復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨生長(zhǎng)、免疫及腸道微生物區(qū)系的影響

海思嬈，陳佳雯，馬 立，汪 洋，王 正，金 鑫，吳 倩，賀衛(wèi)華，馮士彬，王希春*

復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨生長(zhǎng)、免疫及腸道微生物區(qū)系的影響

海思嬈1，陳佳雯1，馬 立1，汪 洋1，王 正1，金 鑫1，吳 倩1，賀衛(wèi)華2，馮士彬1，王希春1*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

為了研究復(fù)方中藥制劑對(duì)天府麻鴨的生長(zhǎng)性能、免疫機(jī)能、抗氧化能力和腸道微生物區(qū)系的影響，選取120只1日齡天府麻鴨隨機(jī)分成4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只，預(yù)飼7 d。試驗(yàn)Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧，在對(duì)照組基礎(chǔ)上分別加入0.5%（Ⅱ組）、1%（Ⅲ組）和1.5%（Ⅳ組）的復(fù)方中藥制劑，試驗(yàn)期20 d。各試驗(yàn)組分別于0 、10 和20 d取樣，分別測(cè)定天府麻鴨的生長(zhǎng)性能、免疫性能力、血清氧化與抗氧化指數(shù)及其腸道菌群的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Ⅲ、Ⅳ組的平均體增重和平均日增重極顯著增加(< 0.01)，料重比極顯著降低(< 0.01)，各組間平均日采食量差異不顯著(> 0.05)；Ⅲ、Ⅳ組胸腺指數(shù)，Ⅳ組脾臟指數(shù)，Ⅲ組C3含量，Ⅱ組IgA濃度和Ⅳ組IFN-γ濃度均有改善(< 0.05)，Ⅳ組C3、C4含量，Ⅲ、Ⅳ組IgA、IgM含量，Ⅳ組IgG含量和Ⅲ、Ⅳ組IL-4含量極顯著增加(< 0.01)；試驗(yàn)Ⅲ組SOD活性與Ⅳ組T-AOC活性均明顯增加(< 0.05)，Ⅲ、Ⅳ組GSH-Px活性極顯著升高(< 0.01)，Ⅲ組MDA含量顯著降低(< 0.05)，Ⅳ組MDA含量極顯著降低(< 0.01)；Ⅱ組盲腸內(nèi)細(xì)菌豐富度下降(< 0.05)，Ⅲ、Ⅳ組微生物多樣性極顯著降低(< 0.01)，其中包括了變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度逐漸下降，擬桿菌門的相對(duì)豐度上升，擬桿菌屬、丁醋絲膜菌屬和巴恩斯氏菌屬的相對(duì)豐度逐漸上升，另枝菌屬和嗜膽菌屬的相對(duì)豐度則逐漸減少。試驗(yàn)表明，復(fù)方中草藥制劑能夠促進(jìn)天府麻鴨的生長(zhǎng)，提高免疫機(jī)能和抗氧化性能，并改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

