抑制黃曲霉毒素的深海環(huán)狀芽胞桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化

徐靜靜 ，閆培生*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海264209)

黃曲霉(Aspergillusflavus)毒素是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重點關(guān)注的霉菌毒素之一，是由黃曲霉及寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在溫度和濕度均適宜的條件下，特別容易污染水稻、小麥、玉米、花生、棉花及其衍生產(chǎn)品[1-6]。黃曲霉毒素分布廣泛，與食品安全息息相關(guān)，它的存在會導(dǎo)致食品的腐敗以及食品質(zhì)量和數(shù)量的嚴(yán)重下降，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[7-9]。黃曲霉毒素具有高毒性、致癌性、致畸性和誘變性，接觸后可導(dǎo)致動物和人類發(fā)生急性、慢性和累積性中毒[10]。因此，黃曲霉毒素的防控迫在眉睫。目前，黃曲霉毒素的防治方法主要有物理、化學(xué)和生物3種[11]。常見的方法是使用合成化學(xué)制劑，然而，化學(xué)藥劑的過度使用往往會導(dǎo)致環(huán)境問題，例如藥物殘留和耐藥型病原菌的出現(xiàn)。與物理和化學(xué)方法相比，生物防治方法能高效地去除毒素且殘留少，對生態(tài)環(huán)境友好，是未來黃曲霉毒素防控的必然趨勢[12]。

海洋的極端環(huán)境賦予海洋微生物獨特的生理結(jié)構(gòu)和代謝特征，從而產(chǎn)生功能各異的活性產(chǎn)物[13]。因此，海洋環(huán)境為新型生物活性化合物的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的平臺[14-19]。五十年以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩萬多種海洋天然產(chǎn)物[15]。截止到2016年底，大約28 500種海洋天然產(chǎn)物被鑒定出來[20]，它們中的許多是來自于大型海洋微生物[21-27]。從海洋微生物中分離出來的天然產(chǎn)物主要包括聚酮類、多肽類、生物堿類、萜類、脂類、異香豆素類以及其他混合結(jié)構(gòu)化合物[28-29]。目前，從海洋細(xì)菌中分離出來的天然產(chǎn)物有30%表現(xiàn)出抗真菌活性，包括多肽類、抗菌蛋白和酯類[30-31]。

本實驗室從南大西洋深海沉積物中分離出一株環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)，命名為菌株FA13，在先前的研究中，該菌株在ISP2培養(yǎng)基中的發(fā)酵無細(xì)胞上清液可以顯著抑制寄生曲霉突變菌株NFRI-95的菌絲生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生，對其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，菌株FA13發(fā)酵無細(xì)胞上清液20倍稀釋液對菌株NFRI-95菌絲生長抑制率從12.33%提高到100.00%，對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率從61.60%提高到100.00%，并且發(fā)酵產(chǎn)物中的活性物質(zhì)在高溫、高壓、酸堿和酶解作用下，活性依然保持高度穩(wěn)定[11]。本研究中，菌株FA13在培養(yǎng)基M2中發(fā)酵后產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物對寄生曲霉突變菌株NFRI-95也具有一定的抑制活性，由于培養(yǎng)基成分會在很大程度上影響到菌株發(fā)酵產(chǎn)物活性成分的種類及含量，而M2培養(yǎng)基與ISP2培養(yǎng)基的成分差距很大，所以本研究中我們對菌株在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為活性產(chǎn)物的分離純化和應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本實驗所用菌株FA13分離于DY26航次于2012年7—8月期間在南大西洋(13.6°S，14.5°W)深度為3 203 m的位置采集的沉積物樣品，菌株FA13的純菌株保藏于中國海洋微生物菌種保藏中心。

1.2 指示菌株

本實驗所采用的指示菌株是寄生曲霉突變菌株NFRI-95，該菌株是一株不產(chǎn)生黃曲霉毒素但能夠積累黃曲霉毒素合成途徑中的橘紅色中間產(chǎn)物降散盤衣酸(norsolorinic acid)的突變菌株。

