臨床分離CRKP耐藥和毒力基因檢測及分子進化分析

陳祖陽，徐令清，何倩君

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院/清遠市人民醫(yī)院 1. 檢驗醫(yī)學部/輸血科； 2. 檢驗醫(yī)學部/檢驗科，廣東 清遠 511500)

肺炎克雷伯菌是一種常見的條件致病菌，容易引起醫(yī)院感染，可導致呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、創(chuàng)口及血流感染等。碳青霉烯類抗生素抗菌活性強，抗菌譜廣，對宿主毒性小，對頭孢菌素酶(AmpC酶)和超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)作用效果良好，在臨床上越來越廣泛的用于治療重癥感染患者。但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，耐碳青霉烯類細菌檢出率不斷增加，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的檢出率也在不斷增加，多個國家和地區(qū)出現(xiàn)散發(fā)和(或)流行病例[1-2]。高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumonia,hvKP)常表現(xiàn)為高侵襲性，預后差，病死率高的特點，hvKP最早在東南亞發(fā)現(xiàn)，但全世界范圍內報道病例越來越多，包括歐洲和美國，中國是hvKP感染的高發(fā)地區(qū)[3]。近年來耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)感染的研究報道越來越多，由于其廣泛耐藥，導致感染治療缺乏可選擇藥物。研究[4-5]表明，CR-hvKP容易在醫(yī)院環(huán)境中傳播，研究臨床CR-hvKP十分重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集某院2020年3月—2021年3月臨床各科室分離的CRKP共36株，菌株入選標準：(1)CRKP，至少對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南、厄他培南)3個藥物中的一個藥物耐藥[亞胺培南、美羅培南最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL，厄他培南MIC≥2 μg/mL]，參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)2020年版標準。(2)多次培養(yǎng)出CRKP，則納入首次培養(yǎng)信息。菌株于滅菌脫脂牛奶-80℃中保存。36株標本中以呼吸道標本為主，其中痰標本25株(69.44%)，尿標本5株(13.89%)，血標本5株(13.89%)，腹腔引流液1株(2.78%)。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2 儀器與試劑 BD phoenix M50(美國BD)全自動細菌鑒定儀及其配套鑒定藥敏卡，哥倫比亞血瓊脂平板(安圖)，M-H瓊脂平板(江門凱林)，S1000TMPCR擴增儀(美國BIO-RAD)，Power PacTMBasic電泳儀(美國BIO-RAD)，Gel DoxTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)，高速離心機(賽默飛)，CO2培養(yǎng)箱(日本松下)，布魯克質譜儀。試劑選用天根科技有限公司(TIANGEN)生產的Taq PCR MasterMix及GelRed核酸染料，北京博邁德基因技術有限公司DNA Marker II成品，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 黏液拉絲試驗與藥物敏感試驗 菌株復蘇后，分區(qū)劃線接種于血平板，培養(yǎng)18～24 h，質譜儀重新鑒定菌種。用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，重復3次；拉絲長度≥5 mm為拉絲試驗陽性，即為高黏液型肺炎克雷伯菌(HMKP)。采用BD phoenix M50全自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株進行藥物敏感試驗，藥敏結果判斷參照2020版CLSI標準進行。

1.3.2 細菌DNA提取 95℃金屬浴15 min，12 000 r/min離心5 min，提取核酸，取適量上清液(DNA提取產物)于滅菌的1.5 mL EP管中；使用核酸蛋白檢測儀檢測DNA的濃度和純度，OD260/OD280比值應為1.7～1.9，濃度調整為大約50 ng/μL，合格后于-80℃冰箱保存。

