基于時(shí)域光聲信號(hào)的譜分析技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

鄭佳欣 田 蕊 劉明晴 昝克華 王藝涵 朱守平

1（西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，西安 710126）

2（西安電子科技大學(xué)分子與神經(jīng)影像教育部工程研究中心，西安 710126）

引言

時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)（spectrum analysis of time-domain photoacoustic signal， TPASA）是一種基于光聲效應(yīng)，對(duì)目標(biāo)生物組織激發(fā)出的與時(shí)間相關(guān)的光聲信號(hào)數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理與分析的檢測(cè)技術(shù)，可用于檢測(cè)和診斷。早在1880年，Bell 在通訊實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用快速脈沖調(diào)制光束照射固體物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生與光束相同頻率的聲波，并將此現(xiàn)象命名為光聲效應(yīng)［1］。由于當(dāng)時(shí)光致超聲的研究面臨著理論和技術(shù)上的挑戰(zhàn)，所以研究進(jìn)展受到限制。20世紀(jì)中后期激光光源的發(fā)展使得光聲技術(shù)得到重新關(guān)注，并在工業(yè)、大氣、環(huán)境、化學(xué)和生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)和臨床分析等方面的應(yīng)用中表現(xiàn)出蓬勃的生命力［2］。雖然光聲技術(shù)在1970年之后已經(jīng)應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但發(fā)展相對(duì)緩慢。直到20 世紀(jì)最后十年，光散射介質(zhì)或生物組織的光聲效應(yīng)被大量驗(yàn)證，光聲技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用才逐漸興起，并逐漸應(yīng)用于臨床病灶診斷中［3］。

時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)是對(duì)經(jīng)熱膨脹產(chǎn)生的聲波信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)超聲信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)反映組織的光吸收能力。原則上，光聲信號(hào)的產(chǎn)生可通過(guò)連續(xù)調(diào)制光激發(fā)和脈沖調(diào)制光激發(fā)兩種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)［4］。樣本受到調(diào)制光激發(fā)后，其部分電子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，由于分子間的無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)，較高能級(jí)的電子發(fā)生碰撞，躍遷至基態(tài)并產(chǎn)生熱輻射。經(jīng)周期性的光激發(fā)使樣本及其周圍介質(zhì)產(chǎn)生周期性熱流，熱脹冷縮引起了樣本晶體的周期性振動(dòng)，產(chǎn)生聲信號(hào)，即光聲信號(hào)［5］。當(dāng)受到的是脈沖光激發(fā)時(shí)，樣本快速絕熱膨脹，產(chǎn)生光聲信號(hào)。生物體成分和尺寸的差異會(huì)導(dǎo)致其光吸收能力的差異，并表現(xiàn)在其產(chǎn)生的光聲信號(hào)中。該信號(hào)被高靈敏超聲探測(cè)器接收，在位置r和時(shí)間t處的聲壓信號(hào)p（r，t）服從波動(dòng)方程［6］：

式中，c是介質(zhì)中的聲速；βp是熱膨脹系數(shù)；cp是流體的比熱容，H（r，t）是熱源函數(shù)。光聲信號(hào)的波動(dòng)方程將吸收熱量、聲速以及壓力波進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。對(duì)光聲信號(hào)進(jìn)行不同變換進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)時(shí)域光聲信號(hào)的譜分析。

現(xiàn)階段對(duì)時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)的研究主要集中于光聲光譜分析、光聲頻域譜分析和“光-頻”聯(lián)合譜分析。

1） 光聲光譜分析反映了不同波長(zhǎng)激發(fā)下生物組織的光吸收能力，即以光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，光聲信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。光聲光譜的強(qiáng)度與特定波長(zhǎng)下組織中各生色團(tuán)對(duì)應(yīng)的吸光能力成正比，因此，光聲光譜分析是一種功能信息檢測(cè)手段。在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，由于病變組織生化特性發(fā)生改變，其組織中生色團(tuán)含量異于正常組織，如腫瘤組織區(qū)域血紅蛋白濃度較高，此時(shí)，光聲光譜分析可用于辨別正常和異常組織的特征吸收譜。

2） 光聲頻域譜分析包括頻譜、功率譜分析，反映了生物組織在特定波長(zhǎng)下與吸收體（生色團(tuán)）尺寸相關(guān)的頻率成分信息，即以頻率為橫坐標(biāo)，各頻率成分強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。從頻域上來(lái)說(shuō)，較大尺寸的光吸收體對(duì)應(yīng)著較窄的頻域譜帶寬，而小尺寸的吸收體對(duì)應(yīng)著更寬的帶寬；光吸收體吸收光的能力越強(qiáng)，其對(duì)應(yīng)的頻域成分強(qiáng)度也就越強(qiáng)。受超聲頻域譜參數(shù)的啟發(fā)，對(duì)光聲頻譜或功率譜進(jìn)行線性擬合，其斜率、截距和中頻帶擬合已被證實(shí)能夠反映被檢測(cè)組織區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能信息。其中，光聲功率譜參數(shù)斜率一般表示高頻分量相對(duì)于低頻分量的大小，斜率值越大表示高頻分量的幅度越大，這取決于吸收體的結(jié)構(gòu)尺寸；截距和中頻擬合分別表示信號(hào)功率譜的零頻率和平均幅度，取決于吸收體的光學(xué)吸收系數(shù)［7］。目前，深度／機(jī)器學(xué)習(xí)及統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法常用于對(duì)頻域譜參數(shù)進(jìn)行分析，通過(guò)比較參數(shù)差異從而區(qū)分正常和異常組織［8-9］。