1.3 試劑與培養(yǎng)基

吐溫80購自生工生物工程股份有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

M2培養(yǎng)基：乙酸鈉5 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，牛肉膏0.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，蔗糖0.5 g/L，可溶性淀粉0.5 g/L，檸檬酸三鈉0.05 g/L，蘋果酸0.05 g/L，酒石酸鉀鈉0.05 g/L，硝酸銨1 g/L，氯化銨0.2 g/L，天然海水750 mL，去離子水250 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

GY培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，瓊脂15 g/L，陳海水配制，121 ℃滅菌20 min。

1.4 寄生曲霉NFRI-95孢子懸液的制備

在GY培養(yǎng)基上接種寄生曲霉突變菌株NFRI-95，于28 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子后，用含有0.2%(體積分?jǐn)?shù))甘油和0.05%(體積分?jǐn)?shù))吐溫80的水溶液作為孢子洗脫液將孢子洗下，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 發(fā)酵條件均勻設(shè)計方案

在M2培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)上，優(yōu)化有關(guān)發(fā)酵條件的5個因素并利用DPS 9.5軟件進(jìn)行混合水平的均勻設(shè)計，方案如表1所示。

1.6 抑菌抑毒活性測定

將活化培養(yǎng)的菌株FA13接種到M2液體培養(yǎng)基中，按表1中的試驗方案進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，于8 000 r/min離心20 min后收集上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾器進(jìn)行過濾，并添加與GY培養(yǎng)基相同成分的培養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)[32]用tip culture法測試不同發(fā)酵無細(xì)胞上清液的抑菌抑毒活性，計算發(fā)酵液對寄生曲霉突變菌株NFRI-95菌絲生長和黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率(簡稱抑菌率和抑毒率)。

抑制率=[(XCK-X)/XCK]×100%

(1)

式(1)中：X為樣品中的菌絲鮮重(g)或者OD560值，XCK為對照中的菌絲鮮重(g)或者OD560值。

表1 混合水平均勻設(shè)計試驗方案Tab.1 Uniform design scheme of mixing level

1.7 抑菌及抑毒效果回歸擬合分析

使用上述各組合的平均抑制率數(shù)據(jù)，對寄生曲霉突變菌株NFRI-95菌絲生長的抑制率和黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率分別采用二次多項式逐步回歸、多因子及互作項逐步回歸、多因子及平方項逐步回歸、偏最小二乘二次多項式回歸、偏最小二乘(考慮互作項)及偏最小二乘(考慮平方項)這6種方式進(jìn)行擬合分析。并對抑菌率和抑毒率進(jìn)行權(quán)重為1∶1的偏最小二乘二次多項式回歸、偏最小二乘(考慮互作項)及偏最小二乘(考慮平方項)這3種方式的擬合分析。選擇擬合方程顯著的組合。

1.8 優(yōu)化擬合結(jié)果的驗證

取優(yōu)化后方案中對應(yīng)的各組合用tip culture法進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化方案的驗證試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株FA13在M2培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌抑毒活性

將活化培養(yǎng)的菌株FA13接種到液體M2培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后，于8 000 r/min離心20 min后收集上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾器進(jìn)行過濾，并添加與GY培養(yǎng)基等成分的培養(yǎng)物質(zhì)。用tip culture法測試發(fā)酵無細(xì)胞上清液及其10倍稀釋液的抑菌抑毒活性，結(jié)果如圖1和圖2。使用公式(1)計算可知tip culture試驗中的發(fā)酵液原液3個重復(fù)的平均菌絲生長抑制率為58.19%，平均黃曲霉毒素產(chǎn)生抑制率為61.54%。發(fā)酵液原液稀釋10倍后3個重復(fù)的平均菌絲生長抑制率為10.98%，平均黃曲霉毒素產(chǎn)生抑制率為41.43%。

2.2 均勻設(shè)計方案中各個組合的抑菌率和抑毒率

通過tip culture方法測定均勻設(shè)計方案中對應(yīng)的各個組合對菌株NFRI-95的菌絲生長抑制率及對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率，測定結(jié)果及實際觀察對比差異見圖3和表2。