1.3.3 耐藥基因、莢膜血清型及毒力基因檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增4種主要碳青霉烯酶耐藥基因，包括blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48，碳青霉烯酶耐藥基因引物序列見表1；擴增肺炎克雷伯菌常見莢膜血清型及毒力基因，包括莢膜多糖相關基因magA、rmpA2、wcaG，鐵載體相關基因aerobactin、iutA、iroN、ybtS、ycf。菌毛編碼相關基因mrkA、mrkD、fimA、fimH，毒力質粒Plvpk相關基因Plvpk、silS、terW，脂多糖表達相關基因uge。同時通過擴增wzi基因檢測肺炎克雷伯菌莢膜多糖血清型，確定待測菌株的wzi分型及莢膜血清型。引物序列參考相關文獻[6]，見表2。反應體系：總體積25 μL，Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 11 μL。所有PCR產物的純化與分析均由生工生物工程(廣州)股份有限公司完成，測序結果提交巴斯德網站https://bigsdb.pasteur.fr比對確定其基因型。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因引物序列及擴增產物大小Table 1 Primer sequences and size of amplified products of carbapenemase resistance gene

表2 肺炎克雷伯菌莢膜血清型及毒力基因引物序列及擴增產物大小Table 2 Primer sequences and amplified product size of Klebsiella pneumoniae capsular serotypes and virulence genes

續(xù)表2 (Table 2， Continued)

1.3.4 hvKP的判定 目前暫時沒有hvKP統(tǒng)一的判斷標準。參考相關文獻[7]，本研究將同時攜帶rmpA/rmpA2、aerobactin、iroN基因的菌株，判定為hvKP。

1.3.5 多位點序列分型(MLST) MLST引物序列和反應條件參照http://bigsdb.Pasteur.fr，再將測序結果提交MLST數據庫網站(http://bigsdb.Pasteur.fr)比對，獲得等位基因編碼，再將獲得的等位基因編碼按照gapA、infB、mdH、pgi、phoE、rpoB、tonB的順序組合，獲得相應的ST型。

1.3.6 wzi分型 將測序結果提交于MLST數據庫網站中(http://bigsdb.Pasteur.fr)比對獲得相應的血清型。

1.3.7 基于wzi構建分子進化樹 從NCBI下載浙江菌株KP18069(GCF_014123345.1)、安徽菌株11219(GCF_003285145.1)、北京菌株H11(GCF_002761515.1)、香港菌株GD4(GCF_002893825.1)基因組數據包，找到wzi基因CDS序列，連同32株CRKPwzi基因測序結果,應用MEGA 7.0軟件，經ClustalW全局對比后，構建Maximum-likelihood進化樹，模型采用Kimura2-Parame-ter model，Bootstrap值設為1 000，缺失值處理為partial deletion，cutoff：70%。

2 結果

2.1 患者基本情況 36株CRKP分離自危重醫(yī)學病科21株，腦科11株，呼吸內科3株，康復醫(yī)學科1株。患者基本情況：36例均有深靜脈置管、引流管、氣管插管或氣管切開操作，使用抗菌藥物≥3種26例，合并診斷肺部感染18例。1例上報醫(yī)院感染監(jiān)控系統(tǒng)疑似醫(yī)院感染，疑似程度86%，另有30例通過查閱醫(yī)院病歷系統(tǒng)和檢驗系統(tǒng)，呈不同程度懷疑醫(yī)院感染，醫(yī)院感染判斷標準參照WS/T 524—2016醫(yī)院感染暴發(fā)控制指南。

2.3 黏液絲試驗 36株CRKP黏液絲試驗均為陰性。

2.4 耐藥基因、莢膜血清型及毒力基因檢測結果 未檢出K1、K2、K5、K20、K57五種常見莢膜血清型。

圖1 36株CRKP藥敏結果矩陣圖Figure 1 Matrix of 36 strains of CRKP antimicrobial susceptibility results

wzi莢膜血清分型顯示，32株CRKP中31株為K14.K64型，1株為K24型。耐藥基因檢測結果顯示：36株CRKP均檢出blaKPC基因，PCR擴增產物電泳結果。見圖2。未檢出blaIMP、blaVIM、blaOXA-48基因。毒力基因檢測結果顯示：36株CRKP均攜帶rmpA2、wcaG、ybtS、aerobactin、iutA、iroN、ycf、mrkD、mrkA、silS、uge、Plvpk、fimH基因，TerW基因檢出率為86.11%，未檢出magA和fimA基因。36株CRKP均攜帶rmpA2、iroN和aerobactin基因，判定本研究中36株CRKP均為CR-hvKP。

