與前列腺癌恩雜魯胺耐藥相關(guān)鐵死亡基因的生物信息學(xué)分析

葉大文，張兆存，趙海鋒，王碩，姜先洲

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科，濟(jì)南250012

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)中，前列腺癌已成為第三大常見癌癥，其病死率約占全球男性癌癥相關(guān)死亡的7%［1］。目前，內(nèi)分泌治療是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法，但部分患者會(huì)在治療18～24個(gè)月后發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）。恩雜魯胺作為第二代雄激素受體抑制劑，已成為許多臨床中心治療CRPC的一線選擇。不過，雜魯胺雖然可以延遲CRPC的進(jìn)展，但僅可維持患者4～6月的總生存期，這在一定程度上與抗雄治療后恩雜魯胺耐藥有關(guān)，其確切機(jī)制尚不清楚［2］。鐵死亡作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡中的一種，主要特征是鐵離子的積累和脂質(zhì)過氧化物在膜上的聚集［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，具有固有或獲得性耐藥的腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡高度敏感，且鐵死亡與腫瘤免疫治療的效果密切相關(guān)［4］。因此，探索鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的具體機(jī)制，尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志基因，對(duì)開發(fā)有效的CRPC干預(yù)措施至關(guān)重要。2021年3月—2022年3月，本研究通過生物信息學(xué)方法篩選與前列腺癌恩雜魯胺耐藥相關(guān)的鐵死亡差異表達(dá)的基因，并從中進(jìn)一步尋找具有獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值的預(yù)后標(biāo)志基因，以期能為探索鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)提供一定參考和方向。

1 材料與方法

1.1 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因篩選從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載恩雜魯胺耐藥與未耐藥的前列腺癌細(xì)胞測(cè)序基因集GSE104935和GSE78201，以P＜0.05及|log2FC|≥1作為條件篩選差異表達(dá)基因。通過FerrDb數(shù)據(jù)庫（http：//www.zhounan.org/ferrdb）收集鐵死亡相關(guān)基因，包括驅(qū)動(dòng)基因、抑制基因及標(biāo)記基因。將GSE104935、GSE78201基因集篩選出的差異表達(dá)基因及FerrDb數(shù)據(jù)庫收集到的鐵死亡相關(guān)基因通過ImageGP維恩圖工具取交集，得到鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的差異表達(dá)基因。

1.2 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因的GO功能與KEGG作用通路分析將篩選出的鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因通過R軟件的“clusterprofiler”包進(jìn)行GO功能（包括生物過程、分子功能、細(xì)胞成分）和KEGG作用通路富集分析，以校正后P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異表達(dá)基因顯著富集的功能與作用通路。

1.3 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因篩選選取美國癌癥研究所及美國人類基因組研究所收集處理的關(guān)于前列腺癌的測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)TCGA-PRAD，通過R軟件在TCGA-PRAD根據(jù)前列腺癌患者的臨床預(yù)后情況對(duì)鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因進(jìn)行單因素、多因素Cox回歸分析，取單因素、多因素Cox回歸分析中P均＜0.05的差異表達(dá)基因作為鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因。

1.4 預(yù)后標(biāo)志基因表達(dá)及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值分析

利用R軟件的survival包在TCGA-PRAD隊(duì)列中分析鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因的表達(dá)水平，以預(yù)后標(biāo)志基因在前列腺癌組織中的表達(dá)中位數(shù)為界，將患者分為預(yù)后標(biāo)志基因高表達(dá)者、預(yù)后標(biāo)志基因低表達(dá)者。Kaplan-Meier法比較預(yù)后標(biāo)志基因高、低表達(dá)者的總生存期（OS）、無進(jìn)展生存期（PFI）和疾病特異性生存期（DSS）。利用R軟件“survivalROC”包繪制預(yù)測(cè)患者1、3、5年OS、PFI的受試者工作特征（ROC）曲線，通過曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)效能。

2 結(jié)果

2.1 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因篩選結(jié)果GSE104935基因集中共收集到1 278個(gè)恩雜魯胺耐藥性前列腺癌差異表達(dá)基因，GSE78201基因集中共收集到451個(gè)恩雜魯胺耐藥性前列腺癌差異表達(dá)基因，F(xiàn)errDb數(shù)據(jù)庫共收集到259個(gè)鐵死亡相關(guān)基因；使用Image GP維恩圖取交集后共獲得鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的差異表達(dá)基因31個(gè)，分別為L(zhǎng)AMP2、VEGFA、ACSF2、EGFR、DNAJB6、ZFP69B、GDF15、TUBE1、ARRDC3、SETD1B、NOX1、SLC38A1、ALOX5、ATG3、MAP1LC3A、GABARAPL1、ATG13、BID、EPAS1、PTGS2、GPX2、SLC1A4、XBP1、RGS4、HSD17B11、GABPB1、AKR1C2、AKR1C3、GCLC、MT1G、ACSL3。見OSID碼圖1。

2.2 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因的GO功能與KEGG作用通路分析結(jié)果GO功能分析顯示，鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因主要富集的生物過程為營養(yǎng)水平反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、酸性化學(xué)品反應(yīng)，主要富集的細(xì)胞成分為自噬體膜、次級(jí)溶酶體、自噬體，主要富集的分子功能為類固醇脫氫酶活性、醛醇NADP+1-氧化還原酶、酰CoA連接酶活性、NADP+活性、作用于NADPH的氧化還原酶活性；KEGG作用通路分析顯示，鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因主要富集的作用通路為花生四烯酸代謝、自噬、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、鐵死亡、神經(jīng)變性疾病。見OSID碼圖2。