天府麻鴨；復(fù)方中草藥制劑；生長(zhǎng)性能；免疫功能；抗氧化性能；腸道菌群

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)出194號(hào)通知，從2020年7月1日開始，全國(guó)飼料產(chǎn)品中將全面禁止添加抗生素[1]。如今畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展主流是綠色無抗養(yǎng)殖，在此環(huán)境背景下，養(yǎng)殖業(yè)中控制獸藥殘留的呼吁聲音漸響，而中草藥制劑與抗生素相比，是一種成本低、副作用小、疾病預(yù)防效果更好，并且逐漸有取代抗生素趨勢(shì)的新型綠色飼料添加劑[2]。復(fù)方中草藥制劑是指在中醫(yī)的理論基礎(chǔ)上，以充足的中草藥資源為原料，用一定的工藝加工制成的一類飼料添加劑[3]。復(fù)方中草藥制劑也是一類能夠提高畜禽生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力、改善腸道內(nèi)環(huán)境的新型飼料添加劑[4]。復(fù)方中草藥制劑，因?yàn)榫哂性系募兲烊恍院蛯?duì)畜禽毒副作用較少，不易形成耐藥性以及在動(dòng)物身上的殘留藥品量極少等優(yōu)點(diǎn)，已顯現(xiàn)出了很大的應(yīng)用發(fā)展?jié)摿Γ⑹艿绞澜绲膹V泛關(guān)注[5]。因此，復(fù)方中草藥制劑在畜禽動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)上有著廣闊的前景。已有研究表明，飼料中添加適量由黃芪、黃連等組成的中草藥制劑能夠降低淋巴細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力[6]。研究發(fā)現(xiàn)，黨參等中藥在機(jī)體免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的重要因素，可顯著提高抗病性[7]。中草藥制劑在養(yǎng)殖業(yè)中的運(yùn)用還不成熟。由于中草藥來源不同且缺乏毒性及安全研究，也沒有一致的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和配方標(biāo)準(zhǔn)等問題，且同種中草藥制劑對(duì)不同種類動(dòng)物的作用效果也不一致，因此對(duì)中草藥制劑作出確切的效果評(píng)價(jià)和質(zhì)量檢測(cè)是有一定難度的。本試驗(yàn)擬在天府麻鴨基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)方中草藥制劑（黨參、黃芪、大青葉和板藍(lán)根等），探究該復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨生長(zhǎng)性能、免疫功能和腸道菌群的影響，以期為復(fù)方中草藥制劑在肉鴨健康養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1日齡健康且體重相近的天府麻鴨120只，購(gòu)于合肥市明航養(yǎng)殖有限公司；黨參、黃芪、大青葉和板藍(lán)根等13味中草藥飲片，購(gòu)于合肥市國(guó)緣大藥房，研磨粉碎后按比例混合制備成復(fù)方中草藥制劑。主藥為黨參、黃芪、大青葉和板藍(lán)根，輔藥為甘草、茯苓、白術(shù)、女貞子、苦參、當(dāng)歸、白芍、山楂和麥芽；鴨IgA、IgG、IgM檢測(cè)試劑盒、鴨C3、C4補(bǔ)體檢測(cè)試劑盒、鴨IL-2、IL-4、IL-6檢測(cè)試劑盒、鴨IFN-γ檢測(cè)試劑盒、鴨SIgA檢測(cè)試劑盒、鴨T-AOC檢測(cè)試劑盒、鴨SOD檢測(cè)試劑盒、鴨GSH-Px檢測(cè)試劑盒、鴨MDA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Illumina公司；Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀，購(gòu)于澳大利亞帝肯TECAN公司；LEGEND MICRO 21R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)于美國(guó)Thermo儀器設(shè)備有限公司；NovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)，購(gòu)于美國(guó)Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與管理 采取厚墊料地面平養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，試驗(yàn)前對(duì)場(chǎng)地進(jìn)行全面消毒，在場(chǎng)地內(nèi)安裝保溫?zé)?，注意通風(fēng)、濕度和自然光照，為天府麻鴨提供適宜的生存條件。把120只天府麻鴨隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每組30只，每次在處理組內(nèi)設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只天府麻鴨。在試驗(yàn)前預(yù)飼喂7 d，試驗(yàn)期后為20 d。試驗(yàn)Ⅰ組為對(duì)照組，均飼喂基礎(chǔ)日糧，但試驗(yàn)中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別加入了0.5%、1.0%和1.5%的復(fù)方中藥制劑，具體分組情況如表1所示。

每組放置兩個(gè)料桶和兩個(gè)飲水壺，每天飼喂兩次，自由采食飲水，4組的基礎(chǔ)飼料相同，基礎(chǔ)飼料由淮南遠(yuǎn)大飼料有限責(zé)任公司提供，其基本成分和營(yíng)養(yǎng)水平如表2所示，符合肉鴨飼料標(biāo)準(zhǔn)。

表1 試驗(yàn)分組

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

* 預(yù)混料可為平均每千克飼料提供了以下的飲食: VA 8 000 IU，VD 3 000 IU，VE 25 IU，VK 4 mg，VB 12.5 mg，F(xiàn)e 30 mg，Cu 10 mg，I 0.4 mg，Se 0.30 mg，抗氧化劑 100 mg。代謝能為計(jì)算值, 其余為實(shí)測(cè)值。

