籃狀菌DYM25胞外產(chǎn)物的初步鑒定及其生物學(xué)活性

羅 曼，吳旭東，夏鈺華，何建林，唐 旭，徐長安

(自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

籃狀菌(Talaromyces)是一類重要的真菌，最初是青霉菌的有性型屬，由于其形態(tài)與青霉屬極其相似，長期以來，研究者們都將其當(dāng)作青霉菌來研究，1955年Benjamin提出了一個(gè)有性型的屬名Talaromyces，隨著命名規(guī)則的改變和基因鑒定的發(fā)展，Talaromyces便成為了一個(gè)獨(dú)立的類群[1]，陳杏春等(2018)將其正式翻譯為籃狀菌[2]。到目前為止，全球已報(bào)道的Talaromyces有162種，我國報(bào)道了57種，其中，已報(bào)道的Talaromyces90 %分布在暖溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)[3]。Talaromyces的部分種可產(chǎn)生纖維素酶類，起初對Talaromyces的研究也集中在纖維素酶系統(tǒng)的研究[4-6]，有些種是植物病害的良好生防菌，對病原菌具有較好的抑制作用[7-8]，但是，目前對于Talaromyces的開發(fā)應(yīng)用較少，仍有很多新種或新功能有待發(fā)現(xiàn)。

Talaromyces的次生代謝產(chǎn)物種類豐富多樣，生物活性也各有不同，研究表明，Talaromyces產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物主要包含生物堿、肽、酯、聚酮化合物、醌、類固醇、萜類化合物等[9]。近年來，對Talaromyces次級代謝產(chǎn)物生物學(xué)活性的研究也越來越多，大多數(shù)分離到的Talaromyces都兼具抗菌、抗腫瘤和抗氧化的功效，一株從海洋紅藻中分離得到的內(nèi)生真菌TalaromycesislandicusEN-501，其產(chǎn)生的新型化合物具有一定的抗菌、抗氧化和細(xì)胞毒活性[10]。2016年報(bào)道過Talaromycespurpurogenus的發(fā)酵上清液可作為有效的防控有害藻類的生物試劑[11]。陳俊等(2020)從南極海泥中篩選得到TalaromycesrugulosinSP14的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出了對MRSA有較好抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物[12]，Anand等(2016)還發(fā)現(xiàn)TalaromycesflavusSP5的提取物對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和熱帶念珠菌(Candidatropicalis)都具有很好的抑制活性，同時(shí)還表現(xiàn)出對HepG2腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性[13]。因此，對Talaromyces的胞外產(chǎn)物進(jìn)行生物活性研究，有望發(fā)現(xiàn)良好的生物活性物質(zhì)。

鑒于Talaromyces活性產(chǎn)物的功效多樣性，本研究以雅浦海溝分離得到的Talaromycessp.DYM25作為目標(biāo)菌株，探究其胞外產(chǎn)物的種類及生物活性，研究結(jié)果表明，Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物可用水飽和正丁醇萃取得到，極性較大，生物堿顯色反應(yīng)結(jié)果預(yù)示了胞外產(chǎn)物中生物堿鹽類物質(zhì)的存在，為后續(xù)物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，此胞外產(chǎn)物對木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)有較好的抑制作用，是Talaromyces作為F.equiseti拮抗真菌的首次報(bào)道，該產(chǎn)物還具有一定的抗氧化活性和抑制腫瘤生長的能力，為Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物的開發(fā)利用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、指示菌株、培養(yǎng)基、腫瘤細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)菌株分離自蛟龍?zhí)?50航次于西太平洋雅浦海溝5 136 m處(8°05.853′N,137°52.329′E)采集的海水樣品，結(jié)合形態(tài)學(xué)和18S rDNA、ITS鑒定為Talaromycessp.，編號(hào) DYM25，GeneBank登錄號(hào)為MN511803，在PDA斜面培養(yǎng)基上于4 ℃保存[14]。指示菌株為木賊鐮刀菌，編號(hào)HB-1，由黃瓜枯萎葉片組織貼片培養(yǎng)所得。發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基(BD Difco品牌)，外加20 g/L的葡萄糖、5 g/L的酵母膏和2 g/L的硫酸鎂為補(bǔ)充碳源、氮源和無機(jī)鹽。人胃腺癌細(xì)胞AGS、肝癌細(xì)胞HepG2和胰腺癌細(xì)胞PANC-1均引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：正丁醇、碘化鉀、硅鎢酸、磷鉬酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵水楊酸、過氧化氫、鹽酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碘(西隴科學(xué)股份有限公司)，Tris-HCl、胎牛血清、FBS、多柔比星、Dox(Sigma試劑公司)，完全培養(yǎng)基(蘇州賽業(yè)生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，武漢尚恩生物技術(shù)有限公司)，CCK-8試劑(上海漢恒生物科技有限公司)。

