外泌體在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化及其在牙周再生中的研究進(jìn)展

張淑婷，吳亞星，劉翠翠，李晨晨，張 靜，

牙周病是人類口腔第一高發(fā)疾病，在長(zhǎng)期持續(xù)的炎癥刺激下，牙槽骨可發(fā)生病理性吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)甚至脫落[1-2]。隨著組織工程研究的逐漸深入，干細(xì)胞在骨組織修復(fù)中的作用日益凸顯[3-4]，但體外擴(kuò)增能力有限、生物學(xué)效應(yīng)繁雜、主要生物功能可被生物活性分子組合所取代等局限性阻礙了其發(fā)展和應(yīng)用[5-6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體(exosome)能夠通過攜帶蛋白、miRNAs等分子傳遞信號(hào)，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)等成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖、分化，影響骨組織生成和吸收過程。本文就外泌體在BMSCs骨向分化中的研究作一綜述，為外泌體在臨床骨缺損中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 外泌體的生物學(xué)特征

外泌體是一種來源于多種細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡[7]，不同細(xì)胞衍生的外泌體可通過核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子傳遞信號(hào)[8]，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，促進(jìn)血管生成和調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)[9-10]。外泌體存在于生物體的各種體液中，可通過循環(huán)系統(tǒng)在全身傳播，并通過血腦屏障和其他組織被靶細(xì)胞吸收。外泌體可通過3種方式傳遞信號(hào)：受體-配體結(jié)合、膜融合或吞噬作用。目前多種類型細(xì)胞已被證實(shí)能產(chǎn)生并分泌外泌體到細(xì)胞外環(huán)境中，通過細(xì)胞間的相互作用影響局部微環(huán)境并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。外泌體特性與其來源的細(xì)胞有關(guān)，不同細(xì)胞來源的外泌體通過不同的分子傳遞信號(hào)，調(diào)控目標(biāo)細(xì)胞的發(fā)育、增殖及免疫能力。

2 不同來源外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

Treg細(xì)胞是T細(xì)胞中一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性并調(diào)控炎癥反應(yīng)，是重要的免疫調(diào)節(jié)功能細(xì)胞[11-12]。Treg細(xì)胞在2013年才首次被證實(shí)具有釋放外泌體參與免疫調(diào)節(jié)的作用[13]，外泌體是Treg細(xì)胞發(fā)揮生物功能不可或缺的組成部分，CD8+Treg細(xì)胞活化后釋放外泌體表達(dá)抗炎介質(zhì)抑制樹突狀細(xì)胞引發(fā)的免疫反應(yīng)，以及表達(dá)FasL發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[14]。Tregs介導(dǎo)的抗炎微環(huán)境能促進(jìn)骨再生，通過抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，提高BMSCs介導(dǎo)的骨形成[15]。另一項(xiàng)研究證明，Treg細(xì)胞來源的外泌體過表達(dá)miR-142-3p，顯著促進(jìn)BMSCs成骨分化和血管生成。miR-142-3p還可通過抑制TGFBR1/SMAD2促進(jìn)成骨分化[16]。

2.2 巨噬細(xì)胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

巨噬細(xì)胞在先天免疫反應(yīng)和成骨功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在急性炎癥時(shí)，巨噬細(xì)胞可將炎癥細(xì)胞聚集到受損部位后清除損傷組織，同時(shí)釋放抗炎信號(hào)介導(dǎo)骨再生。巨噬細(xì)胞有M1型(促炎表型)和 M2型(抗炎表型)。急性炎癥期，M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)活躍，隨后巨噬細(xì)胞可分化為M2型巨噬細(xì)胞，并釋放相關(guān)因子促進(jìn)成骨，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2等[17-18]。研究表明，用鈦顆粒刺激巨噬細(xì)胞，TNF-α等促炎因子表達(dá)明顯上調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)檢查鈦顆粒刺激的正常和轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，均觀察到巨噬細(xì)胞向M1型極化[19]。研究發(fā)現(xiàn)miR-5106在M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體(M2D-Exos)中顯著過表達(dá)，而在M1型巨噬細(xì)胞來源的外泌體(M1D-Exos)中表達(dá)下降。這種外泌體miRNA可以直接靶向鹽誘導(dǎo)激酶2和3(SIK2和SIK3)誘導(dǎo)BMSCs成骨分化[20]。SIK2/SIK3過表達(dá)時(shí)，可在BMSCs中檢測(cè)到成骨基因水平降低。miR-5106過表達(dá)導(dǎo)致SIK2和SIK3的表達(dá)明顯受到抑制，可挽救SIK2/SIK3對(duì)成骨分化造成的部分負(fù)面影響。另一項(xiàng)研究報(bào)告稱，高糖高胰島素對(duì)BMSCs成骨分化潛能有抑制作用。干預(yù) M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體后，BMSCs中的Hedgehog信號(hào)通路被激活，成骨分化潛能增強(qiáng)[21]。