1.2.2 樣品的采集 在試驗(yàn)組第0、第10和第20 天，從每個(gè)試驗(yàn)組中抽取5個(gè)重復(fù)，在每個(gè)重復(fù)里選擇一只空腹的天府麻鴨，在頸靜脈處采樣血液，在常溫下靜置1 h后以3 000 r·min-1的速度離心10 min，再把分離出來的新鮮血清收集在離心管中，做好標(biāo)記后將其放入–20 ℃冰箱保存。

于試驗(yàn)第20 天，每個(gè)試驗(yàn)組分別抽取5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)抽取1只空腹的天府麻鴨，用電子秤稱完活體重量后剖殺，立即取下鴨腹腔內(nèi)胸腺、脾臟和法氏囊稱重。取3 cm左右的十二指腸、空腸和回腸，用生理鹽水沖洗干凈后再用玻璃片刮下腸道黏膜收集于凍存管中并做好標(biāo)記。采集2 mL盲腸內(nèi)容物于凍存管中并做好標(biāo)記。先于液氮中保存采集到的樣品，后轉(zhuǎn)到–80℃冰箱里存放。

1.2.3 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)第0、第10和第20 天上午對(duì)每組空腹的天府麻鴨進(jìn)行稱重并記錄。對(duì)每天每個(gè)試驗(yàn)組的給料量、余料量和死淘只數(shù)進(jìn)行記錄，計(jì)算試驗(yàn)第0 天的平均體重以及試驗(yàn)0～10 d、10～20 d的平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.2.4 免疫器官指數(shù)的測(cè)定 胸腺指數(shù)（g·kg-1）=胸腺重量（g）/鴨空腹活體重量（kg）

脾臟指數(shù)（g·kg-1）=脾臟重量（g）/鴨空腹活體重量（kg）

法氏囊指數(shù)（g·kg-1）=法氏囊重量（g）/鴨空腹活體重量（kg）

1.2.5 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測(cè)天府麻鴨血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、補(bǔ)體C3、C4、白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）以及γ干擾素（IFN-γ）的含量。

1.2.6 腸道黏膜免疫指標(biāo)的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測(cè)天府麻鴨十二指腸、空腸和回腸這3段腸道的腸道黏膜中分泌型免疫球蛋A（SIgA）、白介素2（IL-2）、γ干擾素（IFN-γ）的含量。

1.2.7 血清氧化及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測(cè)天府麻鴨血清中總抗氧化能力（T-AOC）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.2.8 腸道高通量測(cè)序 基因組DNA采用CTAB方法提取，稀釋后作為模板，PCR擴(kuò)增和測(cè)序16SrRNA基因的V3-V4高變區(qū)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行混樣和純化，由北京諾禾致源公司完成文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序。對(duì)有用物種數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類，采用Wilcoxon rank-sum Test進(jìn)行不同組間Alpha多樣性比較。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理先通過使用Excel軟件進(jìn)行初步的數(shù)據(jù)匯總與試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，然后通過使用SPSS Statistics 26軟件對(duì)已統(tǒng)計(jì)好的各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)值處理進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 天府麻鴨生長(zhǎng)性能指標(biāo)

由表3可知，第0 天時(shí)4組之間平均體重的差異不顯著（> 0.05）。第10 天時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組之間的平均體重有增加的趨勢(shì)，試驗(yàn)Ⅳ組平均體重與試驗(yàn)Ⅰ組相比極顯著增長(zhǎng)（< 0.01)。第20 天時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅳ組平均體重與試驗(yàn)Ⅰ組相比極顯著上升（< 0.01）。在0～10 d，和對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的平均日采食量和平均日增重差異不顯著（> 0.05）；試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組料重比與對(duì)照組相比無顯著差異（> 0.05），試驗(yàn)Ⅳ組料重比極顯著高于對(duì)照組（<0.01）。在10～20 d，4組間平均日采食量無顯著差異（> 0.05）；試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組平均日增重極顯著增加（< 0.01）；試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅳ組料重比相比對(duì)照組極顯著降低（< 0.01）。

表3 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨生長(zhǎng)性能指標(biāo)的影響

注：同一行比較，上標(biāo)字母相同或不標(biāo)者表示差異不顯著（>0.05），小寫字母不同者表示差異顯著（＜0.05），大寫字母不同者表示差異極顯著（＜0.01）。下同。

表4 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨免疫器官指數(shù)的影響

表5 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨血清中補(bǔ)體C3、C4含量的影響

表6 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨血清中免疫球蛋白含量的影響

2.2 天府麻鴨免疫器官指數(shù)