3） “光-頻”聯(lián)合譜分析，指將各激發(fā)波長(zhǎng)下的光聲頻域譜按波長(zhǎng)順序排列，即光聲信號(hào)譜在聲頻域和光波長(zhǎng)兩個(gè)維度展開。“光-頻”聯(lián)合譜因其可以同時(shí)監(jiān)測(cè)生物組織中多種分子成分的相對(duì)含量及相應(yīng)結(jié)構(gòu)的不均勻性或混合度，也被稱為物理化學(xué)譜［9］。結(jié)合以上光聲信號(hào)譜提供的不同結(jié)構(gòu)或功能信息，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中，可根據(jù)待測(cè)組織樣本的特性選擇一種或多種譜進(jìn)行分析，完成對(duì)生理、病理信息的在體、離體監(jiān)測(cè)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期篩查和診斷。

時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)有效地結(jié)合了光學(xué)模態(tài)高對(duì)比度以及超聲模態(tài)在深層組織中具有高分辨率的雙重優(yōu)勢(shì)，能夠提供生物組織結(jié)構(gòu)和功能層面的信息。相較于傳統(tǒng)光譜檢測(cè)，時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)在獲取光學(xué)吸收結(jié)構(gòu)信息的同時(shí)，不易受限于被測(cè)對(duì)象的形狀和形態(tài)，因而對(duì)生物體的組織、體液和呼出氣體的檢測(cè)都適用，普適性極強(qiáng)；再者，該技術(shù)不易受組織對(duì)光散射的影響，能夠?qū)ι顚咏M織、體液進(jìn)行分析，通過(guò)利用光聲信號(hào)中各測(cè)量值及其頻譜分量與組織深度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可有效地屏蔽上層組織的影響，直接提取深層組織的信息；此外，該技術(shù)檢測(cè)靈敏度高［10］，在生化成分檢測(cè)尤其是血糖、血氧檢測(cè)中優(yōu)勢(shì)明顯。

與光聲成像相比，利用傳統(tǒng)光聲成像得到的組織體光能吸收密度，并結(jié)合光子輸運(yùn)模型，定量光聲成像可定量地重建深層組織光學(xué)吸收系數(shù)分布［11-12］，進(jìn)一步結(jié)合多波長(zhǎng)測(cè)量、成像以及光譜解混重建算法，獲得與組織生理病理相關(guān)的成像區(qū)域內(nèi)各生色團(tuán)濃度分布情況，但二者均需引入圖像重建操作。時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)強(qiáng)調(diào)對(duì)測(cè)量得到的組織激發(fā)出的光聲信號(hào)直接分析，從而得到吸收體結(jié)構(gòu)和吸收光譜響應(yīng)等定量信息，其無(wú)需經(jīng)過(guò)圖像重建，因此操作簡(jiǎn)單。同時(shí)，該技術(shù)還具有無(wú)損檢測(cè)、樣品用量少、便于在體長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)。因此，時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)作為一種極具價(jià)值的早期疾病診斷工具，在生理、病理學(xué)研究以及診斷方面存在巨大潛力。目前，該技術(shù)已在皮膚鱗癌、骨質(zhì)疏松、血糖檢測(cè)和氨氣-腎功能檢測(cè)等領(lǐng)域取得一定成果［9，13-15］。

