正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化黃芪甲苷提取工藝研究

童 丹

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000）

黃芪是經(jīng)典的多效中藥[1]，藥用歷史久遠(yuǎn)，除用于治療人體疾病之外，還大量用于獸醫(yī)臨床中。如黃芪、淫羊藿、 紅花合劑能有效提升公雞的腔上囊重量，促進(jìn)腔上囊發(fā)育。 黃芪作為抗病毒藥物，常用于治療動(dòng)物病毒性感冒，可提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。 黃芪作為補(bǔ)氣藥材，可提高細(xì)胞質(zhì)及血液中皮質(zhì)酮濃度，減弱動(dòng)物機(jī)體對(duì)各種不良應(yīng)激的敏感性，減少各種應(yīng)激性綜合征發(fā)生率，從而有效降低病死率。 黃芪已被列入國家衛(wèi)健委117 種“藥食同源”植物，并作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用。黃芪及黃芪提取物作為新型中草藥飼料添加劑，可促進(jìn)動(dòng)物生長、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、提高機(jī)體抵抗力、降低料肉比、提高動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量。 黃芪甲苷作為黃芪的主要藥理活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫抗氧化、抗菌消炎、抗應(yīng)激及促生長等作用[2]，還能提高機(jī)體新陳代謝、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理活性[3]。 《中國藥典》（2015 年版）規(guī)定黃芪甲苷含量是黃芪質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。以黃芪甲苷提取量為衡量指標(biāo)，采用醇提法，通過四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化黃芪甲苷提取工藝[4][5-7]，確定黃芪甲苷最佳提取工藝參數(shù)，為黃芪甲苷提取及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃芪藥材產(chǎn)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西校區(qū)藥材種植試驗(yàn)園。

1.2 試劑

黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)CJ0101QA14。 其余試劑均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備

UV-2600 紫外-可見分光光度計(jì)： 日本島津公司；Million-QB 超純水機(jī)：Million 公司；CXP-100 高速多功能粉碎機(jī)： 上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司；SB-5200DT 超聲波清洗機(jī)： 寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)HH-4 型顯恒溫水浴鍋：上海高興儀器設(shè)備有限公司；BT224S 電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）；DZF-6050-T 智能真空干燥箱： 上海丙林電子科技有限公司；DZF-6090 真空冷凍干燥器： 上海中友儀器設(shè)備有限公司；TGL-20B-C 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黃芪甲苷供試液制備黃芪洗干凈，曬干，切段，粉碎，再用孔徑40 目的篩子過篩，通風(fēng)干燥保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱量已處理好的黃芪粉末4.0 g， 用一定濃度的乙醇溶液作為提取溶劑，在數(shù)顯恒溫水浴鍋中回流提取，趁熱過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇蒸出，即得糖漿狀樣品。然后，用甲醇定容至50 mL，得到黃芪甲苷供試液。

1.4.2 甲苷對(duì)照品溶液制備準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的黃芪甲苷對(duì)照品適量，用80 %甲醇溶解，配制成濃度為0.32 mg/mL 的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

1.4.3 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別準(zhǔn)確吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL 配制好的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，置于6 只10 mL 具塞比色管中；向6 只具塞比色管加入0.2 mL5%香草醛-冰醋酸， 再分別加入0.8 mL 高氯酸溶液，輕微振蕩混勻，置 70 ℃水浴15 min 后取出，置于冰浴中；分別向樣品中緩慢加入5 mL 純冰醋酸溶液，取出，搖勻，至室溫，再用80%乙醇定容至刻度。

以相應(yīng)試劑為空白，利用紫外-可見分光光度法測(cè)定樣品溶液的吸光度值，測(cè)定波長為578 nm；以溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，得到線性回歸方程為：

相關(guān)系數(shù)r=0.999 2， 黃芪甲苷工作曲線的線性范圍為1.6～25.6 μg/mL，線性回歸方程在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

測(cè)定黃芪甲苷提取液含量的方法類同。

1.4.4 黃芪甲苷含量的測(cè)定取一定量已制備好的黃芪甲苷供試液，按照“1.4.3”方法測(cè)定黃芪甲苷含量。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取一定量的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，測(cè)定其黃芪甲苷得率。 測(cè)定6 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 值。 經(jīng)測(cè)定，RSD 值為 2.5%，這表明 6 次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合要求，該儀器精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批等量的6 份黃芪樣品進(jìn)行黃芪甲苷的提取，測(cè)定其黃芪甲苷得率，計(jì)算6 次得率的RSD 值。經(jīng)測(cè)定，RSD 值為2.2%，這表明本試驗(yàn)采用的測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取黃芪甲苷供試品溶液， 分別在制備0，2，4，8，10 h 后進(jìn)行黃芪甲苷含量測(cè)定， 計(jì)算其RSD 值。經(jīng)測(cè)定，RSD 值為0.78%，這表明本次測(cè)定的結(jié)果符合要求，黃芪甲苷溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的黃芪粉末1.0 g 共18 份，每組 3 份， 分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，加入其中，測(cè)定其黃芪甲苷得率。 經(jīng)測(cè)定計(jì)算， 得到回收率94.7%，RSD 值1.4%。

2.5 正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)黃芪甲苷提取工藝

采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)黃芪甲苷提取工藝，選取對(duì)黃芪甲苷提取效率影響較大的料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為主要影響因素，以黃芪甲苷提取量為考察指標(biāo)，采用醇提法提取黃芪甲苷，采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。 通過對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高提取率的關(guān)鍵工藝參數(shù)組合。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test factor levels

表2 正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test range analysis

由表2 正交試驗(yàn)極差分析得知，在選定的試驗(yàn)范圍內(nèi)， 影響黃芪甲苷提取量的因素順序?yàn)椋築＞C＞D＞A，即乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，其影響最顯著的是乙醇濃度。綜合考慮影響黃芪甲苷提取量的因素水平，選取的最優(yōu)參數(shù)組合為A1B3C3D3，即最佳的提取條件為：乙醇濃度90%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間120 min，料液比1∶16。按此條件在正交表的9次試驗(yàn)中第3 個(gè)試驗(yàn)出現(xiàn)，測(cè)定結(jié)果得到黃芪甲苷的提取量為96.89 mg/4.0 g。

3 結(jié)語

通過方法學(xué)驗(yàn)證及正交試驗(yàn)，對(duì)料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4 個(gè)關(guān)鍵提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化， 得出黃芪藥材中黃芪甲苷的提取工藝參數(shù)為：料液比1∶16，乙醇濃度90%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間120 min，黃芪甲苷提取量為96.89 mg/4.0 g。 該提取工藝方法合理，可為黃芪中黃芪甲苷的提取和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考和技術(shù)支持。