(tǒng)生物安全性高，通過回交分離，該技術(shù)可獲得無外源基因的類似于自然突變的突變株系[24]。再次，CRISPR/Cas9技術(shù)可同時編輯多個靶基因，將其應(yīng)用于多倍體植物基因功能研究[25]，可解決植物中由于存在多個同源基因或者多個基因平行參與某個信號途徑，導(dǎo)致的單個基因敲除并不能產(chǎn)生功能變化的問題。此外，該技術(shù)克服了分子標(biāo)記輔助育種中的連鎖累贅和分子標(biāo)記丟失問題，對作物的其他性狀基本沒有影響。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)影響因素及優(yōu)化改進

Jinek等[20]將crRNA和tracrRNA合并，形成一條單鏈引導(dǎo)RNA（即sgRNA），由該RNA引導(dǎo)Cas9蛋白對靶序列實施定點切割，實現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡化改造。研究者只需要根據(jù)靶基因NGG位點上游20個堿基設(shè)計一條sgRNA，即可通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速實現(xiàn)靶基因的切割、編輯。在水稻中的研究表明，使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA兩者配合使用效率更高[26]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于植物基因編輯，其突變效率和特異性受sgRNA、Cas9蛋白、靶序列及啟動子等因素影響，對這些影響因素進行優(yōu)化，可提高該系統(tǒng)的效率和精確性[27-28]。sgRNA序列對CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性具有主要決定作用，Cas9切割位點的確定由sgRNA與靶序列配對完成。設(shè)計sgRNA時，應(yīng)保證其序列特異性。測序分析表明，sgRNA的3′端序列與靶DNA的配對對于識別和介導(dǎo)靶基因突變更為重要，3′端距離PAM的8～12個序列主要影響sgRNA的特異性，是sgRNA的核心序列[29]。sgRNA的GC含量也影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，在其5′端添加2個堿基GG，可減低其脫靶率[30]。sgRNA長度一般設(shè)計為17～20 nt；適當(dāng)縮短sgRNA的長度（15個堿基）可減少脫靶率，但編輯效率會降低[31]。sgRNA的表達量[32]及表達策略也影響CRISPR/Cas9的編輯效率[33]。

對Cas9核酸酶結(jié)構(gòu)進行改造可提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性。通過突變Cas9蛋白的RuvC或HNH結(jié)構(gòu)域，將其改造為僅能切割單鏈DNA的單切口酶，將后者與“paired-g RNAs”結(jié)合進行基因組編輯，可有效提高系統(tǒng)特異性[34]。此外，增加Cas9的切口酶活性能減少脫靶效應(yīng)[35]。Cas9基因的表達水平也影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率[36]。

CRISPR/Cas9中，靶序列組成、GC含量影響靶DNA的切割效率[37]。水稻中研究表明，GC含量高(50%～70%)的目標(biāo)基因組具有較高的編輯效率[27]。

啟動子也是影響Cas9基因表達水平以及基因編輯效率的關(guān)鍵因素。在水稻中，用Ubiquitin啟動子編輯效率明顯高于CaMV35S啟動子[38]。在雙子葉植物中，采用CaMV35S啟動子可高效表達Cas9基因[39]。此外，PAM序列，一般為NGG，也對CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯效率存在影響。除了識別NGG外，NRG（R代表A或G）也可被Cas9識別，但切割頻率顯著降低，只有NGG的1/5[40]。

3 在植物基因功能及基因表達調(diào)控中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)可快速地對基因進行敲除，為植物基因功能、基因表達調(diào)控及功能基因組學(xué)等研究提供了快速有效的途徑。

3.1 基因定點敲除或插入

目前，通過基因敲除進行編輯為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中應(yīng)用的主要方式。堿基刪除數(shù)目越多，出現(xiàn)的頻率越低[27]。Wang等[41]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻品種‘空育131’的負調(diào)控稻瘟病菌抗性及耐鹽性的OsERF922基因進行敲除，得到抗稻瘟病的突變材料。王凱婕等[42]利用該技術(shù)對水稻OsRhoGDI2基因進行定點敲除，獲得的突變體株高較對照顯著降低。