由表4可知，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組的胸腺指數(shù)與對(duì)照組相比顯著升高（< 0.05）；試驗(yàn)Ⅳ組的脾臟指數(shù)與對(duì)照組相比顯著升高（< 0.05）；4個(gè)試驗(yàn)處理組的法氏囊指數(shù)差異不顯著（> 0.05）。

2.3 天府麻鴨血清免疫指標(biāo)

2.3.1 補(bǔ)體C3、C4含量 由表5可知，在第0 天，4組間C3、C4含量差異不顯著（>0.05）。在第10 天，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組C3、C4含量與對(duì)照組相比有升高趨勢(shì)，其中試驗(yàn)Ⅳ組C3、C4含量極顯著升高（< 0.01）。在第20 天，試驗(yàn)Ⅲ組的C3含量顯著升高 （< 0.05），試驗(yàn)Ⅳ組的C3極顯著升高（< 0.01），試驗(yàn)Ⅳ組的C4含量極顯著升高（< 0.01）。

2.3.2 免疫球蛋白含量 由表6可知，在試驗(yàn)第0 天，4組間IgA、IgG和IgM含量差異不顯著（> 0.05）。在試驗(yàn)第10 天，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組的IgA含量極顯著升高（< 0.01），試驗(yàn)Ⅳ組的IgG含量顯著升高（< 0.05），試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組的IgM含量極顯著升高（< 0.01）。在試驗(yàn)第20 天，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組的IgA含量顯著升高（< 0.05），試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組IgA、IgM含量和試驗(yàn)Ⅳ組的IgG含量都極顯著升高（< 0.01）。

表7 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨血清中細(xì)胞因子含量的影響

表8 復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨血清氧化及抗氧化指標(biāo)的影響

2.3.3 細(xì)胞因子含量 由表7可知，在第0 天，4組間IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量無顯著性差異（> 0.05）。在第10天，與對(duì)照組相比，IL-2、IL-6呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，試驗(yàn)Ⅲ組IL-4含量顯著增長(zhǎng) （＜0.05），試驗(yàn)Ⅳ組IL-4含量極顯著增長(zhǎng)（＜0.01），試驗(yàn)Ⅳ組IFN-γ含量顯著增長(zhǎng)（＜0.05）。在第20 天，與對(duì)照組相比，IL-2、IL-6呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組IL-4含量極顯著增長(zhǎng)（＜0.01），試驗(yàn)Ⅳ組IFN-γ含量顯著增長(zhǎng)（＜0.05）。

2.4 天府麻鴨血清氧化及抗氧化指標(biāo)

由表8可知，在第0 天，4組間T-AOC活性、SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量差異不顯著（>0.05）。在第10 天，試驗(yàn)Ⅲ組T-AOC、SOD活性顯著升高（0.05），試驗(yàn)Ⅳ組T-AOC、SOD活性極顯著升高（0.01），試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組GSH-Px活性極顯著升高（0.01），試驗(yàn)Ⅳ組MDA含量極顯著降低（0.01）。在第20 天，試驗(yàn)Ⅳ組T-AOC活性顯著升高（0.05），試驗(yàn)Ⅲ組SOD活性顯著升高（0.05），試驗(yàn)Ⅳ組SOD活性極顯著升高 （0.01），試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組GSH-Px活性極顯著升高（0.01），試驗(yàn)Ⅲ組MDA含量顯著降低（0.05），試驗(yàn)Ⅳ組MDA含量極顯著減少（0.01）。

圖1 稀釋曲線

Figure 1 Dilution curve

圖2 OTU venn圖

Figure 2 OTU venn diagram

2.5 天府麻鴨盲腸微生物區(qū)系檢測(cè)