儀器：GR60DF全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)，MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱(上海旻泉儀器有限公司)，SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)，抑菌圈測量儀(杭州迅數(shù)科技有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司)，多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，BIOBASE二氧化碳培養(yǎng)箱(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)。

1.3 Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的提取

將Talaromycessp.DYM25接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d得到種子培養(yǎng)液，將種子液按10 %的比例接種于PDB發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)9 d，發(fā)酵液用200目篩網(wǎng)過濾菌絲體，經(jīng)循環(huán)水式多用真空泵抽濾去除大分子雜質(zhì)，得到澄清發(fā)酵液。等量的澄清發(fā)酵液與等量的水飽和正丁醇反復(fù)萃取4～5次，合并有機(jī)相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干正丁醇(溫度：60 ℃，轉(zhuǎn)速：60 r/min)，收集燒瓶中的萃取物于玻璃平皿中，置于50 ℃烘箱中徹底烘干正丁醇，密封后保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4 Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的檢測

利用生物堿的沉淀顯色反應(yīng)對胞外產(chǎn)物進(jìn)行鑒定：酸性條件下，樣品與3種及3種以上生物堿沉淀劑發(fā)生相應(yīng)的沉淀反應(yīng)，即可預(yù)試生物堿的存在與否。參照《中國藥典》配制碘-碘化鉀試劑、硅鎢酸試劑和磷鉬酸試劑[15]。室溫下，取6 mL 100 mg/mL的菌株DYM25胞外產(chǎn)物水溶液于離心管中，加入2至3滴的磷鉬酸試劑、硅鎢酸試劑和碘-碘化鉀試劑，輕輕震蕩，觀察添加每一種試劑后樣品的顏色變化及離心后是否產(chǎn)生沉淀。酸性條件下，磷鉬酸與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生下鮮黃色或棕黃色沉淀，硅鎢酸試劑與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生灰白色或淡黃色沉淀，碘-碘化鉀試劑與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色或桔紅色沉淀。

1.5 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的抑菌活性研究

無菌條件下，將F.equiseti接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d得到指示菌培養(yǎng)液，按1∶100(體積比，下同)的比例加入到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻傾倒平板，待平板凝固后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至F.equiseti菌絲均勻生長覆蓋整個(gè)平板，得到指示菌平板，用Φ6 mm的打孔器打孔菌餅備用。將Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物配制成100 mg/mL的水溶液，按1∶50的比例加入到50 ℃左右的PDA平板中，傾倒得實(shí)驗(yàn)平板。利用菌絲生長速率法檢測胞外產(chǎn)物的抑菌活性：將指示菌菌餅置于實(shí)驗(yàn)平板中央，以正常PDA平板上指示菌菌餅的生長情況作為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后觀察菌落大小，同時(shí)，對Talaromycessp.DYM25原始發(fā)酵液進(jìn)行相同的抑菌實(shí)驗(yàn)，以作比較。每個(gè)處理3次重復(fù)，計(jì)算相對抑制率(I，%)：

I=[(A-B)/(A-C)]×100

(1)

式(1)中：A為對照菌落直徑(mm)，即正常PDA平板上指示菌菌餅的生長直徑；B為實(shí)驗(yàn)菌落直徑(mm)，即包含DYM25原始發(fā)酵液的PDA平板上指示菌菌餅的生長直徑；C為指示菌菌餅原始打孔直徑(mm)。