2.3 BMSCs外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

BMSCs外泌體含有三種成骨相關(guān)miRNA：miR-196a、miR-27a和miR-206，其中miR-196a是最重要的外源性成骨調(diào)節(jié)因子。此外，血管再生在骨修復(fù)中的也起著至關(guān)重要的作用。BMSCs衍生的外泌體能夠增加體外內(nèi)皮細(xì)胞的活力，并刺激體內(nèi)血管生成。BMSCs衍生的外泌體過表達(dá)miR-26a-5p，可在體外延緩滑膜成纖維細(xì)胞的損傷，并在體內(nèi)減輕骨關(guān)節(jié)炎損傷[22]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs衍生的外泌體過表達(dá)糖蛋白非黑色素瘤克隆B(GPNMB)能有效促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖和成骨分化，減輕卵巢切除誘導(dǎo)的骨丟失，可能的機(jī)制是激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[23]。另一項(xiàng)研究報(bào)告稱，將BMSCs衍生的外泌體可逆地固定在三維多孔聚醚醚酮(PEEK)表面上，結(jié)果顯示在Exo-TA-SPEEK上培養(yǎng)的BMSCs表現(xiàn)出更好的增殖和黏附能力。負(fù)載外泌體的聚醚醚酮可通過NF-κB途徑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，Exo-TA-SPEEK提供了更有利的骨免疫微環(huán)境，有利于BMSCs的進(jìn)一步成骨分化。此外，研究結(jié)果表明Exo涂層的PEEK可促進(jìn)BMSCs的直接成骨分化[24]。

2.4 成骨細(xì)胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

成骨細(xì)胞來源外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA可發(fā)出信號(hào)，觸發(fā)靶細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞間信息交流[25]。研究表明成骨細(xì)胞在分化中晚期釋放的外泌體可顯著促進(jìn)去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，改善骨質(zhì)疏松；結(jié)果還表明，外泌體對(duì)成骨的影響與基質(zhì)囊泡的成熟有關(guān)，只有中晚期的外泌體具有成骨誘導(dǎo)作用，中期的外泌體經(jīng)人工軟骨淋巴處理可促進(jìn)基質(zhì)囊泡的成熟，但對(duì)成骨誘導(dǎo)作用無影響[26]。此外，來自礦化成骨細(xì)胞的外泌體可促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞[27]。礦化成骨細(xì)胞來源的外泌體可激活Wnt信號(hào)促進(jìn)BMSCs的骨向分化。在受體細(xì)胞中，通過激活下游信號(hào)通路，尤其是Wnt信號(hào)、胰島素信號(hào)、TGF信號(hào)和鈣信號(hào)參與成骨。但成骨細(xì)胞來源的外泌體也可導(dǎo)致骨丟失[28]，通過RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。此外，miR-214可抑制PTEN表達(dá)，同時(shí)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。

2.5 破骨細(xì)胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

除骨吸收外，破骨細(xì)胞也能夠促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性。破骨細(xì)胞來源的外泌體還可通過miR-324靶向arhgap1(骨分化的負(fù)調(diào)控因子)[29]，在體外可顯著誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化和礦化，且富含miR-324的外泌體修飾支架在小鼠顱骨缺損模型中表現(xiàn)出較高的成骨能力。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)核因子受體激活劑RANK在破骨細(xì)胞釋放的外泌體中高度表達(dá)，是破骨細(xì)胞發(fā)生旁分泌的調(diào)節(jié)因子，RANK負(fù)載的破骨細(xì)胞衍生囊泡結(jié)合成骨細(xì)胞RANKL，并通過RANKL反向信號(hào)促進(jìn)骨形成[30]。此外，來自成熟破骨細(xì)胞的外泌體可以通過旁分泌機(jī)制抑制破骨細(xì)胞的形成。破骨細(xì)胞衍生的外泌體在炎癥性骨病中可防止過度骨溶解。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿中的外泌體與正常人血漿中的外泌體相似，能夠抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生[22]，可能是由于成熟破骨細(xì)胞衍生的外泌體中受體RANK可作為誘餌受體，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，與骨保護(hù)素作用類似。