為實(shí)現(xiàn)上述應(yīng)用，基于時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)正不斷得到完善。目前，市面上該系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)原理相近，但系統(tǒng)結(jié)構(gòu)各異，定型機(jī)較少，其設(shè)備結(jié)構(gòu)主要分為三部分：激發(fā)光源、光聲池和光聲信號(hào)放大與記錄系統(tǒng)［16］。激發(fā)光源一般可分為普通光源和激光光源兩類。近年來(lái)隨著激光器快速發(fā)展，激光光源在光聲實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。常采用的激光器可分為脈沖激光器和連續(xù)激光器（見圖1）［17］：脈沖激光器因其產(chǎn)生的脈沖激光峰值功率較大，在對(duì)生物體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可在允許輻射范圍內(nèi)穿透更厚組織，如納秒級(jí)的調(diào)Q 脈沖激光器；采用連續(xù)激光器作為光聲信號(hào)激發(fā)源時(shí)，一般需對(duì)激發(fā)光強(qiáng)進(jìn)行調(diào)制，相較于脈沖激光器，其最主要的優(yōu)勢(shì)是價(jià)格便宜。為保證光聲效應(yīng)的熱膨脹過(guò)程是近似的絕熱過(guò)程，調(diào)制周期的時(shí)長(zhǎng)應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)小于組織通過(guò)熱傳導(dǎo)散熱的時(shí)間，即使脈沖激光器的一個(gè)脈沖信號(hào)等同于連續(xù)波激光器的一個(gè)調(diào)制周期信號(hào)［18］。兩類激光器都有其各自的優(yōu)勢(shì)，在不同應(yīng)用場(chǎng)景下的選擇不同，如在組織、體液方面的研究多采用脈沖激光器，而在氣體方面的研究多采用連續(xù)調(diào)制激光器。本文介紹的部分基于連續(xù)調(diào)制激光器的應(yīng)用僅采用其幅值信息。光聲池被用于盛放樣本和安置傳感器，需達(dá)到最大化樣本聲信號(hào)和最小化噪聲及干擾信號(hào)［19］，目前常見的光聲池分為開放式和封閉式兩種。開放式光聲池不必頻繁拆卸和重新組裝，使用方便；封閉式光聲池則為了避免開口引起的聲輻射損失［20］，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。光聲信號(hào)放大與記錄系統(tǒng)通過(guò)傳感器接收樣品產(chǎn)生的聲信號(hào)，再通過(guò)前置放大電路進(jìn)行處理以提高信噪比。由于各類型的傳感器適用性不同，在光聲實(shí)驗(yàn)中需要根據(jù)具體檢測(cè)任務(wù)、樣本類型和所用激發(fā)光源的情況選擇不同性能參數(shù)的聲信號(hào)檢測(cè)器［21］。

圖1 脈沖激光與連續(xù)激光光聲檢測(cè)原理圖［17］Fig.1 Principle diagrams of pulsed laser and continuous laser photoacoustic detection［17］

基于上述對(duì)時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)原理、方法、優(yōu)勢(shì)及系統(tǒng)的分析，文中以該技術(shù)在生物組織檢測(cè)、體液檢測(cè)及呼出氣體檢測(cè)三個(gè)維度中的應(yīng)用為主線，圍繞各研究采用的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或不同的信號(hào)處理方法，綜述了該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展與發(fā)展方向。

1 在生物組織中的應(yīng)用研究

生物組織組分與結(jié)構(gòu)的差異會(huì)引起其光吸收能力的變化（見圖2）［22］。病變組織與正常組織相比，其多種分子成分（如黑色素、血紅蛋白、脂質(zhì)、膠原等）的相對(duì)含量及組織相應(yīng)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定的變化。而光聲光譜的強(qiáng)度與特定波長(zhǎng)下組織中相應(yīng)成分的光吸收能力成正比，且光聲頻域譜中不同頻率成分的相對(duì)能量反映組織的不均勻性或混亂度，高頻成分越多，組織結(jié)構(gòu)越不均勻或混亂［9］?；诖耍ㄟ^(guò)測(cè)定組織病變前后的時(shí)域光聲信號(hào)譜變化，有效提取其理化特征改變，為疾病診斷提供有價(jià)值的信息。近年來(lái)，時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物皮膚、肌肉、臟器等軟組織和骨骼、牙齒等硬組織的研究［9，15，23-24］。

圖2 生物組織中不同分子在不同波長(zhǎng)下的光吸收系數(shù)［22］Fig.2 Optical absorption coefficient of some molecules in biological tissue［22］