為進(jìn)一步增強(qiáng)抑菌活性檢測結(jié)果的可信度，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測原始發(fā)酵液和胞外產(chǎn)物的抑菌活性：將上述得到的指示菌平板用Φ6 mm的打孔器打孔，分別取50 μL處理好的發(fā)酵培養(yǎng)9 d的Talaromycessp.DYM25澄清發(fā)酵液、100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液、正丁醇溶液和萃余相加入到指示菌平板孔內(nèi)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。

1.6 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的體外抗氧化活性檢測

將Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物配置成濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的水溶液。

1.6.1 總還原力的測定 取1.0 mL不同濃度的樣品，加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL 1 %的鐵氰化鉀，50 ℃水浴2 min，冷卻后加入1 mL 10 %的三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.5 mL 0.1 %的三氯化鐵溶液和2.0 mL的水，靜置5 min后在紫外分光光度計(jì)下測量700 nm的波長，以純水調(diào)零。

1.6.2 DPPH自由基清除率的測定 取1 mL不同濃度的樣品，加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液和2.0 mL的去離子水，反應(yīng)20 min后測定其在517 nm處的吸光值A(chǔ)1；樣品對照組用2.0 mL的無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光值A(chǔ)2；空白組為3.0 mL去離子水和2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，測定吸光值A(chǔ)0，以純水調(diào)零。清除率(C1，%)計(jì)算公式如下：

C1= [1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

1.6.3 羥自由基清除率的測定 取1.0 mL不同濃度的樣品，加入1.0 mL 9 mmol/L 的FeSO4溶液、1.0 mL 9 mmol/L的乙醇-水楊酸溶液和1.0 mL 8.8 mmol/L 的H2O2溶液，最后加水補(bǔ)齊至15.0 mL，充分混勻，于37 ℃反應(yīng)15 min，在510 nm處測定其吸光值A(chǔ)3；樣品對照組用1.0 mL去離子水替代H2O2溶液，測定吸光值A(chǔ)4；空白組用1.0 mL去離子水代替樣品溶液，測定吸光值A(chǔ)5，以乙醇-水楊酸溶液調(diào)零。清除率(C2，%)計(jì)算公式如下：

C2=(A5+A4-A3)/A5×100

(3)

1.6.4 超氧陰離子清除率的測定 取1.0 mL不同濃度的樣品，加入3.0 mL 50 mmol/L的Tris-HCl (pH為8.2)溶液，25 ℃反應(yīng)10 min后加入0.3 mL 5 mmol/L的鄰苯三酚溶液(溶劑為10 mmol/L的HCl)，反應(yīng)4 min后用0.5 mL的濃鹽酸溶液終止反應(yīng)，在320 nm處測定其吸光值A(chǔ)6；樣品對照組用0.3 mL 10mmol/L 的HCl代替鄰苯三酚溶液，測定吸光值A(chǔ)7；空白組用1.0 mL 10 mmol/L 的HCl代替樣品溶液，測定吸光值A(chǔ)8，以10 mmol/L的HCl調(diào)零，清除率(C3，%)計(jì)算公如下：

C3=[1-(A6-A7)/A8]×100

(4)

1.7 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的抗腫瘤活性檢測

CCK-8試劑法是一種簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖分析方法，本實(shí)驗(yàn)采用此法，觀察Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物對人AGS、HepG2以及PANC-1腫瘤細(xì)胞系增殖的影響。用含有10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基(HepG2以及PANC-1細(xì)胞系)或1640培養(yǎng)基(AGS細(xì)胞系)制備細(xì)胞懸液，96孔板以每孔接種100.0 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行鋪板操作，接種細(xì)胞密度約為5×104cells/mL，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，設(shè)置正常對照組和樣品(含陽性對照)組，分別按以下方式加樣：正常對照組每孔加完全培養(yǎng)基100.0 μL；陽性對照組每孔加含有0.1 μL 1 mmol/L多柔比星的完全培養(yǎng)基100.0 μL(多柔比星的終濃度為1 μmol/L)；粗提物每孔加含有以完全培養(yǎng)基溶解的樣品100.0 μL，配制系列濃度7.8、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0、500.0以及1 000.0 μg/mL。另設(shè)空白對照組，每孔加不含細(xì)胞和樣品的完全培養(yǎng)基100.0 μL。加樣后，將96孔板于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出96孔板，每孔分別加10.0 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后，測定每孔在450 nm處的吸光值。每組各設(shè)6個(gè)重復(fù)，取各組平均A9值，按下式(5)計(jì)算各樣品對腫瘤細(xì)胞的抑制率(I2，%)：