圖1 菌株FA13的培養(yǎng)液對菌株NFRI-95的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain FA13 culture medium on strain NFRI-951～3:菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵液無細(xì)胞上清液平行組；I～I(xiàn)II：M2培養(yǎng)基對照平行組。

圖2 菌株FA13的培養(yǎng)液稀釋10倍后對菌株NFRI-95的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of the 10-time diluted supernatants obtained from strain FA13 culture medium on strain NFRI-951～3:菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵液無細(xì)胞上清液稀釋10倍平行組；I～I(xiàn)II：M2培養(yǎng)基對照平行組。

圖3 均勻設(shè)計各組合的菌株FA13培養(yǎng)液對菌株NFRI-95的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of strain FA13 culture medium in each combination of uniform design on strain NFRI-95

由表2和圖3可知，菌株FA13在多個組合中表現(xiàn)為可以完全抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，在N6組合對應(yīng)的發(fā)酵條件下，對菌絲生長的抑制率最高，能達(dá)到98.11%，這說明菌株FA13在M2培養(yǎng)基中對培養(yǎng)條件具有較好的包容性。結(jié)合表2中的抑制效果可知，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌株FA13不僅表現(xiàn)出隨條件變化而導(dǎo)致抑制活性的大幅度變化，同時表現(xiàn)出了完全或者近乎完全抑制菌株NFRI-95菌絲生長及黃曲霉毒素產(chǎn)生的效果，存在優(yōu)化擬合上的潛力。

表2 均勻設(shè)計各組合的菌株FA13培養(yǎng)液對菌株NFRI-95的抑制效果Tab.2 Inhibitory effect of strain FA13 culture medium in each combination of uniform design on strain NFRI-95

續(xù)表

2.3 菌株FA13在M2培養(yǎng)基中發(fā)酵條件優(yōu)化

對優(yōu)化擬合中方程顯著的組合設(shè)計優(yōu)化驗證方案，取優(yōu)化條件近似值作為各組實際試驗中對應(yīng)的、可達(dá)到的條件。菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵條件優(yōu)化以抑菌率以及抑菌率和抑毒率兩者同時為指標(biāo)的試驗方案較為合理。

2.3.1 以抑菌率為指標(biāo)的優(yōu)化方案 通過對均勻設(shè)計所得結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對寄生曲霉突變菌株NFRI-95的菌絲生長抑制率為目標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，所得具體方案如表3所示。從表中可以看出，通過多因子及平方項進(jìn)行逐步回歸得到的優(yōu)化方案中預(yù)測抑菌率的值最大，優(yōu)化效果最顯著，且該方案中對應(yīng)的培養(yǎng)時間最短，海水體積占比最低，為0.00%，接種量最少，但pH卻最高；相對于其他兩種偏最小二乘的優(yōu)化方案，此方案中的培養(yǎng)溫度居中。

表3 以抑菌率為指標(biāo)的優(yōu)化方案Tab.3 Optimization scheme with mycelial growth inhibition ratio as index

2.3.2 以抑毒率為指標(biāo)的優(yōu)化方案 通過對均勻設(shè)計所得結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率為目標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，所得具體方案如表4所示。由表中可以看出，通過多因子及互作項進(jìn)行逐步回歸與多因子及平方項進(jìn)行逐步回歸得到的預(yù)測抑毒率值相近，前者的海水體積占比、pH和培養(yǎng)時間均高于后者，而培養(yǎng)溫度和接種量均低于后者。

表4 以抑毒率為指標(biāo)的優(yōu)化方案Tab.4 Optimization scheme with aflatoxin inhibition ratio as index

2.3.3 以抑菌率和抑毒率同時為指標(biāo)的優(yōu)化方案 同時以菌株FA13在M2培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對寄生曲霉突變菌株NFRI-95的菌絲生長抑制率和對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率為目標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，方案如表5所示。由表中可以看出，只有偏最小二乘(考慮平方項)的優(yōu)化方法可以同時對抑菌率和抑毒率進(jìn)行優(yōu)化，所得預(yù)測抑菌率和預(yù)測抑毒率非常接近。