2.5.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù) 稀釋曲線是任意從樣本中抽選出一定測(cè)序量的數(shù)據(jù)，計(jì)算它們所代表的物種數(shù)目（即OTUs數(shù)目），用根據(jù)提取的測(cè)序數(shù)據(jù)和相應(yīng)物種數(shù)形成的曲線。稀釋曲線可以對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性直接體現(xiàn)，對(duì)樣品中物種的豐富度間接表明，當(dāng)曲線趨近平緩時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量逐漸合理化，更多的數(shù)據(jù)只代表出現(xiàn)少量的新物種（OTUs）。由圖1可知，observed species指數(shù)的稀釋曲線均趨向平坦，說明測(cè)序數(shù)量充足。圖2表明，測(cè)序數(shù)據(jù)一共檢測(cè)2 149個(gè)OTUs，其中試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅳ組各有1 645、1 022、1 705和1 273個(gè)OTUs，共有784個(gè)OTUs是共有的。

2.5.2 天府麻鴨盲腸菌群組成 天府麻鴨盲腸腸道菌群在門水平上共鑒定出19個(gè)門，圖3展示了豐度最高10個(gè)菌門，其中厚壁菌門（）、擬桿菌門（）的豐度較高，這些微生物占據(jù)了盲腸微生物的 91.89%以上，是天府麻鴨腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。天府麻鴨盲腸腸道菌群在屬水平上共鑒定出235個(gè)屬，圖4展示了相對(duì)豐度最高 10個(gè)菌屬，相對(duì)豐度在前五位的菌屬為擬桿菌屬（）、丁醋球菌屬（）、巴恩斯氏菌屬（）、另枝菌屬（）、副桿菌屬（），相對(duì)豐度分別為 21.70%、8.70%、8.00%、6.60%和 5.00%。

圖3 門分類水平上各樣品菌群物種分類

Figure 3 Species classification of each sample flora at phylum level

圖4 屬分類水平上各樣品菌群物種分類

Figure 4 Species classification of each sample flora at the genus level

2.5.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性分析是對(duì)單個(gè)樣品中的物種進(jìn)行的多樣性分析。微生物群落的物種豐富度可以由Observed species指數(shù)、chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表明，指數(shù)與樣品中物種豐富度呈正相關(guān)。微生物群落中物種的多樣性可由Shannon指數(shù)反映，指數(shù)與群落中物種多樣性呈正相關(guān)。由表9可知，試驗(yàn)Ⅰ組的微生物群落豐富度顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組的微生物群落多樣性極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅳ組（＜0.01）。

2.5.4 在門水平上的物種豐度差異 各試驗(yàn)組天府麻鴨盲腸菌群共鑒定出19個(gè)門，其中擬桿菌門（）、厚壁菌門（）、放線菌門（）和變形菌門（）的豐度較高，占據(jù)了盲腸微生物的98%以上。由表10可知，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組變形菌門、厚壁菌門、放線菌門的相對(duì)豐度相比對(duì)照組降低，擬桿菌門呈現(xiàn)上漲趨勢(shì)，其中試驗(yàn)Ⅱ、Ⅳ組變形菌門豐度顯著降低（＜0.05），試驗(yàn)Ⅱ組厚壁菌門的豐度顯著降低（＜0.05），試驗(yàn)Ⅲ組放線菌門的豐度極顯著降低（＜0.01），試驗(yàn)Ⅳ組擬桿菌門的豐度顯著升高（＜0.05）。

表9 Alpha多樣性分析

表10 門水平盲腸菌群豐度比較

圖5 屬水平物種組成統(tǒng)計(jì)熱圖

Figure 5 Heatmap of intestinal microflora at the genus level

2.5.5 在屬水平上的物種豐度差 為了進(jìn)一步研究復(fù)方中草藥制劑對(duì)天府麻鴨盲腸腸道菌群多樣性的影響，本試驗(yàn)更深入的研究了盲腸菌群在屬分類水平上的組成與變化情況。在屬分類水平上，經(jīng)過樣本的篩選及序列比對(duì)共得到235個(gè)菌屬，共有35個(gè)菌屬的相對(duì)豐度超過 0.01%，這35個(gè)菌屬在4組天府麻鴨盲腸菌群中分別占 74.91%、84.12%、73.55%和79.88%。擬桿菌屬（）是4組天府麻鴨腸道菌群中豐度最高的菌屬，隨著添加劑量的增加，復(fù)方中草藥制劑組擬桿菌屬的豐度從18.69%上升至32.81%。丁醋球菌屬（）是4組天府麻鴨盲腸菌群中豐度第二的菌屬，添加復(fù)方中草藥制劑后，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組天府麻鴨盲腸菌群丁醋球菌屬相對(duì)豐度分別上升至 10.48%、7.93%和 9.92%。巴恩斯氏菌屬（）是天府麻鴨盲腸菌群中豐度第3的菌屬，復(fù)方中草藥制劑組的巴恩斯氏菌屬豐度相對(duì)于對(duì)照組均上升。隨著復(fù)方中草藥制劑劑量的增加，另枝菌屬（）、嗜膽菌屬（）的相對(duì)豐度逐漸降低（圖5）。