在對(duì)生物軟組織時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)的研究中，王學(xué)鼎等［25］在國(guó)際上較早開發(fā)了針對(duì)單波長(zhǎng)光聲信號(hào)的光聲量化組織顯微結(jié)構(gòu)的方法，即“光聲頻域譜分析”?；诖耍鯇W(xué)鼎等［26］在532 和1 200 nm 兩個(gè)波長(zhǎng)下對(duì)小鼠模型進(jìn)行體外和原位實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了功率譜參數(shù)與小鼠肝組織微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1 200 nm 處，脂肪肝和正常肝的功率譜斜率之間存在多達(dá)5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的差異，而在532 nm 處，差異大約為2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；原位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂肪肝比正常肝在1 200 nm 處具有更高的功率譜參數(shù)，包括斜率、截距和中頻帶擬合，而在532 nm 處，與正常肝臟相比，脂肪肝的斜率值較高，截距和中頻帶擬合值較低。實(shí)驗(yàn)表明光聲頻域譜分析在肝組織微結(jié)構(gòu)鑒定領(lǐng)域應(yīng)用的可行性。近年來(lái)，王學(xué)鼎等［27］把研究拓展到多波長(zhǎng)光聲信號(hào)分析中，將光聲信號(hào)在光波長(zhǎng)和聲頻域兩個(gè)維度展開，定義了光聲物理化學(xué)譜。通過(guò)對(duì)脂肪肝和纖維化肝的動(dòng)物模型進(jìn)行光聲物理化學(xué)譜分析并與病理結(jié)果對(duì)照，可明顯區(qū)分正常肝、脂肪肝和纖維化肝等3 種模型。文龍等［9］對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma， cSCC）組織和正常組織進(jìn)行了多光譜光聲物理化學(xué)譜分析驗(yàn)證（見圖3），發(fā)現(xiàn)在1 370 nm 膠原的特征波長(zhǎng)下，人體cSCC 的光聲聲功率譜擬合斜率高于正常組織（P＝0.001），而截距低于正常組織（P＝0.007），這與cSCC 侵犯真皮膠原，致使腫瘤內(nèi)膠原排列紊亂、含量減少有關(guān)；在1 400 nm 脂質(zhì)特征波長(zhǎng)下，其斜率高于正常組織（P＜0.001），截距低于正常組織（P＝0.011），這與對(duì)應(yīng)的尼羅紅脂質(zhì)染色顯示結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明皮膚鱗狀細(xì)胞癌離體組織的光聲物理化學(xué)譜中各組分特征吸收波長(zhǎng)下聲功率譜特征參數(shù)變化能反映的腫瘤組分及含量變化與病理結(jié)果相符，這為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的臨床無(wú)創(chuàng)診斷提供了一種新思路。光聲物理化學(xué)譜分析在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在著巨大應(yīng)用潛力，其對(duì)生物樣本組織微結(jié)構(gòu)檢測(cè)的可行性和有效性已被大量證實(shí)［28］，利用深度學(xué)習(xí)手段進(jìn)行良惡性判別正成為當(dāng)今熱點(diǎn)。目前，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的前列腺癌識(shí)別方法已被驗(yàn)證，程茜等［29］通過(guò)引入有監(jiān)督線性判別分析（LDA）和二次判別分析（QDA）算法，對(duì)光聲物理化學(xué)譜進(jìn)行降維和參數(shù)特征提取，實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺癌的診斷，其中，LDA 準(zhǔn)確率為76.3%，QDA 準(zhǔn)確率可達(dá)81.7%?，F(xiàn)階段，活體在體研究也成為該領(lǐng)域的主流方向。

圖3 人體正常皮膚及cSCC 光聲物理化學(xué)譜［9］Fig.3 Photoacoustic physio-chemical spectra of human normal skin and cSCC［9］

周篪聲等［23］利用自主設(shè)計(jì)的雙光束光聲光譜裝置，在380 ～780 nm 的光譜范圍內(nèi)測(cè)量了人體4個(gè)部位（胃、子宮、肺和乳腺）的癌變組織與正常組織的光聲光譜，通過(guò)吸收光譜的幅值信息，發(fā)現(xiàn)這4種癌變組織在630 nm 附近都有吸收峰出現(xiàn)，而正常組織均無(wú)此峰，這為癌癥診斷治療提供了重要信息。為了減少生物組織內(nèi)光散射和聲衰減的影響并獲得深層組織光聲信號(hào)，程茜等［30］提出了一種間質(zhì)性光聲光譜分析方法，即通過(guò)將光纖擴(kuò)散器和小孔徑針狀水聽器結(jié)合，利用細(xì)針式光聲探頭在深層組織中進(jìn)行光聲光譜信號(hào)采集及分析，并利用自主研制的探針式樣機(jī)定量檢測(cè)了脂質(zhì)浸潤(rùn)的肝細(xì)胞濃度（見圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 220 nm處，脂肪肝樣本產(chǎn)生的光聲信號(hào)具有更大總光譜強(qiáng)度，且正常肝和脂肪肝樣本的功率譜斜率具有顯著差異（P＜1×10-7）（見圖5）。這種細(xì)針探頭促進(jìn)的“活體活組織檢查”方法可以與常規(guī)組織離體活檢實(shí)現(xiàn)大幅度互補(bǔ)，具有較大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。脂肪細(xì)胞的大小與肥胖人群的代謝性疾病直接相關(guān)，馬翔等［31］通過(guò)全連接層的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合功率譜與脂肪細(xì)胞平均大小的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)分析手段相比，該方法的平均相對(duì)誤差改善了12.84%，驗(yàn)證了深度學(xué)習(xí)分析光聲頻域譜的有效性，這為生物組織的定量和非侵入性評(píng)估提供一種新的方法。

圖4 探針式樣機(jī)檢測(cè)示意圖［30］。（a）探針式樣機(jī)模型；（b）小鼠離體組織中正常和脂肪肝組織的間質(zhì)光聲信號(hào)測(cè)量Fig.4 Schematic diagram of probe-type prototype detection［30］. （a）Probe-type prototype model； （b）Measurements of interstitial photoacoustic signals in normal and fatty liver tissues of mouse in vitro

圖5 探針式樣機(jī)定量檢測(cè)結(jié)果分析［30］。（a）正常肝臟和脂肪肝組織產(chǎn)生光聲信號(hào)的功率譜；（b）1 200 nm 下12 個(gè)正常和脂肪肝組織樣本的總光譜強(qiáng)度大?。唬╟）1 200 nm 下12 個(gè)正常和脂肪肝組織樣本的功率譜斜率大小Fig.5 Analysis of the quantitative detection results of the probe-type prototype［30］. （a） The power spectrum of photoacoustic signals produced by normal liver and fatty liver tissues； （b）The total spectral intensity of 12 normal and 12 fatty liver tissue samples at 1 200 nm； （c）Slope size of 12 normal and 12 fatty liver tissue samples at 1 200 nm