2.4 優(yōu)化擬合結(jié)果的驗證

優(yōu)化方案進(jìn)行驗證所得到的抑菌率和抑毒率測定結(jié)果如表6所示，由表6和圖4可知，菌株FA13在6種不同的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的活性物質(zhì)抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的效果都比較好，除了組合PHM的抑毒率為86.34%以外，其他5種發(fā)酵條件下所得發(fā)酵液對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率甚至能達(dá)到100.00%或者接近100.00%，它們分別是以下5種優(yōu)化組合DHR、PPM、DPM、PPMR和DPR，其中包含一組既能完全抑制菌絲生長又能完全抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的組合，即DPM，DPM是以抑菌率為指標(biāo)，通過多因子及平方項逐步回歸得到的優(yōu)化組合。由圖5可知，DPM組合的發(fā)酵液10倍稀釋液的抑菌率為70.57%，抑毒率為100.00%，而原液的預(yù)測抑菌率應(yīng)為155.12%，實際結(jié)果中，符合預(yù)測，未產(chǎn)生菌絲體，可以完全抑制NFRI-95的菌絲生長。在“2.1”中提到優(yōu)化前菌株FA13的發(fā)酵液抑菌率為10.98%，抑毒率為41.43%，優(yōu)化后的抑菌率是優(yōu)化前的6.43倍，優(yōu)化后的抑毒率是優(yōu)化前的2.41倍。因此，優(yōu)化組合DPM所對應(yīng)的發(fā)酵條件為菌株FA13產(chǎn)生抑制寄生曲霉突變菌株NFRI-95的活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件，此時的發(fā)酵溫度為38.70 ℃，接種量為6.00%，海水體積占比為0.00%，培養(yǎng)基的pH為8.71，培養(yǎng)時間為6 d。

表5 以抑菌率和抑毒率同時為指標(biāo)的優(yōu)化方案Tab.5 Optimization scheme with both mycelial growth inhibition ratio and aflatoxin inhibition ratio as indexes

表6 優(yōu)化驗證試驗后抑菌率及抑毒率的測定結(jié)果Tab.6 Mycelial growth inhibition ratio and aflatoxin inhibition ratio in the verification test after optimization

圖4 優(yōu)化后驗證試驗中各組合的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of each combination in verification test after optimization

圖5 優(yōu)化后的組合DPM發(fā)酵液稀釋10倍后的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of the 10-time diluted supernatant from DPM after optimization1～3:優(yōu)化后的組合DPM的發(fā)酵液無細(xì)胞上清液稀釋10倍平行組；I～I(xiàn)II：M2培養(yǎng)基對照平行組。

2.5 討論

海洋總面積占地球表面的71%，海洋環(huán)境的特異性賦予海洋微生物獨特的生理結(jié)構(gòu)和代謝特征，是具有各種生物活性的代謝產(chǎn)物的重要來源[12]。海洋細(xì)菌、放線菌和藻類都具備防治黃曲霉毒素污染的潛力，其中，海洋來源的芽胞桿菌在黃曲霉毒素的生物防治中具有重要的應(yīng)用潛力[11,33]。1945年Johnson首次報道了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分泌的抗菌物質(zhì)[34]，半個多世紀(jì)以來，科研人員已經(jīng)從芽孢桿菌的不同菌株中分離出了100多種活性物質(zhì)，主要分為抗生素、抗菌蛋白和香豆素類三大類[35-38]。在抗生素中，研究最多的是肽類抗生素，它們具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包含特異組成，如右旋氨基酸，多數(shù)肽類抗生素表現(xiàn)出較高的疏水性和剛性[39]。此外，大多數(shù)芽孢桿菌都能分泌抗菌蛋白，主要包括幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，它們通過降解真菌細(xì)胞壁而達(dá)到拮抗效果，迄今已報道的能夠分泌活性物質(zhì)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌有環(huán)狀芽胞桿菌[40]、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)[41]、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)[42]、枯草芽胞桿菌[43]、短芽胞桿菌(Bacillusbrevis)[44]等。β-1，3-葡聚糖酶是植物病程相關(guān)蛋白，通常與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用抑制真菌生長。芽胞桿菌屬(Bacillus)還能產(chǎn)生香豆素類物質(zhì)，目前從芽胞桿菌屬中分離出來的異構(gòu)香豆素類物質(zhì)主要有bacilosarcin A-C、amicoumacin A-C、AI-77-F及l(fā)ipoamicoumacin A-D[38,45-46]。對黃曲霉毒素的防治作用主要通過3種模式來進(jìn)行，抑制真菌菌絲體的生長、抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生和黃曲霉毒素的去除[11]。在本研究中，菌株FA13對寄生曲霉突變菌株NFRI-95的菌絲生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生均表現(xiàn)出一定的抑制作用，為了提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量，增強菌株FA13發(fā)酵液對菌株NFRI-95的抑制活性，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以便建立高效的發(fā)酵工藝，為后期活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析奠定基礎(chǔ)。