3 討論與結(jié)論

大多動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在中草藥里存在，如蛋白質(zhì)、糖類、維生素、脂肪以及微量元素等。截至目前已經(jīng)有相當(dāng)多的研究證實(shí)了中草藥制劑對(duì)生長(zhǎng)性能具有改善和提升的作用，所以說，復(fù)方中草藥飼料制劑是非常具有潛力的非抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑[8]。在飼料中添加復(fù)方中草藥制劑中不僅可以促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的消化還可以豐富飼糧中的營(yíng)養(yǎng)成分，從而可以加強(qiáng)動(dòng)物自身的營(yíng)養(yǎng)，對(duì)畜禽的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[9]。本試驗(yàn)日糧中加入復(fù)方中草藥制劑后顯著提高了天府麻鴨的平均體重及日均增重，并降低了料重比，這與劉硯涵等[10]研究結(jié)果相似。

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽非常重要的免疫器官，可通過這些器官的指數(shù)判斷家禽的免疫功能好壞。有研究證明，免疫器官重量影響免疫功能[11]。彭彥淳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加靈芝液體發(fā)酵物可顯著提高肉雞的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，對(duì)法氏囊指數(shù)無明顯影響。在本試驗(yàn)中，復(fù)方中草藥制劑可以提升天府麻鴨的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究大體相一致，但這4組的法氏囊指數(shù)無顯著差異，可能是因?yàn)榉ㄊ夏译S著天府麻鴨的長(zhǎng)大在逐步退化，以致于作用表現(xiàn)不顯著。補(bǔ)體是存在于血清且具有酶活性的一類球蛋白，它還是免疫功能的一種非特異性輔助要素，不但可以協(xié)助抗體溶解細(xì)胞和殺滅病菌，而且還有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用[13]。補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4在血清中的占比要高于其他補(bǔ)體分子的含量，并且它們?cè)谘a(bǔ)體系統(tǒng)的多種功能中有著無可取代的作用地位，在動(dòng)物免疫功能中有著重要的生物學(xué)意義。姜衛(wèi)星等[14]試驗(yàn)結(jié)果表明，育肥豬血清中補(bǔ)體C3、C4的含量會(huì)隨著在豬飼糧中添加中草藥制劑量的增多而增長(zhǎng)。張健等[15]試驗(yàn)結(jié)果說明飼料中添加復(fù)方中草藥可使云南武定雛雞血清中補(bǔ)體C3、C4含量顯著增高。本試驗(yàn)表明，復(fù)方中草藥制劑有明顯提升天府麻鴨血清中補(bǔ)體C3以及C4含量的趨勢(shì)，且以添加1.5%復(fù)方中草藥制劑效果最佳。

免疫球蛋白是指可以特異性結(jié)合并識(shí)別入侵病原體，介導(dǎo)補(bǔ)體激活和免疫調(diào)節(jié)，并在抵御病原體入侵，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，激活補(bǔ)體，中和毒素和殺滅腫瘤細(xì)胞等多方面表現(xiàn)作用的一類球蛋白，是反映畜禽機(jī)體免疫情況的關(guān)鍵指標(biāo)，主要包含IgA、IgG和IgM[16]。林秋敏等[17]試驗(yàn)結(jié)果顯示飼料中添加復(fù)方中草藥在一定程度上可提高血清中IgM、IgG含量。武洪志等[18]試驗(yàn)結(jié)果表明添加發(fā)酵復(fù)方中草藥的仔豬血清中IgA、IgG和IgM水平顯著增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中草藥制劑組天府麻鴨血清中IgA、IgG、IgM含量均表現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且含量隨著復(fù)方中草藥制劑劑量的增加而上升，此現(xiàn)象的原因可能是復(fù)方中草藥制劑中含有大量的氨基酸物質(zhì)，為效應(yīng)B淋巴細(xì)胞創(chuàng)造更好的條件，使其產(chǎn)生免疫球蛋白，推動(dòng)抗體的形成，從而使動(dòng)物機(jī)體的免疫力增強(qiáng)。

