基于神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)探討健脾補(bǔ)土方抗大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞失巢凋亡機(jī)制

劉祎，劉旺華，3?，李花，彭智遠(yuǎn)

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖南 長沙 410208；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長沙 410208）

腦卒中是人類心腦血管疾病中最嚴(yán)重的疾病之一，其防治是全球性的難題，通過醫(yī)學(xué)干預(yù)恢復(fù)缺血、缺氧后腦組織血液再充氧是其主要治療方式。中國全部卒中事件中缺血性卒中約占所有腦卒中患者的85%［1］。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是一種較嚴(yán)重的病理損傷過程，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡等病理機(jī)制，是缺血性腦卒中損傷加重的主要原因之一［2］。凋亡存在于各類疾病病理過程中，細(xì)胞凋亡是主動的程序性死亡，當(dāng)腦缺血再灌注損傷后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要途徑之一［3］。細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）如纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和層粘連蛋白（laminin，LN）等，是細(xì)胞和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者，對細(xì)胞外平衡的維持較為重要，ECM 環(huán)境中基質(zhì)成分及細(xì)胞黏附受體相互結(jié)合，為細(xì)胞、組織和器官，甚至整個機(jī)體提供支撐作用［4］。當(dāng)細(xì)胞脫離ECM環(huán)境，或ECM 受到損傷，細(xì)胞會經(jīng)歷一種特殊類型的程序性死亡，稱為失巢凋亡［5］。神經(jīng)ECM 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在生理情況下，ECM 的產(chǎn)生和降解能夠維持機(jī)體的動態(tài)平衡，為神經(jīng)細(xì)胞提供支持環(huán)境；腦缺血發(fā)生時，平衡狀態(tài)被打破，神經(jīng)細(xì)胞失去支撐，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6］。因此，神經(jīng)ECM 是神經(jīng)元生存的細(xì)胞外環(huán)境和載體，起到承載、營養(yǎng)、保護(hù)并促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長的作用，且有利于促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。神經(jīng)ECM 對神經(jīng)元的作用與中醫(yī)學(xué)“脾屬土，土主承載”功能相似［6］。基于此，本研究擬從“脾”論治，探討以四君子湯為基本方的健脾補(bǔ)土方對腦缺血再灌注后神經(jīng)ECM 的保護(hù)作用及抗神經(jīng)細(xì)胞失巢凋亡中的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物

SPF級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（250±10）g，購于湖南斯萊克景達(dá)有限公司，湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘SPF級實(shí)驗室飼養(yǎng)，溫度（23±2）℃，相對濕度（45±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后，對體質(zhì)量達(dá)（290±10）g的大鼠予以造模。本實(shí)驗已獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗倫理委員會批準(zhǔn)，動物試驗許可證號：SYXK（湘）2013-0005，動物合格證號：43004700018445。

1.2 藥物及制備

健脾補(bǔ)土方組成：人參片15 g，白術(shù)12 g，茯苓10 g，黃芪15 g，山藥12 g，薏苡仁12 g 和炙甘草6 g，所需中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)黃小平教授鑒定，符合2015 版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。所有藥材用純水浸泡30 min，首次煎煮用6 倍量水，煎煮40 min，過濾藥液，然后加4 倍量水再次煎煮40 min 后過濾藥液，兩次煎煮濾液混合濃縮成生藥含量為1 g/mL 的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

依達(dá)拉奉注射液（吉林博大公司，批號：80-140603，規(guī)格：10 mL/15 mg）。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗大鼠β-actin（批號：600008-1）；兔抗大鼠層粘連蛋白（LN）抗體（批號：A90082Ra01）；兔抗大鼠纖連蛋白（FN）抗體（批號：A90037Hu01）；兔抗大鼠B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（批號：YD8891）；兔抗大鼠Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（批號：3351）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號：E030120）；以上抗體均購于美國Proteintech公司。TUNEL試劑盒（上海魯汶生物，批號：S7100）；MCAO 栓線（北京西濃有限公司，批號：A4263450）。