I2= [1-(A9-A10)/

(A11-A10)]×100

(5)

式(5)中：樣品組吸光值記為A9，空白對照組吸光值記為A10，正常對照組吸光值記為A11。

2 結(jié)果與討論

2.1 Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的提取

利用水飽和正丁醇對Talaromycessp.DYM25澄清發(fā)酵液進(jìn)行萃取，顏色呈棕褐色，證明發(fā)酵液中大量物質(zhì)被萃取到了正丁醇相中，每1 L發(fā)酵液經(jīng)萃取旋蒸后可得到約2 g的胞外產(chǎn)物，產(chǎn)物呈深棕色浸膏狀，質(zhì)地較硬。

2.2 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的檢測結(jié)果

Talaromyces產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物包含了生物堿、肽、酯和聚酮化合物等[1]，本研究中Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物可通過正丁醇萃取得到，而正丁醇相萃取物中多含皂苷類化合物及生物堿，同時(shí)，經(jīng)檢測菌株DYM25發(fā)酵液pH值為8.89，由此推斷，菌株DYM25的胞外產(chǎn)物中可能包含生物堿類化合物，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推斷，我們利用生物堿沉淀顯色反應(yīng)對胞外產(chǎn)物進(jìn)行了檢測：100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液呈棕色，生物堿沉淀顯色反應(yīng)結(jié)果如圖1所示，生物堿純度越高，顯色越明顯，100 mg/mL的胞外產(chǎn)物與磷鉬酸反應(yīng)產(chǎn)生棕黃色沉淀，與硅鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生灰綠色沉淀，與碘-碘化鉀反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色沉淀，其中與硅鎢酸試劑顯色反應(yīng)理論結(jié)果的差異應(yīng)該來自于樣品本身純度和顏色的影響，胞外產(chǎn)物水溶液呈棕色這一現(xiàn)象也說明了樣品中所含雜質(zhì)較多，因?yàn)槌Ｒ?guī)的生物堿應(yīng)是無色的。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)示著此胞外產(chǎn)物中極有可能存在生物堿鹽類物質(zhì)，為后續(xù)物質(zhì)的分離提供了參考。

圖1 生物堿顯色反應(yīng)Fig.1 Alkaloid chromogenic reaction(A)、(B)和(C)分別為100 mg/mL抑菌粗提物與磷鉬酸反應(yīng)產(chǎn)生棕黃色、與硅鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生灰綠色、與碘-碘化鉀反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色(右)，對照(左)，(D)圖為離心后產(chǎn)生的棕黃色(a)、灰綠色(b)和紅棕色(c)沉淀。

2.3 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的抑菌活性

菌絲生長速率法測定Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物對F.equiseti的抑制能力，菌落生長情況如圖2所示，F(xiàn).equiseti在正常的PDA平板上生長3～4 d后，菌絲基本覆蓋整個(gè)平板，而在含有100 mg/mL的Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物水溶液的PDA平板上生長明顯受阻，在28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d后菌落仍未呈現(xiàn)生長狀態(tài)；其相對抑制率計(jì)算結(jié)果如圖3所示，Talaromycessp.DYM25正丁醇相產(chǎn)物對F.equiseti的相對抑制率可達(dá)到100 %，而Talaromycessp.DYM25原始發(fā)酵液對F.equiseti的相對抑制率僅為69 %，說明Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物對F.equiseti的生長有較強(qiáng)的抑制作用，通過水飽和正丁醇對發(fā)酵液進(jìn)行萃取后所得的胞外產(chǎn)物得到了較強(qiáng)的濃縮，濃度為100 mg/mL的胞外產(chǎn)物所具有的抑菌活性就遠(yuǎn)大于原始發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性。