本研究采用均勻設(shè)計的方法對菌株FA13進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，以使菌株FA13產(chǎn)生更多的抑制黃曲霉毒素的代謝產(chǎn)物。均勻設(shè)計最早由學(xué)者在1978年提出[47]，均勻設(shè)計多用于工業(yè)中的試驗優(yōu)化設(shè)計，當(dāng)試驗中包含的因子數(shù)以及各因子對應(yīng)的水平數(shù)較多并存在差異時，相較于正交設(shè)計和響應(yīng)面法[48-51]，均勻設(shè)計能通過較少的試驗次數(shù)獲得相對滿意的結(jié)果。進(jìn)行較為復(fù)雜的培養(yǎng)條件優(yōu)化時，多數(shù)研究人員選擇了先通過Plackett-Burman設(shè)計確定各個因子的效應(yīng)，對正效應(yīng)顯著的成分進(jìn)行最陡爬坡試驗，再結(jié)合響應(yīng)面法對部分因子進(jìn)行組合優(yōu)化，從而得出最優(yōu)培養(yǎng)方案[52]。相比之下，均勻設(shè)計在準(zhǔn)確度上雖然缺乏優(yōu)勢，但在時間方面更有優(yōu)勢，且能涵蓋的因子數(shù)、水平數(shù)更多。本研究僅在優(yōu)化組合DPM中所測菌絲生長抑制率與預(yù)測值吻合較好。此外，與原方案中的N6組合相比，優(yōu)化組合DPM雖然提高了培養(yǎng)溫度，但完全不受海水的影響，減少了海水對栽培設(shè)備的腐蝕破壞，延長了設(shè)備的使用壽命。因此，本研究設(shè)計的優(yōu)化組合DPM具有明顯的實用性和可行性。對于本實驗所進(jìn)行的發(fā)酵工藝研究，還有需要進(jìn)一步細(xì)化的地方，后續(xù)試驗中有必要對培養(yǎng)基的成分和配比進(jìn)行深入研究。本研究中采用50 mL三角瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，具有一定的局限性，但為后期的大規(guī)模發(fā)酵提供了重要參考。同時在實驗中發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)成分過于豐富時，對于菌株抑制黃曲霉毒素反而不利，推測可能是由于深海細(xì)菌長期生活于寡營養(yǎng)的環(huán)境中，對其產(chǎn)生了適應(yīng)性，因此營養(yǎng)太豐富反而不利于活性物質(zhì)的生成。

3 結(jié)論

(1)從南大西洋深海沉積物中分離得到環(huán)狀芽胞桿菌菌株FA13，在M2培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，抑菌抑毒活性檢測結(jié)果顯示該菌株的無細(xì)胞上清液對寄生曲霉突變菌株NFRI-95的生長表現(xiàn)出顯著的抑制活性。

(2)以培養(yǎng)基M2的成分為基礎(chǔ)，利用均勻設(shè)計方法對菌株FA13的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后菌株FA13的發(fā)酵產(chǎn)物對寄生曲霉突變菌株NFRI-95的菌絲生長抑制率是優(yōu)化前的6.43倍，對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率是優(yōu)化前的2.41倍。

(3)優(yōu)化后得到的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度38.70 ℃，接種量6.00%，海水體積占比0.00%，培養(yǎng)基pH 8.71，培養(yǎng)時間6 d。