細(xì)胞因子是活化的細(xì)胞所合成分泌的一類小分子蛋白質(zhì)，其功能主要是調(diào)節(jié)和改善免疫表達(dá)過程。Katayama等[19]研究表明，在豬飼糧中添加海藻和甘草，能提升豬血清中細(xì)胞因子IL-2的含量，從而改善豬的免疫性能。王婭等[20]研究表明，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)方中藥制劑能提升仔豬血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌量。在本試驗(yàn)中，復(fù)方中草藥制劑組天府麻鴨血清中IL-4和IFN-γ的含量和對(duì)照組相比有了明顯提升。隨著飼喂復(fù)方中草藥制劑時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)方中草藥制劑組天府麻鴨血清中IL-2和IL-6含量上升趨勢(shì)愈加明顯，但和對(duì)照組間無顯著性差異，這可能有兩方面原因，其一可能是試驗(yàn)周期短暫，所以復(fù)方中草藥制劑組天府麻鴨血清中IL-2和IL-6含量和對(duì)照組相比暫時(shí)不表現(xiàn)出顯著性差異；其二，如果天府麻鴨血清中IL-2和IL-6的含量過高，可能代表著機(jī)體內(nèi)有炎癥，所以IL-2和IL-6含量表現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但數(shù)值不會(huì)過高。

T-AOC、SOD和GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)非常關(guān)鍵的抗氧化酶，這3個(gè)抗氧化酶的協(xié)同作用可以很大程度地消除動(dòng)物機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，讓細(xì)胞能維持正常的生物活性，從而保證動(dòng)物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡，降低外界因素對(duì)動(dòng)物機(jī)體的損害。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)MDA的含量可以間接反映出過氧化損傷的強(qiáng)度，畜禽體內(nèi)MDA水平越高則表示對(duì)畜禽機(jī)體細(xì)胞的損傷越大。呂慧源等[21]發(fā)現(xiàn)，在肉雞的日糧中添加復(fù)方中草藥制劑能使肉雞血清中CAT含量升高并伴隨著MDA濃度降低，從而提高肉雞機(jī)體的抗氧化性能。Bai等[22]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加1%的復(fù)方中草藥制劑可升高豬血清中GSH-Px活性并降低MDA含量，使應(yīng)激豬應(yīng)激時(shí)的抗氧化能力得到提高。在本試驗(yàn)中，隨著飼喂復(fù)方中草藥制劑時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)方中草藥制劑組T-AOC、SOD以及GSH-Px活性均上升且MDA含量也表現(xiàn)下降的趨勢(shì)，此結(jié)果與上述觀點(diǎn)基本相同。

鴨子的健康、疾病和生產(chǎn)力與其胃腸道微生物區(qū)系密切相關(guān)[23]。事實(shí)上，胃腸道被大量細(xì)菌物種定居，這些細(xì)菌已被證明在飼料消化、免疫調(diào)節(jié)、病原體排除和內(nèi)分泌活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。家禽中胃腸道微生物群的紊亂將導(dǎo)致家禽對(duì)病原體和傳染病的易感性增加，這可能給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重?fù)p失，并可能導(dǎo)致家禽產(chǎn)品受到食源性病原體的污染[25]。在本試驗(yàn)中，復(fù)方中草藥制劑組的微生物群落多樣性要低于對(duì)照組，臨床實(shí)踐證明很多中草藥具有殺菌的作用，所以可能是復(fù)方中草藥制劑發(fā)揮了殺菌作用從而降低了微生物群落多樣性。在門的分類水平上，復(fù)方中草藥制劑組和對(duì)照組相比，擬桿菌門的比例表現(xiàn)為升高的趨勢(shì)，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門的比例表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)。動(dòng)物體內(nèi)酵解碳水化合物主要由擬桿菌門進(jìn)行，部分放線菌門會(huì)引起動(dòng)植物危害，動(dòng)物體重的調(diào)節(jié)與腸道內(nèi)的細(xì)菌有關(guān)，特別是厚壁菌門以及變形菌門中包含許多細(xì)菌種類，其中包括霍亂弧菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌等較多常見的致病菌[26]。在屬的分類水平上，復(fù)方中草藥制劑組和對(duì)照組相比，嗜膽菌屬、另枝菌屬的比例下降，擬桿菌屬的比例上升。因此，復(fù)方中草藥制劑對(duì)有害菌群的生長(zhǎng)繁殖有抑制作用，對(duì)盲腸內(nèi)有益菌群數(shù)量有促進(jìn)增加趨勢(shì)，從而改善天府麻鴨的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