圖2 菌絲生長速率Fig.2 Mycelial growth rate(a)為正常PDA平板上生長的F. equiseti，(b)為含100 mg/mL的Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物水溶液的PDA平板上生長的F. equiseti。

圖3 胞外產(chǎn)物的相對抑菌率Fig.3 Relative inhibition rate of extracellular product“正丁醇”表示正丁醇相即Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的相對抑制率，“CK”表示Talaromyces sp.DYM25原始發(fā)酵液的相對抑制率。

瓊脂擴(kuò)散法檢測菌株DYM25發(fā)酵液和胞外產(chǎn)物的抑菌結(jié)果如圖4所示：首先，僅Talaromycessp.DYM25發(fā)酵液和100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液產(chǎn)生抑菌圈，且100 mg/mL胞外產(chǎn)物水溶液的抑菌圈明顯大于澄清發(fā)酵液所產(chǎn)生的抑菌圈，原因是菌株DYM25發(fā)酵液經(jīng)萃取旋蒸后，所得產(chǎn)物經(jīng)過了一定程度的濃縮，100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液所含的抑菌物質(zhì)濃度就遠(yuǎn)大于發(fā)酵液中本身含有的抑菌物質(zhì)濃度；其次，萃余相沒有抑菌效果，證明使用水飽和正丁醇溶液對Talaromycessp.DYM25澄清發(fā)酵液進(jìn)行3～4次的萃取之后能基本達(dá)到提取發(fā)酵液中大部分抑菌物質(zhì)的目的；最后，100 mg/mL的正丁醇溶液在實(shí)驗(yàn)中不產(chǎn)生抑菌圈，證明100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液所呈現(xiàn)出的抑菌效果來自萃取所得的物質(zhì)，排除了正丁醇溶液本身可能具有的干擾作用。

通過瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)，證明菌株DYM25產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物對黃瓜枯萎病致病菌F.equiseti有一定的抑制效果，有作為一株潛在生防菌的可能。關(guān)于Talaromyces作為生防菌的報(bào)道較少，Naraghi等(2010)等分離得到一株Talaromycesflavus可防控由Verticilliumalboatrum引起的黃瓜黃萎病[16]。Kazerooni等(2019)首次報(bào)道了Talaromycespinophilus可作為潛在的黃瓜猝倒病的生物防治劑[17]。Talaromycesvariabilis對由Pythium引起的黃瓜和西紅柿的猝倒病有很好的防治作用[18]。本研究中的Talaromycessp.DYM25是一株對F.equiseti有抑菌作用的真菌菌株，F(xiàn).equiseti是黃瓜枯萎病的致病菌。從2014年開始，我國研究者就陸續(xù)發(fā)現(xiàn)F.equiseti會(huì)引起根腐病，從而導(dǎo)致植株的枯萎死亡[19-21]，因此，菌株DYM25有希望能夠防治由F.equiseti引起的黃瓜枯萎病，是首次發(fā)現(xiàn)Talaromyces具有抑制F.equiseti生長的作用。

圖4 瓊脂擴(kuò)散法檢測結(jié)果Fig.4 Result of agar plate diffusion assay“sample 1、sample 2、sample 3和sample 4”分別為Talaromyces sp.DYM25發(fā)酵液、萃余相、100 mg/mL的胞外產(chǎn)物水溶液和100 mg/mL的正丁醇溶液。

