耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌分子流行病學特征及耐藥性

蘭 敏,趙志軍,康宇婷,王藝璇,李佳銘,劉春蘭,馬慧慧,賈 偉

(1. 寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院,寧夏 銀川 750004; 2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心,寧夏 銀川 750004; 3. 寧夏病原微生物重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

腸桿菌目細菌主要存在于人類腸道中，是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，可引起尿路感染、呼吸道感染和膿毒癥等多種疾病。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，腸桿菌目細菌耐藥率不斷上升，其中耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem-resistant Enterobacterales,CRE)的增加尤為明顯。CRE指對亞胺培南、美羅培南、多利培南(MIC≥4 μg/mL)或厄他培南(MIC≥2 μg/mL)等任何一種碳青霉烯類藥物耐藥的腸桿菌目細菌，以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主，這些細菌能夠產(chǎn)生不同種類的碳青霉烯酶，水解多種抗生素[1]。新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)自2008年在印度首次發(fā)現(xiàn)至今已產(chǎn)生33種變異體[2-4]。攜帶blaNDM基因的細菌被稱為“超級細菌”，其出現(xiàn)加大了臨床治療難度，引起公眾關(guān)注，給公共衛(wèi)生帶來極大隱患與威脅。

本研究調(diào)查寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院2018年1月—2021年5月臨床分離CRE的臨床分布、標本來源、耐藥率、耐藥基因及傳播情況等，并對分離獲得的大腸埃希菌耐藥性及同源性進行分析,為臨床患者的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2018年1月—2021年5月寧夏某醫(yī)院住院患者感染的CRE非重復菌株158株。

1.1.2 儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(HEAL FORCE)，梯度PCR儀(Eppendorf)，多色熒光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，生物安全柜(Telstar),高性能干溶器(QBD4-Grant)，藥敏紙片(OXOID)，Taq2 PCR Master Mix(Takara)，DNA marker(Takara)，電泳槽(BIO-RAD)，高壓水平電泳儀(BIO-RAD)，LB液體培養(yǎng)基(Solarbio)，MH瓊脂平板(babio)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)與鑒定 采用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定細菌并進行藥敏試驗，根據(jù)2020年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)M100第30版標準篩選對亞胺培南或美羅培南耐藥的腸桿菌目細菌。

1.2.2 耐藥基因檢測 水煮法制備細菌DNA，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因(blaSHV和blaTEM)和碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaOXA-48、blaNDM、blaIMP)。

PCR反應(yīng)條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s(30個循環(huán))；72℃再延伸5 min。引物序列與退火溫度見表1。

其中，NDM基因的PCR陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，NCBI比對分析確認NDM基因亞型。

1.2.3 碳青霉烯酶表型檢測 根據(jù)CLSI 2020年M100第30版標準中改良碳青霉烯滅活試驗操作流程，對耐碳青霉烯類大腸埃希菌進行改良碳青霉烯滅活試驗(modified carbapenem inactivation method, mCIM)聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(EDTA-modified carbapenem inactivation me-thod，eCIM)。

1.2.4 質(zhì)粒接合試驗 參考文獻[5-6]的方法并對部分步驟改良：將大腸埃希菌J53AZR(受體菌)和產(chǎn)NDM酶的耐碳青霉烯類大腸埃希菌(供體菌)分別接種于MH瓊脂平板，活化好菌株后振搖培養(yǎng)至一定濃度，之后將受、供體菌按4∶1的比例混合于LB液體培養(yǎng)基中，37℃靜置過夜。16 h后取100 μL均勻涂布于含2 μg/mL美羅培南和100 mg/L疊氮鈉的MH平板，CO2孵箱過夜，細菌生長即為接合試驗成功。

表1 耐藥基因引物序列、退火溫度及擴增產(chǎn)物片段大小Table 1 Primer sequences, annealing temperature, and size of amplified products of drug resistance genes

1.2.5 多位點序列分型(MLST) 依據(jù)MLST網(wǎng)站提供的引物序列擴增耐碳青霉烯類大腸埃希菌的7對管家基因(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)，擴增產(chǎn)物送華大測序，在MLST網(wǎng)站上比對結(jié)果，獲得細菌相應(yīng)的ST型，使用BioNumerics 8.0軟件對耐碳青霉烯類大腸埃希菌進行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的科室分布與標本類型 共收集158株CRE，主要分離自ICU(36株，22.78%)，其次是燒傷整形科(30株，18.99%)，新生兒科(18株，11.39%)，肝膽外科(18株，11.39%)，急診科(10株，6.33%)，血液科(5株，3.16%)和其余21個科室(共41株，25.95%)。