外源基因的插入，可通過HDR途徑，采用導(dǎo)入含目的基因同源臂的外源DNA實現(xiàn)[43]。Schiml等[44]首次通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以兩端含有與間隔序列相同的DNA為模板，將NPTII基因片段通過DNA的同源重組修復(fù)機制成功導(dǎo)入擬南芥ADHI基因位點。沈春修[45]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對耐冷性較強的粳稻品種LOC_Os10g05490位點進行定點編輯，得到了基因敲除突變體。

3.2 基因表達調(diào)控研究

CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)改造后可用于基因表達調(diào)控研究。突變Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC），將Cas9蛋白改造成僅具有DNA結(jié)合功能的缺陷型核酸酶dCas9，然后與具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白結(jié)合，在crRNA引導(dǎo)下，識別靶基因并對其進行激活或抑制[18]。

CRISPRi(CRISPR interference)又稱CRISPR干擾。該系統(tǒng)將dCas9與KRAB、SID、RNAP等具有轉(zhuǎn)錄阻遏功能的結(jié)構(gòu)域融合，對靶基因進行抑制[46]。Piatek[47]利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域SRDX與dCas9蛋白的C端融合形成dCas9-SRDX，成功在煙草中干擾了PDS基因的表達。

CRISPR-on系統(tǒng)則具有轉(zhuǎn)錄激活活性作用。該系統(tǒng)中，dCas蛋白與VP16/VP64、p65、EDLL等轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，從而激活靶基因的表達[48]。Zetche等[49]基于FRB和FKBP兩者互作，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子VP64對靶基因表達的促進。

此外，研究者們還開發(fā)了以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新的基因表達調(diào)控技術(shù)。Zalatan等[50]對dCas9系統(tǒng)進行改造，將sgRNA轉(zhuǎn)化為具有招募RNA結(jié)合蛋白功能的scRNA(scaffold RNA)，通過連接在RNA結(jié)合蛋白上的效應(yīng)蛋白對靶基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

4 CRISPR/Cas9用于植物基因組定點編輯及作物分子育種

4.1 植物基因組定點編輯

目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物基因定點突變及基因定點整合等研究。Zhang等[51]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在水稻不同亞種中，選擇11個目標(biāo)基因進行編輯，T0代植株中突變效率即達到了66.7%，且有6個靶位點為純合基因型。擬南芥中，廖嘉明等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了擴展蛋白EXPA的多基因編輯表達載體pHEE401E-AtEXPAs，實現(xiàn)了擬南芥擴展蛋白的多基因突變。Wang等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在六倍體小麥中對單個TaMLO位點進行編輯，在T0轉(zhuǎn)基因株系中鑒定到4株突變位點不同的突變體。Abe等[54]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式，成功獲得調(diào)控小麥休眠的Qsd1基因的三重敲除突變體。

CRISPR/Cas9技術(shù)還可同時修飾多倍體植物中的不同同源基因。Braatz等[55]僅使用一個靶序列，在T1代油菜中實現(xiàn)了ALC的4個等位基因同時突變。

4.2 CRISPR/Cas9在作物分子育種中的應(yīng)用

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，作物遺傳改良已經(jīng)由常規(guī)雜交向高效、精準(zhǔn)的定向育種轉(zhuǎn)變。CRISPR/Cas9技術(shù)可對基因組特定位點進行精準(zhǔn)編輯和修飾，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中隨機插入導(dǎo)致的內(nèi)源基因失活、外源基因沉默等缺點，在作物品種定向改良中具有重要的應(yīng)用價值。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對控制作物重要性狀的基因進行定點編輯，如對控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性的負調(diào)控因子進行敲除，調(diào)控相關(guān)代謝過程，可快速獲得具有優(yōu)良性狀的突變體，大大縮短優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗作物新品種的選育周期[56]。