AlphaEaseFC 灰度分析軟件（Adobe）；TGL-16c型離心機(jī)（上海安亭）；TYXH-Ⅱ渦旋混合器（天悅電子）；V300掃描儀（EPSON）。

2 方法

2.1 模型制備

應(yīng)用改良線栓法［7］制備大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠后，仰臥位固定，于頸正中切口，將左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈鈍性分離。夾閉頸總和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈并于其遠(yuǎn)心端剪一切口，將栓線緩慢向頸內(nèi)動脈推入，到達(dá)大腦中動脈19～20 mm，回縮約2 mm 后固定栓線。缺血2 h后緩慢拔出栓線。假手術(shù)組只鈍性分離血管，不做其他處理。

2.2 分組及給藥

120 只大鼠隨機(jī)分成6 個組，分別為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組以及健脾補(bǔ)土方低、中、高劑量組。剔除喂養(yǎng)期間意外死亡及造模后死亡大鼠，每組剩余16 只，各組大鼠造模成功24 h 后給藥。依達(dá)拉奉等效劑量為3.2 mg/kg；健脾補(bǔ)土方給藥劑量按成人與大鼠等效劑量［8］換算，低劑量為3.69 g/kg，中劑量為7.38 g/kg，高劑量為14.76 g/kg；假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水。各組于每日同一時間給藥，每日1次，共給藥7 d。

2.3 動物取材

給藥7 d后，10%水合氯醛麻醉大鼠，予心臟灌注，迅速斷頭取腦，將缺血側(cè)腦組織于4%多聚甲醛中固定24 h 以上，石蠟包埋組織，作厚度為6 μm 的冠狀切片，用于TUNEL 檢測和免疫組織化學(xué)染色；分離缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)放入凍存管，置于液氮速凍，用于Western blot和RT-PCR檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 神經(jīng)功能缺損評分

采用Zea-Longa 5 級4 分法［7］對造模24 h 后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。術(shù)后評分在1～3 分者為造模成功，可納入為研究對象，0 分和4 分者剔除。分?jǐn)?shù)越高，提示神經(jīng)功能損傷癥狀越嚴(yán)重。

2.4.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測FN、LN的表達(dá)

將切片進(jìn)行烤片→脫蠟→滴加3% H2O2→0.01%檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)→滴加兔抗大鼠FN（1∶100）、兔抗大鼠LN（1∶100），4 ℃孵育過夜。次日滴加增強(qiáng)液孵育20 min→37 ℃孵育二抗，30 min→DAB 染色→蘇木素復(fù)染→鹽酸乙醇分化→脫水→透明→封片。采用光學(xué)顯微鏡拍照（× 400），以光密度值（integral optical density，IOD）進(jìn)行表示。

2.4.3 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）參照TUNEL 試劑盒說明書，于光鏡下觀察切片，計數(shù)凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的陽性細(xì)胞計數(shù)用AI 表示，隨機(jī)取每張切片的5 個高倍視野，結(jié)果取平均值。

AI（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)×100%

2.4.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax的表達(dá)取各組大鼠海馬組織置于冰上操作，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，充分研磨，靜置裂解20 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液進(jìn)行BCA 定量。將處理后的蛋白樣品與Loading buffer按比例混勻，變性條件：95 ℃，10 min。取樣品總蛋白上樣量50 μg，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→兔抗大鼠Bcl-2（1∶2 000）、兔抗大鼠Bax（1∶6 000）4 ℃孵育過夜。二抗（1∶10 000，HRP 標(biāo)記）室溫孵育1 h，ECL 顯影，用BIO-RAD Gel Doc?XR + 成像系統(tǒng)觀察拍照，Image J軟件分析條帶灰度值。