在對(duì)生物硬組織時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)的研究中，封婷等［15］利用光聲在測(cè)量鈣化和非鈣化組織中都有足夠穿透力的特性，分別對(duì)來(lái)自骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增強(qiáng)和正常骨質(zhì)的骨樣本光聲功率譜進(jìn)行線性擬合得其功率譜參數(shù)斜率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在685 nm波長(zhǎng)下，與其它兩組相比，骨質(zhì)疏松組的骨樣本具有更大的斜率，即骨小梁厚度更薄的骨樣本具有更高的斜率（見圖6）。這為描述骨小梁的微結(jié)構(gòu)以及區(qū)分疏松骨質(zhì)與正常骨質(zhì)提供了重要依據(jù)。同時(shí)，該研究還提出了一種結(jié)合全連接多層深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的光聲光譜分析方法，用以半量化不同程度骨質(zhì)疏松癥的骨礦物質(zhì)密度值，具有潛在的臨床篩查價(jià)值［32］。此外，封婷等［33］還通過(guò)分析在680 ～950 nm光譜范圍內(nèi)骨骼中所有光吸收成分的光聲光譜，來(lái)定量評(píng)估各種化學(xué)成分的相對(duì)含量，這種基于光聲光譜分析的骨評(píng)估方法，在骨質(zhì)疏松癥和其他骨骼疾病的診斷和臨床治療中有顯著意義。袁振等［34］應(yīng)用成像引導(dǎo)的光聲光譜技術(shù)對(duì)人手指骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與正常關(guān)節(jié)相比，患骨關(guān)節(jié)炎的手指氧飽和度下降，但含水量增多，這為關(guān)節(jié)炎的早期診斷提供了新途徑。除了對(duì)骨質(zhì)研究，李江華等［24］還應(yīng)用光學(xué)相干層析成像技術(shù)對(duì)齲齒進(jìn)行研究，首次將該技術(shù)用于齲齒的早期診斷，對(duì)得到的牙釉質(zhì)在光學(xué)、力學(xué)和聲學(xué)方面的信息，判斷牙齒的病變情況，證實(shí)該技術(shù)用于齲齒早期診斷的可行性。

圖6 大鼠股骨樣本的光聲功率譜分析結(jié)果［15］。（a）用系統(tǒng)響應(yīng)校正后的三組不同樣本（OVX 骨質(zhì)疏松組，SHAM 正常對(duì)照組，OVX＋ZOL 骨質(zhì)增強(qiáng)組）的光聲信號(hào)功率譜；（b）三組不同骨質(zhì)的量化光聲譜參數(shù)“斜率”Fig.6 PASA of rat femur bone specimens［15］. （a）Examples of power spectral density （PSD） of the RF PA signal of three groups （OVX， Sham， OVX＋ZOL） after calibration by removing the system response； （b） The quantified spectral parameter slope of the three groups of bones

2 在生物體液中的應(yīng)用研究

生物體液包括細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液，對(duì)保持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持血壓、控制免疫等方面具有重要作用，其中細(xì)胞外液包括血液和組織間液，如細(xì)胞間液、尿液、胃液等。生物體液對(duì)光學(xué)信號(hào)具有強(qiáng)散射性，難以直接用傳統(tǒng)吸收光譜進(jìn)行分析，而時(shí)域光聲信號(hào)譜分析能夠大幅度避免體液對(duì)光散射的影響，能夠得到體液中各成分物質(zhì)的吸收特性和熱學(xué)特性等信息，可以方便了解人體代謝過(guò)程的變化，用于疾病檢測(cè)。