復(fù)方中草藥制劑可以提高天府麻鴨的生長(zhǎng)性能、免疫性能、抗氧化能力，添加1.5%劑量的復(fù)方中草藥制劑效果最為顯著。復(fù)方中草藥制劑還可以抑制天府麻鴨腸道內(nèi)有害菌群的生長(zhǎng)繁殖并促進(jìn)有益菌群的增長(zhǎng)，從而對(duì)天府麻鴨腸道菌群起到積極的調(diào)節(jié)作用。

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Effects of compound Chinese herbal medicine preparation on growth, immunity and intestinal microflora of Tianfu sheldrake

HAI Sirao1, CHEN Jiawen1, MA Li1, WANG Yang1, WANG Zheng1, JIN Xin1, WU Qian1, HE Weihua2, FENG Shibin1, WANG Xichun1

(1. School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300)

In order to explore the effects of compound Chinese herbal medicine preparation on the growth performance, immune function, antioxidant capacity and intestinal microflora of Tianfu sheldrake,120 one-day-old Tianfu sheldrakes were randomly divided into 4 groups with 5 replicates in each group and 6 sheldrakes in each replicate, and preliminary fed for 7 days. Sheldrakes in the control group (group Ⅰ) were fed with a basal diet, and 0.5% (group Ⅱ), 1.0% (group Ⅲ) and 1.5% (group Ⅳ) of compound Chinese herbal medicine preparation were added to the basal diet.The trial was conducted for 20 days. The samples in the experimental groups were collected at 0,10 and 20 days, and the growth performance, immune capacity, serum oxidation, antioxidant indexes and intestinal microflora of Tianfu sheldrake were determined, respectively. The results indicated that compared with the control group, average weight gain(AWG) and average daily gain(ADG) in Ⅲ and Ⅳ groups were significantly increased (< 0.01), while the ratio of feed to gain(F/G) was significantly decreased (<0.01), but there was no significant difference in average daily feed intake (ADFI) among the experimental groups (> 0.05). The thymus index of sheldrakes of group Ⅲ and Ⅳ, spleen index of group Ⅳ, C3 content in group Ⅲ, IgA content in group Ⅱ and IFN-γ content in group Ⅳ were improved (<0.05), the C3 and C4 contents in group Ⅳ, IgA and IgM contents in group Ⅲ and Ⅳ, IgG content in group IV, and IL-4 contents in groups Ⅲ and IV were significantly increased (<0.01); the SOD activity in group Ⅲ and T-AOC activity in group IV were increased (< 0.05), the GSH-Px activities in group Ⅲ and IV were significantly increased (<0.01); the MDA content in group Ⅲ was decreased (< 0.05), and MDA content in group IV was significantly decreased (< 0.01). The bacterial richness in cecum of group Ⅱ was decreased (<0.05), and the microbial diversity of groups Ⅲ and IV significantly was significantly decreased (< 0.01), including the relative abundance of,andwere gradually decreased, while the relative abundance ofwere increased, and the relative abundance of,andwere gradually increased. The relative abundance ofanddecreased gradually. The experiment results showed that compound Chinese herbal medicine preparations can enhance the growth performance of Tianfu sheldrake, increase the immune functionand antioxidant level, and improve the structure of intestinal microbiota.

Tianfu sheldrake; compound Chinese herbal medicine preparation; growth performance; immune function; antioxidant activity; intestinal microbiota

S834.83

A

1672-352X (2022)05-0755-09

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.011

2022-11-14 9:27:27

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20221111.1112.022.html

2021-09-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0501205）資助。

海思嬈，碩士研究生。E-mail：1326290429@qq.com

王希春，博士，教授。E-mail：wangxichun@ahau.edu.cn