徐鵬等[57]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對稻瘟病抗性相關(guān)基因進行編輯，獲得了抗性明顯增強的水稻Pi21單突變純合株系及三基因（Pita、Pi21和ERF922）突變純合株系，為水稻抗稻瘟病育種提供了育種材料。Xu等[58]對控制粒重的3個基因（GW2、GW5和TGW6）同時進行基因定點編輯，得到粒重較對照明顯增加的gw5tgw6二基因突變體和gw2gw5tgw6三基因突變體，可用于水稻高產(chǎn)育種。汪秉坤等[59]對水稻直鏈淀粉基因-Waxy(Wx)進行定點敲除，得到低直鏈淀粉含量并且可穩(wěn)定遺傳的株系，直鏈淀粉含量由之前的17.5%降至1.93%。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對控制花粉或花藥發(fā)育過程的基因進行編輯可快速創(chuàng)制新型不育系，促進水稻雜種優(yōu)勢利用[60]。覃玉芬等[61]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對TMS5基因進行編輯，T0代純合突變體高達58.4%，研究獲得了無外源DNA的溫敏雄性核不育系GXU41-5S。

小麥中，Zhang等[62]報道了基于突變植株瞬時表達CRISPR/Cas9 DNA（縮寫為TECCDNA）的基因組編輯方法。該研究對控制小麥籽粒長度和重量的TaGASR7基因和控制花序結(jié)構(gòu)并影響穗生長和籽粒產(chǎn)量的TaDEP1基因進行定點敲除，在T0代即獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的純合敲除突變體。

玉米中，Svitashev等[63]采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對ALS2基因定向敲除，獲得了抗磺胺脲除草劑的突變體植株。Shi等[64]利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了玉米AGROS8突變體，該突變體抗旱性增強且在干旱脅迫下仍有較高產(chǎn)量。

5 問題及展望

CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中應(yīng)用雖然具有明顯的優(yōu)勢，但也存在一些不足，主要表現(xiàn)為CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在脫靶現(xiàn)象[65]，需進一步提高其特異性。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在通過同源重組(HDR)方式定點導(dǎo)入基因效率較低的問題，需進一步改造該系統(tǒng)，提高基因靶向?qū)胄省iki等[66]以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合二代轉(zhuǎn)化策略，在擬南芥中實現(xiàn)了超長DNA片段的高效精確敲入及替換。它不需要標(biāo)記輔助篩選，插入或替換效率高達5%～10%。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一項簡單、高效、低成本且安全性較高的作物育種新技術(shù)，大大提高了作物遺傳改良和良種選育的效率，推動了作物精確育種研究。今后，通過HDR方式定向?qū)肟刂浦匾r(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因以及通過基因定點整合實現(xiàn)多個優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的聚合將成為該技術(shù)在作物遺傳改良以及育種中的重點研究方向。

CRISPR/Cas9技術(shù)在植物表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域同樣具有良好的應(yīng)用價值。將dCas9與甲基化酶、磷酸化酶等表觀修飾因子融合對染色體進行定點表觀修飾，可以研究特定基因表觀修飾的功能[18]。將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與單分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合可實現(xiàn)對活細胞內(nèi)染色體、基因構(gòu)象及動力學(xué)的研究[67]。CRISPR/Cas9技術(shù)還可用于調(diào)控植株代謝網(wǎng)絡(luò)，通過對某個代謝途徑中的關(guān)鍵基因進行定點編輯，從而對植株代謝進行調(diào)控，提高次生代謝物含量，在提高經(jīng)濟效益的同時減少藥用植物資源的采挖，保護植物資源。Cas9/sgRNA系統(tǒng)在病毒防御中也具有很好的應(yīng)用前景。利用Cas9蛋白對病毒基因或受體基因進行突變從而阻止病菌入侵，是植物抗病毒研究的有效方法[68]。