2.4.5 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA取各組大鼠海馬組織，Trizol 法提取總RNA，酶標(biāo)儀測定RNA 濃度，參照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，繼而行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，10 min，循環(huán)條件：95 ℃，15 s→60 ℃，60 s（43 次循環(huán)），計算2-△△CT值。 引物序列為Caspase-3 上游：5' -GAAAGCCGAAACTCTTCATCAT-3' ，下游：5' -ATGCCATATCATCGTCAGTTCC-3'，長度93 bp；βactin 上游：5'-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3'，下游：5' -GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3' ，長度240 bp。均由谷歌生物公司合成。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性用LSD 法，不符合方差齊性采用Dunnet's T3 法檢驗，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Zea-Longa 評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，依達(dá)拉奉組和健脾補(bǔ)土方各劑量組Zea-Longa 評分均降低（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，分）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

神經(jīng)缺損評分0.00±0.00 2.32±0.32**1.67±0.28##1.84±0.47#1.69±0.28#1.50±0.46#組別假手術(shù)組模型組依達(dá)拉奉組健脾補(bǔ)土方低劑量組健脾補(bǔ)土方中劑量組健脾補(bǔ)土方高劑量組n 劑量16 16 16 16 16 16——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

3.2 各組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞AI比較

與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)細(xì)胞AI 明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，依達(dá)拉奉組及健脾補(bǔ)土方各劑量組神經(jīng)細(xì)胞AI 明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，%）

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組依達(dá)拉奉組健脾補(bǔ)土方低劑量組健脾補(bǔ)土方中劑量組健脾補(bǔ)土方高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)4.64±1.15 52.83±5.59**24.69±4.51#29.30±5.41#23.51±3.52#22.30±3.12#n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

圖1 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（TUNEL法，×400）

3.3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)FN、LN 表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組FN、LN 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，依達(dá)拉奉組和健脾補(bǔ)土方各劑量組FN、LN 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖2、圖3。

表3 各組大鼠FN、LN蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠FN、LN蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

劑量——組別假手術(shù)組模型組依達(dá)拉奉組8健脾補(bǔ)土方低劑量組健脾補(bǔ)土方中劑量組健脾補(bǔ)土方高劑量組LN（IOD值）38.93± 3.04 13.22±2.90**23.68±3.52##19.85±5.61##24.72±4.62##26.65±2.88##n88888 3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg FN（IOD值）35.56±1.48 9.59±2.03**21.17±4.88#19.57±4.22#22.40±3.19#23.32±5.45#

圖2 各組大鼠FN蛋白表達(dá)比較（免疫組化法，×400）

圖3 各組大鼠LN蛋白表達(dá)比較（免疫組化法，×400）

3.4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組Bal-2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），模型組Bax 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，依達(dá)拉奉組和健脾補(bǔ)土方各劑量組Bal-2 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值顯著升高（P＜0.01）。見圖4、表4。

圖4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組依達(dá)拉奉組健脾補(bǔ)土方低劑量組健脾補(bǔ)土方中劑量組健脾補(bǔ)土方高劑量組Bcl-2/Bax 2.36±0.30 0.26±0.06**0.94±0.09##0.75±0.05##0.96±0.02##1.08±0.05##n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg Bcl-2/β-actin 0.73±0.13 0.19±0.10**0.48±0.09#0.44±0.11##0.49±0.10##0.53±0.07##Bax/β-actin 0.31±0.10 0.72±0.09**0.51±0.13#0.59±0.01#0.51±0.12##0.48±0.08##

3.5 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)Caspase-3 mRNA比較

與假手術(shù)組相比，模型組Caspase-3 mRNA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依達(dá)拉奉組和健脾補(bǔ)土方各劑量組Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠Caspase-3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠Caspase-3 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組依達(dá)拉奉組健脾補(bǔ)土方低劑量組健脾補(bǔ)土方中劑量組健脾補(bǔ)土方高劑量組Caspase-3 mRNA（2-△△CT值）0.20±0.06 0.73±0.11**0.50±0.07#0.61±0.08#0.47±0.13#0.44±0.08#n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