血液成分非常復(fù)雜，主要包括血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞）、其他有形成分和血漿。封婷等［35］首次采用一種全光學(xué)的光聲光譜分析系統(tǒng)（見圖7），對(duì)健康紅細(xì)胞和老化紅細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，該系統(tǒng)使用聚苯乙烯微環(huán)諧振器［36］作為超聲波檢測(cè)器，將寬帶的光聲信號(hào)測(cè)試范圍從組織水平擴(kuò)展到細(xì)胞水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)微米級(jí)的血細(xì)胞靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)首先對(duì)不同尺寸的微球進(jìn)行信號(hào)分析，通過(guò)線性回歸，繪制出平均功率譜密度曲線并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明了從3～45 μm 的物體尺寸的功率譜曲線下降速率存在顯著性差異，并以此為基礎(chǔ)，分別對(duì)離體的新鮮和老化血細(xì)胞進(jìn)行分析，通過(guò)在2 ～123 MHz 范圍內(nèi)進(jìn)行功率譜的線性回歸擬合，獲得了兩組量化的譜參數(shù)斜率（見圖8）。結(jié)果顯示，由于形態(tài)不同，相比新鮮紅細(xì)胞樣品，老化紅細(xì)胞樣品的斜率降低有顯著性差異（P＜0.05）。該實(shí)驗(yàn)表明光聲功率譜分析方法用于辨別不同形態(tài)紅細(xì)胞具有可行性，說(shuō)明光聲功率譜分析可提供成像方法不能獲得的定量判別信息，可用于臨床中細(xì)胞形態(tài)的快速分析，如診斷某些能改變紅細(xì)胞形態(tài)特征，由此損害其功能的疾病，或判斷血細(xì)胞是否感染或接觸有毒化學(xué)物質(zhì)造成形態(tài)改變。同時(shí)，該研究提出了對(duì)其他具有特征生色團(tuán)的細(xì)胞成分也可以用光聲光譜技術(shù)在適當(dāng)?shù)墓獠ㄩL(zhǎng)下激發(fā)、檢測(cè)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)定量信息并用于診斷的可能，如黑色素瘤細(xì)胞的檢測(cè)。郭萍等［37］利用光聲光譜技術(shù)對(duì)不同類型白血病患者血液和正常人血液進(jìn)行檢測(cè)，得到被檢測(cè)對(duì)象的光吸收譜，發(fā)現(xiàn)在350、423、552、586 nm 波長(zhǎng)附近，正常人全血的光聲光譜有4 個(gè)特征吸收峰，急性粒細(xì)胞白血病患者全血的光聲光譜圖也有相同的4個(gè)特征吸收峰，但吸收強(qiáng)度比正常人全血的光聲光譜明顯減弱，而急性單核細(xì)胞白血病患者、慢性粒細(xì)胞白血病急性變期患者全血的光聲光譜則只在423 nm 處出現(xiàn)吸收峰，其他峰基本消失，且后者光譜強(qiáng)度也明顯減弱。因此，利用全血光聲光譜圖分析、診斷并區(qū)分不同類型白血病具有很好可行性和的臨床參考價(jià)值，有望作為白血病早期篩查的一種有效手段。但由于白血病患者類型復(fù)雜多變，其光聲光譜圖的分類也會(huì)隨之有多種變化，因此還需要不斷完善對(duì)白血病患者的血液成分分析。

圖7 全光學(xué)光聲光譜分析系統(tǒng)［35］Fig.7 All-optical photoacoustic spectroscopy system［35］

圖8 離體人類血液標(biāo)本的光聲光譜分析［35］。（a）模擬兩組血樣的光聲光譜參數(shù)斜率；（b）實(shí)驗(yàn)中兩組樣本的光譜參數(shù)斜率Fig.8 PASA of human blood samples in vitro［35］.（a）Slopes of photoacoustic spectral parameters of the two groups of blood samples in the simulation；（b）The slope of spectral parameters of the two groups of samples in the experiment

在血糖檢測(cè)方面，糖尿病作為繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后危及人類生存質(zhì)量的第三大殺手，目前醫(yī)學(xué)手段還無(wú)法對(duì)其徹底根治，因此日常地、及時(shí)地、無(wú)創(chuàng)地血糖檢測(cè)在社會(huì)上有極大需求［38］。光聲光譜檢測(cè)法作為一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)感染的檢測(cè)手段已成為血糖檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。1993年，Mackenzie等［39］最先把光聲光譜技術(shù)用于離體血糖檢測(cè)的研究，得出光聲信號(hào)的峰值與葡萄糖濃度可近似為一種線性關(guān)系。至今，在體血糖濃度光聲光譜檢測(cè)仍面臨許多難題：血糖在血液中含量很低；光聲信號(hào)本身容易受到激勵(lì)光源和液體溫度變化影響等?；诠饴暪庾V技術(shù)的血糖檢測(cè)需要找到一種穩(wěn)定性好、可靠性高的檢測(cè)和分析方法來(lái)滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的需求。文獻(xiàn)［40-41］首次報(bào)道了以量子級(jí)聯(lián)激光器為中紅外輻射源的光聲光譜裝置進(jìn)行血糖檢測(cè)的結(jié)果，其實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體和糖尿病患者的口服葡萄糖耐量測(cè)試期間，指腹的光聲測(cè)量結(jié)果與酶血液測(cè)試的結(jié)果高度一致（見圖9），驗(yàn)證了光聲光譜法進(jìn)行無(wú)創(chuàng)血糖檢測(cè)的可行性。呂鵬飛等［14］提出通過(guò)溫度誤差補(bǔ)償和差動(dòng)型光聲池結(jié)合的方法進(jìn)行無(wú)創(chuàng)血糖檢測(cè)，抑制了溫度的干擾，最終得到了光聲信號(hào)強(qiáng)度隨葡萄糖濃度增加而增大的線性測(cè)量結(jié)果，為光聲光譜進(jìn)行體外無(wú)創(chuàng)血糖檢測(cè)問(wèn)題提供一種新思路。改善激光器的性能、尋找合適的分析方法是利用光聲光譜技術(shù)進(jìn)行體外血糖檢測(cè)的發(fā)展方向。