菌株的標本類型主要為痰(43株，27.22%)、膿性分泌物(28株，17.72%)、引流液(21株，13.29%)、無菌中段尿(17株，10.76%)和靜脈血(16株，10.13%)，其余11種標本共33株(20.89%)。

2.2 菌種檢出情況 158株CRE主要為肺炎克雷伯菌61株(38.61%)，其次是陰溝腸桿菌37株(23.42%)，大腸埃希菌23株(14.56%),摩氏摩根菌10株(6.33%)，奇異變形桿菌和黏質(zhì)沙雷菌各9株(5.69%)，其他CRE共9株(5.69%)。

2.3 CRE藥敏情況 CRE對9種抗菌藥物的耐藥率≥50%，對亞胺培南耐藥率達100%，對美羅培南耐藥率達73.13%(98/134)。見表2。

表2 CRE對抗菌藥物耐藥率Table 2 Antimicrobial resistance of CRE

2.4 耐藥基因檢測和NDM基因分型 158株CRE中4種碳青霉烯酶基因blaNDM、blaOXA-48、blaKPC和blaIMP的檢出率分別為78.48%、32.28%、8.23%、5.69%。攜帶blaNDM基因的菌株中，攜帶blaNDM-1、blaNDM-5和blaNDM-9基因的菌株分別為30、92、2株。51.90%的菌株攜帶ESBLs基因。同時攜帶blaNDM基因和其他耐藥基因的菌株共77株，其中29株同時攜帶2種耐藥基因，29株同時攜帶3種耐藥基因，11株同時攜帶4種耐藥基因，8株同時攜帶5種耐藥基因。見表3。

2.5 mCIM聯(lián)合eCIM試驗檢測碳青霉烯酶表型 23株耐碳青霉烯類大腸埃希菌中22株(95.65%)產(chǎn)金屬酶，1株(4.35%)碳青霉烯酶陰性。

2.6blaNDM水平轉(zhuǎn)移情況 質(zhì)粒接合試驗顯示，20株產(chǎn)NDM金屬酶大腸埃希菌中共15株菌質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移，接合子經(jīng)質(zhì)譜鑒定為大腸埃希菌，采用PCR檢測接合子blaNDM基因。K-B法藥敏試驗表明接合子對亞胺培南、美羅培南和頭孢吡肟等具有耐藥性。

2.7 大腸埃希菌MLST結(jié)果 將管家基因測序結(jié)果提交至MLST數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示23株大腸埃希菌依據(jù)MLST分析共鑒定出14種ST分型，以ST10和ST410型為主，分別為5株(21.74%)、4株(17.39%)，其次為ST93(2株)和ST95(2株)，ST90、ST162、ST167、ST209、ST648、ST693、ST848、ST2705、ST6050和ST12686各檢出1株。聚類分析見圖1，最小生成樹見圖2。

表3 158株CRE耐藥基因檢出情況Table 3 Detection result of drug resistance genes of 158 CRE strains

注：ur為尿，bl為靜脈血，se為膿性分泌物，bi為膽汁，su為引流液，sp為痰，as為膿液。圖1 23株大腸埃希菌MLST聚類分析圖Figure 1 MLST cluster analysis of 23 strains of Escherichia coli

圖2 23株大腸埃希菌最小聚類樹Figure 2 Minimum cluster tree of 23 strains of Escherichia coli

3 討論

CRE因感染治療難度大、病死率高、傳播快和數(shù)量多等因素備受關(guān)注，其耐藥問題已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)之一[7]。過去十年中，CRE已成為導致醫(yī)院感染，尤其是ICU感染，最常見的病原體之一[8]。本研究顯示，ICU和燒傷整形美容科患者是醫(yī)院CRE感染的高危人群，長期住院、大量廣譜抗菌藥物的使用都可能是導致ICU患者CRE感染的主要原因。在本研究中，2018—2021年5月每年分別檢出CRE 45株(28.48%)、15株(9.49%)、79株(50.00%)及19株(12.03%),其中肺炎克雷伯菌是主要病原體，第二、三位分別是陰溝腸桿菌和大腸埃希菌，三者占所有CRE分離株的76.58%(121/158)，與Zhang等[9]的結(jié)果一致。分離株標本來源以痰為主，其次為膿性分泌物與引流液。不同標本中檢出的CRE種類有所不同，痰標本中主要為肺炎克雷伯菌，而膿性分泌物和引流液則以大腸埃希菌為主。158株CRE對亞胺培南敏感率為0，對頭孢類抗生素耐藥率均超過80%。