2.5 MLST結果 36株CRKP均為ST11型。見圖3。

2.6wzi基因分子進化結果 32株CRKP中31株100%同源，1株與浙江菌株KP18069 99%同源，見圖4。

注：A為blakpc基因PCR擴增產物凝膠電泳結果；B為wzi基因PCR擴增產物凝膠電泳結果；M為DNA Marker；N為陰性對照。圖2 部分基因PCR擴增產物凝膠電泳結果Figure 2 Gel electrophoresis results of PCR amplification products of partial genes

圖3 CRKP管家基因PCR擴增產物凝膠電泳結果Figure 3 Gel electrophoresis results of PCR amplification products of housekeeping genes

圖4 CRKP wzi基因分子進化分析結果圖Figure 4 Evolutionary tree based on wzi gene sequencing results

3 討論

根據全國細菌耐藥監(jiān)測網2014—2019年細菌耐藥性監(jiān)測報告[8]結果顯示，肺炎克雷伯菌在革蘭陰性桿菌中檢出率為13.9%～14.4%，僅次于大腸埃希菌(20.1%～21.2%)。肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥率從4.8%升至10.5%。CRKP檢出率逐年上升，給抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)，控制CRKP醫(yī)院傳播，了解其耐藥機制已成為醫(yī)務人員及研究人員的關注焦點。本研究中CRKP對美羅培南、亞胺培南耐藥率均為97.22%，對其他臨床常見抗菌藥物也呈現(xiàn)高度耐藥。本研究中36例患者均有深靜脈置管、引流管、氣管插管或氣管切開操作，使用抗菌藥物≥3種26例，合并診斷肺部感染18例。長期入住重癥監(jiān)護病房(ICU)，病情危重，免疫力低下，執(zhí)行侵入性操作，抗菌藥物不合理使用都可能是CRKP感染的易感因素，與kiddee等[9]研究一致。本研究中痰標本占69.44%，表明CRKP可能主要定植于呼吸道，而患者頻繁地通過呼吸機輔助通氣時侵入呼吸道，造成進一步感染[10]。如果CRKP獲得了hvKP的毒力質粒，進化為CR-hvKP，在抵抗力低下患者中傳播流行，會導致病死率與治療成本增加[11]。

本研究中36株CRKP均攜帶rmpA2、iroN和aerobactin基因，判定本研究中36株CRKP均為CR-hvKP。36株CRKP均攜帶rmpA2、wcaG、ybtS、aerobactin、iutA、iroN、ycf、mrkD、mrkA、silS、uge、Plvpk、fimH基因；TerW基因檢出率為86.11%；均未檢出magA和fimA基因。rmpA基因是黏液性調節(jié)因子，能有效激活莢膜的產生，使菌株表現(xiàn)出較高的黏液性和更強的毒力性。本研究中黏液絲試驗均為陰性，但36株菌株均攜帶rmpA2基因。研究[12]表明，rmpA2與rmpA有80%的同一性，rmpA2通常位于毒力質粒中，rmpA/rmpA2基因可作為確定hvKP菌株的可靠生物學標志之一。magA基因編碼莢膜血清型KI特異性Wzy聚合酶，只存在于K1血清型的菌株中，攜帶magA基因的菌株具有黏性的胞外多糖網狀結構，可抗吞噬血清補體抵抗，導致進一步的侵襲性感染。本研究中36株均未攜帶magA基因，也未檢出K1莢膜血清型。研究[13]表明，wcaG基因是肺炎克雷伯菌菌血癥分離株生物膜形成的獨立危險因素，wcaG編碼的蛋白質參與了巖藻糖的生物合成，wcaG缺失突變會影響大部分莢膜多糖基因的表達，表明wcaG可能通過改變微生物多糖莢膜的組成促進肺炎克雷伯菌生物膜形成。36株菌株均攜帶rmpA2和wcaG基因，兩者之間是否共同促進激活莢膜多糖的合成，進而促進生物膜的形成，還需要進一步研究。