4 討論

缺血性卒中是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，易破壞血腦屏障，造成嚴(yán)重的腦損傷并引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡［9］，CIRI是缺血性腦卒中后血流恢復(fù)灌注，腦內(nèi)代謝失償，進(jìn)而導(dǎo)致缺血性腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞加重?fù)p傷的主要原因之一。故深入研究腦缺血再灌注的病理機(jī)制，尋找促進(jìn)神經(jīng)元保護(hù)和腦功能恢復(fù)作用的藥物對治療缺血性腦卒中具有重要意義。

腦缺血再灌注損傷后，ECM 降解，黏附分子損傷，神經(jīng)細(xì)胞脫離ECM，不能維持機(jī)體動態(tài)平衡從而發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞失巢凋亡。FN 和LN 是組成ECM 中非膠原糖蛋白的重要部分，在各種神經(jīng)元中介導(dǎo)細(xì)胞黏附，介導(dǎo)軸突沿機(jī)制橋生長，使神經(jīng)纖維定向生長，并能保持血腦屏障的完整性［6，10］。Caspase-3 是目前公認(rèn)的凋亡關(guān)鍵蛋白酶和細(xì)胞凋亡過程中的終末執(zhí)行酶，是細(xì)胞凋亡的最終共同途徑［11］。Bcl-2是在細(xì)胞凋亡的早期環(huán)節(jié)通過控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制細(xì)胞凋亡。Bax可增強(qiáng)線粒體通透性，釋放線粒體中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1 激活Caspase，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。LI 等［13］發(fā)現(xiàn)舒血寧注射液可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 比值，阻斷Caspase-3的激活，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，可有效改善缺血性中風(fēng)后的腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)ECM 相關(guān)分子與凋亡蛋白關(guān)系密切。韋德英等［14］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N 可提高Bcl-2/Bax 的比值，減少Caspase-3 的表達(dá)水平。葛風(fēng)等［15］研究發(fā)現(xiàn)，通過Caspase-3 基因可顯著促進(jìn)LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

根據(jù)取類比象法，脾屬土，“土主承載”，神經(jīng)ECM為神經(jīng)細(xì)胞提供力學(xué)支持和物質(zhì)強(qiáng)度［5］，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞之間的黏附作用，保持神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的完整性，故本研究采用健脾補(bǔ)土方，以四君子湯為基礎(chǔ)，添加山藥、薏苡仁和黃芪［16］，顯著增加健脾補(bǔ)土益氣功效，這是本方通過調(diào)節(jié)神經(jīng)ECM抗腦缺血再灌注損神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可顯著上調(diào)腦缺血再灌注后p-ERK1/2 和p-Akt 的蛋白含量，增加Bax的表達(dá)，加強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞與ECM的黏附程度，抑制凋亡［17］；加味四君子湯可通過穩(wěn)定神經(jīng)ECM 纖維蛋白-5（Fibulin-5）的表達(dá)，顯著促進(jìn)ECM與細(xì)胞之間的黏附作用，從而有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞［18］；健脾補(bǔ)土方可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達(dá)，減少LN 降解［19-20］；下調(diào)組織型纖溶酶原激活物（t-PA）的可抑制纖溶系統(tǒng)活性，促進(jìn)人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）、整合素相關(guān)激酶（ILK）、整合素β3和局部黏著斑激酶（FAK）的蛋白表達(dá)，減少ECM降解，從而改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞損傷［16，21］。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦缺血再灌注后，大鼠神經(jīng)功能受損，神經(jīng)ECM降解，繼而發(fā)生失巢凋亡。健脾補(bǔ)土方的干預(yù)可顯著改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)，上調(diào)神經(jīng)ECM中FN、LN的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞間的黏附作用，增加Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對損傷因子的抵抗性，從而降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達(dá)，抑制凋亡。

綜上，健脾補(bǔ)土方可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)ECM，減少FN、LN 的丟失，增加ECM 的黏附，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減輕CIRI 模型大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，對抗腦缺血損傷。