2.4 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的體外抗氧化活性

抗氧化劑通過自身的還原作用，給出電子而清除自由基。測定物質(zhì)在700 nm處的吸光度，可以間接反應(yīng)物質(zhì)的還原能力，吸光度越大，還原力越強(qiáng)，抗氧化性就越強(qiáng)，因此，通過測定胞外產(chǎn)物的總還原力來評價(jià)其抗氧化力。Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在700 nm處的吸光值隨著濃度的升高而增加，證明Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物的抗氧化能力呈現(xiàn)出濃度依賴性，濃度越高，抗氧化力越強(qiáng)；對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，在4 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)到90 %以上；對超氧陰離子有一定的清除能力，在5 mg/mL清除率為25 %；對羥自由基的清除能力較弱，在5 mg/mL清除率為15 %；因此，初步判斷Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。近年來，關(guān)于Talaromyces抗氧化活性的報(bào)道逐漸增多，Li等(2017)報(bào)道了TalaromycesislandicusEN-501的氫蒽醌類化合物具有抗氧化活性[10]。李哲等(2020)發(fā)現(xiàn)了一株能產(chǎn)次紅色素的Talaromycesatroroseus具有抗氧化活性[22]，本研究研究得到Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物也具有一定的抗氧化活性，這一結(jié)果有助于我們了解Talaromyces內(nèi)菌株所具有的抗氧化能力。

圖5 Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of the extracellular product by Talaromyces sp.DYM25

2.5 Talaromyces sp. DYM25胞外產(chǎn)物的抗腫瘤活性

用CCK-8試劑法檢測Talaromycessp.DYM25胞外產(chǎn)物對3株腫瘤細(xì)胞增殖的影響，當(dāng)菌株DYM25胞外產(chǎn)物濃度為1 000.0 μg/mL時(shí)，對PANC-1有極顯著的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性(圖6)，但對AGS和HepG2細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響。因此，就本研究所選擇的3株腫瘤細(xì)胞而言，Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物能抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探索該產(chǎn)物對胰腺癌細(xì)胞PANC-1的抑制機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，目前的研究中，生物堿鹽類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)制主要包括直接殺傷作用、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等[23]，后續(xù)研究我們可采用流式細(xì)胞術(shù)等多種方法來檢測該胞外產(chǎn)物對胰腺癌細(xì)胞PANC-1的主要抑制機(jī)制；同時(shí)，本研究也讓我們對菌株DYM25胞外產(chǎn)物的生物學(xué)活性有了更深層次的了解，一定程度上揭示了自然界中尤其是Talaromyces屬內(nèi)存在著具有多種生物活性的菌株，后續(xù)研究中，我們?nèi)粢苑蛛x純化過的Talaromycessp.DYM25的次級代謝產(chǎn)物作為研究抗腫瘤活性的對象且拓寬腫瘤細(xì)胞的篩選范圍，或許能夠得到較為理想的結(jié)果[24-25]。

圖6 Talaromyces sp.DYM25胞外產(chǎn)物的抗腫瘤活性Fig.6 Antitumor activity of the extracellular product by Talaromyces sp.DYM25圖中為粗提物對胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)的抑制率，橫坐標(biāo)為所加物質(zhì)濃度(μg/mL)：1為正常對照組、2為陽性對照組、3為7.8、4為15.6、5為31.3、6為62.5、7為125.0、8為250.0、9為500.0、10為1 000.0。

3 結(jié)論

本研究以Talaromycessp.DYM25作為實(shí)驗(yàn)菌株，使用水飽和正丁醇對菌株發(fā)酵液進(jìn)行萃取，旋蒸后得到的棕色狀浸膏，即Talaromycessp.DYM25的胞外產(chǎn)物；菌株DYM25的胞外產(chǎn)物極性較大，利用生物堿沉淀顯色反應(yīng)預(yù)試了其中生物堿鹽的存在，為后續(xù)胞外產(chǎn)物的分離純化奠定了基礎(chǔ)；通過對菌株DYM25胞外產(chǎn)物的抗菌、抗氧化和抗腫瘤等生物學(xué)活性的研究，結(jié)果表明菌株DYM25的胞外產(chǎn)物對黃瓜枯萎病致病菌F.equiseti的生長具有很好的抑制作用，這是首次發(fā)現(xiàn)Talaromyces具有抑制F.equiseti生長的能力，這一拮抗性能有望應(yīng)用到由F.equiseti引起的黃瓜枯萎病病害的防治中；同時(shí)，菌株DYM25胞外產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，還對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的生長具有一定的抑制作用，這一結(jié)果表明了Talaromycessp.DYM25是一株生物功效廣泛的真菌菌株，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景，也揭示了海洋源真菌天然產(chǎn)物生物活性的良好研究價(jià)值。