2.6 脂肪干細(xì)胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

脂肪干細(xì)胞(adipose stem cells，ASCs)方便且易于獲取，近來逐漸進(jìn)入人們視野。研究表明ASCs表現(xiàn)出與BMSCs類似的生物學(xué)能力[31]。ASCs衍生的外泌體可通過抑制促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、PGE2、NO的產(chǎn)生和增加抗炎因子的表達(dá)水平，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的骨形成。研究發(fā)現(xiàn)，ASCs來源的外泌體可通過過表達(dá)miR-375，上調(diào)具有成骨誘導(dǎo)的成骨相關(guān)基因(包括RUNX2、ALP、COL1A1和OCN)的mRNA表達(dá)，促進(jìn)BMSCs體外成骨分化[32]。

另一項(xiàng)研究表明，將ASCs衍生的外泌體固定在聚多巴胺涂層的聚乳酸-co -乙醇酸(PLGA/pDA)支架上，外泌體可從PLGA/pDA支架中緩慢且持續(xù)地釋放出來，增強(qiáng)BMSCs的體外遷移能力[33]。此外，負(fù)載ASCs外泌體的Mg-GA支架，可穩(wěn)定骨移植環(huán)境，保證血液供應(yīng)，促進(jìn)BMSCs成骨分化[34]。

3 外泌體在牙周炎中的作用

牙周病導(dǎo)致的牙周組織破壞與致病菌引起的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[35]，牙周炎中的多種炎癥因子可導(dǎo)致進(jìn)行性骨溶解，抑制骨形成。在炎癥過程中，各種細(xì)胞釋放的外泌體可同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)[36]，這可能是機(jī)體的自我保護(hù)作用。然而，這種抗炎作用并不能完全阻止牙周炎的進(jìn)展。即使清除牙周病原體，牙周炎所導(dǎo)致的牙槽骨吸收也難以恢復(fù)，改善牙周附著水平是一個(gè)重要的治療目標(biāo)[37]。近年來，外泌體在牙周再生中的應(yīng)用潛力已得到證實(shí)。外泌體在牙周炎的治療中有3個(gè)主要途徑：調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制骨吸收和啟動(dòng)骨修復(fù)。研究表明BMSCs能夠促進(jìn)牙周再生，BMSCs來源外泌體可通過增加牙周膜(PDL)細(xì)胞的遷移和增殖來促進(jìn)牙周再生，是一種可行的治療牙周組織缺損方法。研究證實(shí)BMSCs外泌體可通過腺苷受體介導(dǎo)的AKT和ERK信號(hào)通路激活增強(qiáng)PDL細(xì)胞遷移和增殖，其與膠原海綿聯(lián)合使用能夠在大鼠牙周組織缺損模型中促進(jìn)牙周組織再生，且不會(huì)引起任何不良反應(yīng)[38]。

另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ASCs來源的外泌體對(duì)牙周炎的治療效果優(yōu)于ASCs本身。ASCs來源的外泌體可促進(jìn)牙周組織的再生，為牙周治療提供新的參考。此外，牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSC)衍生的外泌體可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化，抑制炎癥反應(yīng)，可能為巨噬細(xì)胞參與牙周炎治療提供了一種可能方法[39]。

4 總 結(jié)

外泌體在治療骨缺損方面具有巨大的應(yīng)用潛力，局部微環(huán)境中的Treg細(xì)胞、BMSCs、成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等不同來源的外泌體均可參與調(diào)節(jié)骨修復(fù)。與臨床使用的常規(guī)療法相比，外泌體具有良好的穩(wěn)定性、可操作性和廣泛的來源，因此應(yīng)用前景十分廣闊。然而，其系統(tǒng)機(jī)制尚未被有效解釋，不同劑量的外泌體對(duì)骨再生修復(fù)可產(chǎn)生不同的影響，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。由于體內(nèi)和體外以及生物體之間的差異，外泌體在牙周炎中的作用也需進(jìn)一步的研究來確認(rèn)其療效。不同細(xì)胞衍生的外泌體可通過各種途徑和信號(hào)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)BMSCs成骨分化和牙周組織再生，為牙周炎導(dǎo)致骨缺損的治療提供參考。