2.3 鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因篩選結(jié)果單因素Cox回歸分析顯示，LAMP2、NOX1為鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后關(guān)鍵基因（P均＜0.05），見OSID碼圖3；多因素Cox回歸分析顯示，VEGFA、LAMP2為鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后關(guān)鍵基因（P均＜0.05）。見OSID碼圖4。因此，選擇LAMP2為鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因。

2.4 預(yù)后標(biāo)志基因表達(dá)及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值分析結(jié)果TCGA-PRAD隊(duì)列中LAMP2在前列腺癌組織中相對(duì)表達(dá)量低于正常組織（P＜0.05）。LAMP2低表達(dá)者OS、PFI均低于高表達(dá)者（P均＜0.05），DSS與高表達(dá)者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見OSID碼圖5。ROC曲線結(jié)果顯示，LAMP2預(yù)測(cè)前列腺癌患者1、3、5年OS的AUC分別為0.825、0.747、0.770，預(yù)測(cè)前列腺癌患者1、3、5年P(guān)FI的AUC分別為0.539、0.601、0.568。見OSID碼圖6。

3 討論

目前，多西他賽和恩雜魯胺是前列腺癌的一線治療手段，但40%～50%的前列腺癌患者對(duì)多西他賽的反應(yīng)沒有顯示出實(shí)質(zhì)性和持續(xù)的前列腺特異抗原下降，中位反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為6～9個(gè)月［5］；而恩雜魯胺盡管延遲了前列腺癌進(jìn)展，但僅維持患者4～6個(gè)月的總生存期［2］。因此，本研究通過全面的生物信息學(xué)分析，識(shí)別鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌形成的潛在基因，預(yù)測(cè)治療靶點(diǎn)、生物標(biāo)志物，以期為CRPC治療提供新的思路和見解。

本研究結(jié)果顯示，LAMP2為鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志基因。LAMP2是溶酶體膜的主要蛋白組分，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其中含有生物合成后細(xì)胞內(nèi)靶向所必需的信息。研究發(fā)現(xiàn)，LAMP2及其剪接變體LAMP2A、LAMP2B、LAMP2C亞型均顯示出組織特異性表達(dá)［6］。本研究通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于PFI，LAMP2預(yù)測(cè)前列腺癌患者1、3、5年OS具有更高的效率，其AUC分別為0.825、0.747、0.770。由于前列腺癌的腫瘤特性，患者多因非腫瘤原因死亡，因此LAMP2預(yù)測(cè)前列腺癌疾病特異生存期DSS無統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床意義。

HAHM等［7］研究顯示，蘿卜硫素可通過激活LAMP2 RNAi和促凋亡蛋白Bax來抑制前列腺癌細(xì)胞的死亡。另有研究表明，LAMP2能夠降低胞質(zhì)半胱氨酸的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞中谷胱甘肽降低、線粒體脂質(zhì)過氧化，從而使細(xì)胞抗氧化能力下降產(chǎn)生氧化應(yīng)激，通過鐵死亡機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［8］。這提示LAMP2能夠通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)鐵死亡相關(guān)機(jī)制導(dǎo)致前列腺腫瘤細(xì)胞死亡。然而，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌不同病理階段，LAMP2的表達(dá)存在一定差異。MORELL等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺腫瘤細(xì)胞中LAMP2表達(dá)上調(diào)，敲低LAMP2后可顯著阻斷細(xì)胞自噬，阻止神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺腫瘤細(xì)胞分化，降低腫瘤細(xì)胞存活率，提示LAMP2的高表達(dá)能促進(jìn)前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化。上述研究給我們帶來了新的思考：是否LAMP2的表達(dá)水平可影響前列腺癌由腺癌或低分化癌向神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化？但這需要大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)提供更多依據(jù)。

鐵在內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病條件中起到了決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵作用，細(xì)胞內(nèi)的游離鐵具有劇毒，是鐵死亡的顯著特征。溶酶體作為鐵穩(wěn)態(tài)維持的樞紐，整合來自不同亞細(xì)胞位點(diǎn)的代謝和細(xì)胞死亡信號(hào)，已成為控制鐵相關(guān)代謝途徑的信號(hào)中樞［10］。鐵死亡由脂質(zhì)過氧化物的過度產(chǎn)生導(dǎo)致的膜完整性受到破壞而引發(fā)，改變鐵代謝、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)或脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生均可誘導(dǎo)鐵死亡［11］，這提示氧化應(yīng)激與鐵死亡調(diào)控機(jī)制有密切相關(guān)性，其均是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵步驟［12］。本研究中鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因的GO-KEGG通路富集分析提示其功能多集中在氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬體、溶酶體、鐵死亡和神經(jīng)變性疾病方面。LAMP2本身作為溶酶體膜的主要蛋白組分，是含量最豐富的溶酶體膜蛋白，是新陳代謝、生物發(fā)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的蛋白。這提示LAMP2可能是連接溶酶體—氧化應(yīng)激—鐵死亡的關(guān)鍵基因，其可能在前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展，恩雜魯胺耐藥形成，甚至神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用，但相關(guān)功能與機(jī)制仍需要大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)方法篩選鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌差異表達(dá)基因，并明確了LAMP2這一關(guān)鍵基因具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值，可作為潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。然而LAMP2在鐵死亡相關(guān)恩雜魯胺耐藥前列腺癌中分子作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。