圖9 血糖光聲光譜檢測(cè)［41］。（a）光聲裝置示意圖；（b）對(duì)志愿者拇指上的光聲檢測(cè)無(wú)創(chuàng)測(cè)量得到的皮膚血糖濃度曲線與參考血糖濃度曲線；（c）無(wú)創(chuàng)測(cè)量的一致誤差網(wǎng)格Fig.9 Photoacoustic Spectrogram of Blood Glucose［41］. （ a ） Schematic drawing of the photoacoustic setup； （ b ） Skin blood glucose concentration curve obtained by non-invasive measurement of photoacoustic detection on volunteers' thumbs and reference blood glucose concentration curve； （ c） Consensus error grid representation of the non-invasive measurements

此外，光聲信號(hào)的譜分析技術(shù)也在人體尿液的檢測(cè)中得以應(yīng)用。尿液中的某些蛋白質(zhì)、酮、腈、膽紅素或激素的異常存在可作為一些特定情況的警告信號(hào)，具有臨床意義［42］。目前，尿液分析已用于各種醫(yī)學(xué)診斷，包括尿路感染、腎功能、糖尿病、妊娠和水化測(cè)試；同時(shí)，尿液檢測(cè)還可應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)癌癥的檢測(cè)［43］。孫洪偉等［44-45］利用物質(zhì)光吸收能力的差異，對(duì)90 余例病例進(jìn)行光聲光譜檢測(cè)來(lái)分析正常人和腫瘤患者的尿液差異，從吸收光譜中發(fā)現(xiàn)了腫瘤物質(zhì)的特征峰并研究了特征峰和腫瘤惡性程度的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，對(duì)正常人、癌癥患者、患有癌癥并隨后發(fā)炎的患者進(jìn)行研究，并在240 ～420 nm 處獲得特征光吸收峰。將這些結(jié)果與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這與隨后經(jīng)手術(shù)證實(shí)的泌尿系統(tǒng)癌癥的診斷是一致的，證明了光聲光譜技術(shù)應(yīng)用在泌尿系統(tǒng)癌癥檢測(cè)中的可行性。目前與尿液相關(guān)的光聲光譜檢測(cè)的主流還是在分析泌尿系統(tǒng)的相關(guān)疾病，如前列腺癌［46］，對(duì)臨床病狀診斷有重要意義。

3 在生物呼出氣體檢測(cè)中的應(yīng)用研究

人體呼出氣體成分復(fù)雜，除了水、二氧化碳、氧氣等容易檢測(cè)的物質(zhì)，還有豐富的微量氣體可以反應(yīng)人體的生理和病理信息［47］。由于對(duì)呼出氣體檢的測(cè)屬于非侵入方法，易于頻繁采樣，且不易危害對(duì)被檢測(cè)人員。隨著氣體檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，呼出氣體與機(jī)體生理和病理狀態(tài)的關(guān)系已廣受關(guān)注。目前，對(duì)于氣體含量的光聲信號(hào)譜分析更多是關(guān)注信號(hào)幅度信息而非相位信息。由于不同氣體有其特定的吸收光譜，并且受激發(fā)后產(chǎn)生的光聲信號(hào)幅度與其濃度有比例關(guān)系，因此通過(guò)光聲信號(hào)譜分析技術(shù)不僅可以檢測(cè)某種氣體的存在，還可以進(jìn)一步對(duì)其濃度做定量分析。

腎臟是維持機(jī)體蛋白質(zhì)代謝穩(wěn)定的重要器官，基于此，臨床上以蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物血尿素氨作為評(píng)估腎功能的主要指標(biāo)之一［48］。研究發(fā)現(xiàn)，呼出氣體中的氨氣與人體內(nèi)血尿素氨有一定的線性關(guān)系，借助光聲信號(hào)譜檢測(cè)呼出氣體的氨氣含量，可以對(duì)比患者血尿素氨的濃度變化，可用于判斷腎透析治療效果。目前，氣體光聲光譜靈敏性很高，可以檢測(cè)到濃度為萬(wàn)億分之一量級(jí)（part per trillion，ppt）的特定氣體［49］，可用于研究呼出氨氣的變化與腎透析效果間的關(guān)系。梁麗榮等［13］以健康志愿者呼出氨氣的濃度為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比腎病患者透析前0.5 h、透析中1.5 h、透析中2.5 h 以及透析結(jié)束時(shí)呼出氨氣的變化（見圖10），發(fā)現(xiàn)患者透析治療結(jié)束后，呼出氨氣濃度有明顯下降?？紤]到不同患者之間存在較大個(gè)體差異，進(jìn)一步研究不同程度腎衰竭患者在接受透析前后呼出氨氣的濃度變化（見圖11），發(fā)現(xiàn)各患者呼出氨氣濃度均有明顯變化，但下降快慢不同。上述研究為光聲信號(hào)譜分析技術(shù)檢測(cè)氨氣濃度用于腎透析效果評(píng)估以及腎病早期篩查提供了新思路。

圖10 患者呼出氨氣濃度隨透析時(shí)間的變化［13］Fig.10 Breath ammonia concentrations varying with dialysis time［13］