鐵的攝入對細菌的生長非常重要，F(xiàn)e3+生理條件下溶解度低，難以利用，且無法直接透過細胞膜主動轉運到細胞內，細菌需合成并分泌鐵載體攝取鐵來滿足生長需求。氣桿菌素、耶爾森菌素、沙門菌素、腸桿菌素是肺炎克雷伯菌中重要的四種鐵載體。研究[14]表明，氣桿菌素(aerobactin)是肺炎克雷伯菌主要的毒力決定因子，能顯著提高肺炎克雷伯菌在人腹腔積液、血清及小鼠全身和肺部感染中的存活率，僅表達氣桿菌素就能明顯提高肺炎克雷伯菌毒力。本研究36株菌株均攜帶鐵載體相關基因aerobactin、iutA、iroN、ybtS、ycf，進一步證明本研究中36株CRKP均為CR-hvKP。

黏附于宿主細胞表面是細菌感染宿主的關鍵一步。研究[15]表明，菌毛普遍存在于肺炎克雷伯菌，cKP與hvKP間分布并無明顯差異。肺炎克雷伯菌的黏附因子主要有Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，Ⅰ型菌毛由fimA和fimH基因編碼調控，fimA基因編碼的蛋白質構成主要亞基，F(xiàn)imH蛋白是位于菌毛尖端的黏附素，主要黏附表面含有甘露糖成分的物質，如泌尿生殖道上皮細胞，促進生物膜形成，導致難治性尿路感染；Ⅲ型菌毛由mrkABCDF操縱子編碼，主要由菌毛亞單位mrkA和小分子黏附素mrkD組成，mrkD促進kpn黏附不同類型的細胞，如氣管上皮細胞、腎小管上皮細胞等。mrkA主要黏附于非生物材料表面，啟動kpn在留置的導管上形成生物膜[16-17]。本研究中36例患者均有深靜脈置管、引流管、氣管插管或氣管切開病史，可能是CR-hvKP定植于呼吸機表面導致醫(yī)院傳播。uge基因促進脂多糖的表達，研究[18-19]表明，缺乏uge基因的肺炎克雷伯菌菌株毒性較低，并且不太可能引起尿路感染、肺炎或敗血癥，uge基因突變降低了肺炎克雷伯菌感染尿路的毒力。

結合質粒(p17ZR-91-Vir-KPC)是由非結合Plvpk樣質粒和結合blaKPC-2載體質粒融合而成，并與其他兩種非融合質粒動態(tài)存在。p17ZR-91-Vir-KPC與其他敏感型肺炎克雷伯菌結合，可以使敏感型肺炎克雷伯菌快速表達碳青霉烯類耐藥性和高毒力的表型[7]。毒力質?？梢詮暮衕vKP的結合型IncF質粒轉移到大腸埃希菌中。含有毒力和IncF質粒的大腸埃希菌轉導子，無論是否形成雜合質粒，都可以通過不同的方式將毒力質粒或雜合質粒進一步轉移到CRKP，將hvKP中的pLVPK樣非結合毒力質粒動員到CRKP和大腸埃希菌菌株中。抗菌藥物的不合理使用可能會促進編碼抗生素耐藥性的結合質粒的轉移和非結合毒力質粒的傳播，導致CR-hvKP的傳播[19-20]。

研究[21]表明，wzi基因檢測可高效檢測肺炎克雷伯菌的莢膜血清型。本研究成功測序32株CRKP的wzi基因，血清型分型K14.K64型31株，K24型1株?；趙zi基因測序結果構建分子進化樹，結果顯示臨床分離的CRKP高度同源，32株100%同源，表明存在醫(yī)院傳播；另外，1株與浙江報道菌株KP18069 99%同源，通過查看病例發(fā)現(xiàn)8337菌株分離患者為省外務工人員，不排除有輸入性傳播，應引起高度重視。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。