在腸桿菌目細菌中許多類型的碳青霉烯酶和ESBLs已廣泛存在并傳播，對公眾健康造成極大威脅。CRE耐藥性主要歸因于產(chǎn)碳青霉烯酶，腸桿菌目中最常見的碳青霉烯酶基因有blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48等[10]。其中NDM金屬酶屬于B類β-內(nèi)酰胺酶，能水解除氨曲南以外的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素。自2008年首次分離并報道攜帶blaNDM的肺炎克雷伯菌以來，迄今為止已發(fā)現(xiàn)33種blaNDM基因變異體[4]，分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)其變異體中主要以NDM-1型金屬酶為主，近年來，研究[11-15]顯示，blaNDM-5在中國和印度等國家越來越常見。本研究中分離的158株CRE攜帶的碳青霉烯酶基因以blaNDM為主，其中blaNDM-5最多，blaNDM-1次之。研究結(jié)果表明，該院CRE中blaNDM基因的存在已非常普遍。除此之外，還首次在該地區(qū)檢出產(chǎn)NDM-9金屬酶的大腸埃希菌。2011年中國首次報道攜帶blaNDM-1的大腸埃希菌，隨后發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類大腸埃希菌中產(chǎn)NDM金屬酶的菌株分離率較高[16]。本研究中的23株耐碳青霉烯類大腸埃希菌，20株檢出blaNDM基因，分別為blaNDM-1、blaNDM-5和blaNDM-9。NDM-5金屬酶和NDM-9金屬酶在NDM-1金屬酶的基礎(chǔ)上分別通過第88位(纈氨酸→亮氨酸)和152位(甘氨酸→賴氨酸)氨基酸位點的突變，使其水解活性增強[2]?？赡苁怯捎谕蛔兊膯蝹€氨基酸會影響NDM蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),從而改變NDM與底物即β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合特性,進而表現(xiàn)出不同的水解能力[17]，但具體機制有待進一步研究。研究[2,18-19]表明，NDM-5酶和NDM-9酶對除氨曲南外的所有β-內(nèi)酰胺類藥物的酶活性均高于NDM-1酶，其對美羅培南、亞胺培南、頭孢西丁和頭孢噻肟的水解活性和親和力略增高。該院NDM酶亞型逐漸變化，還應(yīng)持續(xù)監(jiān)測其耐藥性變化，及時發(fā)現(xiàn)新亞型，防止某一亞型在CRE中傳播與暴發(fā)。

質(zhì)粒接合試驗結(jié)果顯示，三種類型的blaNDM基因均可通過質(zhì)粒進行水平轉(zhuǎn)移與傳播。研究[20]發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)blaNDM基因位于IncF、IncA/C、IncL/M、IncH、IncN和IncX3等20種不同類型的質(zhì)粒上，能隨著質(zhì)粒的自我復制在細菌間接合轉(zhuǎn)移，引起blaNDM基因快速而廣泛地傳播，產(chǎn)NDM酶的菌株愈發(fā)增多。在中國的幾個地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了由攜帶blaNDM基因細菌引起的感染流行，表明blaNDM基因的高度可轉(zhuǎn)移性和由blaNDM陽性微生物引起的感染嚴重性[21-23]。MLST結(jié)果表明，23株耐碳青霉烯類大腸埃希菌分別屬于14種STs，其中以ST410和ST10為主要流行菌株，提示該院耐碳青霉烯類大腸埃希菌的克隆多樣性。本研究中部分大腸埃希菌具有相同ST型，但其數(shù)量少，檢出時間跨度大，未存在檢出數(shù)顯著增加的情況。此外，還發(fā)現(xiàn)科室分布距離遠，標本類型不同，因此不滿足臨床感染流行的條件。但是醫(yī)院仍應(yīng)提高警惕，做好耐藥菌的檢測與監(jiān)測工作，重視感染問題，合理治療，避免造成更嚴重的后果。除ST209、ST693和ST12686外，多數(shù)大腸埃希菌攜帶blaNDM-5基因，僅ST95菌株攜帶blaBDN-9基因，1株ST10和ST848攜帶blaNDM-1基因，提示耐碳青霉烯類大腸埃希菌中NDM酶的多樣性。醫(yī)院應(yīng)做好預防與檢測工作，采取及時有效的措施，防止攜帶blaNDM基因的某一克隆株大肆流行。

CRE感染的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)不斷增加，攜帶blaNDM基因的細菌更是被稱為“超級細菌”，因此醫(yī)務(wù)人員應(yīng)積極做好手衛(wèi)生防止交叉感染，醫(yī)院應(yīng)加強感染防控措施的施行，嚴格執(zhí)行醫(yī)護人員與患者的衛(wèi)生措施，做好消毒及防護管理[24]。同時，應(yīng)對CRE和blaNDM基因進行監(jiān)測，并采取有效的感染防控措施，給感染患者提供適當有效的治療，以減緩各種CRE的流行和擴散。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。