圖11 8 名患者呼出氨氣濃度隨透析時(shí)間的變化［13］Fig.11 Breath ammonia concentrations varying with dialysis time for 8 subjects［13］

放射療法是癌癥治療的重要方法之一，其作用機(jī)理是X 射線與水相互作用，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，破壞細(xì)胞部分遺傳物質(zhì)從而殺死腫瘤細(xì)胞［50］。但自由基的存在會(huì)引起細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的氧化降解，最終產(chǎn)生乙烯。乙烯具有高揮發(fā)性，可迅速擴(kuò)散入血液而不被降解，最終經(jīng)肺部呼出。Popa 等［49］研究了腫瘤患者呼出乙烯氣體含量與X 射線治療效果的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)基于光聲信號(hào)譜對(duì)呼出乙烯氣體的敏感性，檢測(cè)了年齡在32 ～77 歲之間的癌癥患者放射治療前后呼出的乙烯濃度，從圖12 可以看出患者在接受放射治療前后乙烯濃度水平從18 ppbV 升到約23 ppbV，而健康受試者乙烯濃度水平只有12 ppbV 左右。這表明細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，放射治療已經(jīng)發(fā)揮作用。因此，通過(guò)光聲光譜檢測(cè)乙烯濃度，使實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)放射療效成為可能。

圖12 健康志愿者和乳腺癌患者接受X 光治療前后的乙烯水平［49］Fig.12 The level of ethylene for a healthy volunteer and for a patient with mammary cancer before and after X-ray treatment［49］

基于光聲光譜技術(shù)的呼出氣體檢測(cè)方法具備無(wú)損、連續(xù)監(jiān)測(cè)和快速響應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)氣體標(biāo)記物與體內(nèi)代謝活動(dòng)之間的關(guān)系，可以對(duì)疾病治療效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有利于精準(zhǔn)治療。接下來(lái)研究中還需要找到其他合適的氣體標(biāo)記物并結(jié)合光聲光譜，在疾病的早期篩查和治療中發(fā)揮更大的作用。

4 總結(jié)與展望

時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)手段，主要包括光聲光譜分析、光聲頻域譜分析以及“光-頻”聯(lián)合譜分析，用于檢測(cè)由于生物體不同生色團(tuán)光吸收能力的差異而反映出的組織結(jié)構(gòu)和生物功能信息。該技術(shù)以其強(qiáng)普適性、高靈敏度、無(wú)創(chuàng)檢測(cè)且操作便捷等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。在保持生物試樣的自然狀態(tài)下，時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)可安全無(wú)損地對(duì)生物體特定區(qū)域目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，不需引入圖像重建算法且可專注于實(shí)現(xiàn)定量分析，用于對(duì)生物組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性、代謝功能及病理特征等進(jìn)行研究，進(jìn)而識(shí)別正常和異常信號(hào)，用作疾?。ㄈ绨┌Y、糖尿?。┑脑缙诤Y查和臨床診斷，尤其為無(wú)創(chuàng)檢測(cè)提供了高靈敏度的有效工具。

目前，生物組織、體液及呼出氣體的時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)應(yīng)用的可靠性已被廣泛證實(shí)，該技術(shù)在皮膚鱗癌、骨質(zhì)疏松、血糖檢測(cè)和氨氣-腎功能檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用也成果顯著，但該技術(shù)的研究和應(yīng)用尚處于發(fā)展階段，其裝置器件成本是其發(fā)展瓶頸，，如檢測(cè)靈敏度和精度依賴于光聲池中各種器件的性能；大部分光源采用脈沖激光器，體積較為龐大且昂貴。目前，利用光聲頻域譜各參數(shù)判別正常和異常信號(hào)的界限還未形成規(guī)范，光聲物化譜也只是反映了結(jié)構(gòu)的不均勻性，還不能顯示生物組織結(jié)構(gòu)的具體特征，表明該技術(shù)的臨床應(yīng)用尚待深入探索。隨著實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的發(fā)展迭代和譜分析方法的創(chuàng)新，該技術(shù)的測(cè)量精度和準(zhǔn)確度會(huì)不斷提高，如光源技術(shù)的更新，利用LED 產(chǎn)生納秒脈沖激發(fā)可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)小型化并降低成本［51］；檢測(cè)探頭性能的改良可實(shí)現(xiàn)靈敏度的提高及帶寬范圍的拓展，如基于全光學(xué)方法的非接觸式光聲探測(cè)；深度學(xué)習(xí)等信號(hào)分析手段的發(fā)展可優(yōu)化信號(hào)降噪和信號(hào)分析分類的能力；多模態(tài)檢測(cè)相互結(jié)合可提高臨床診斷的準(zhǔn)確率，如光聲／超聲雙模態(tài)檢測(cè)；選擇靶向性強(qiáng)、光聲信號(hào)轉(zhuǎn)換效率高的光聲分子探針可拓展應(yīng)用范圍。時(shí)域光聲信號(hào)譜分析技術(shù)快速發(fā)展和不斷完善，有助于帶來(lái)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)和臨床應(yīng)用的新突破。